分子檢測
運用 DNA 標誌鑑定鳳梨品種之技術 為建立 新品種指紋分析之分子標誌，達到正確且快速之品 種檢測，並維護植物品種智財權。本年度試驗材料 -鳳梨為國際性重要果樹，但在基因體研究資料卻遠 少於其他如香蕉和木瓜等熱帶果樹。本研究中藉由 NCBI 鳳梨基因庫資料，開發高訊息的微衛星分子 標 誌 ， 透 過 100 個 具 有 簡 單 序 列 重 複 (simple sequence repeat, SSR) 的核酸序列，設計取得 77 對 之候選引子，用以進行鳳梨9 個基因型 (含農試所 選育命名6 個栽培種) 之鑑別。SSR-PCR 分析結果 獲得8 對具有高度多型性引子，產生 23 個差異性 對偶基因，可用以區分9 個基因型，平均每基因座 產生3 個多型性對偶基因。本研究結果已取得具有 專一性且充足的4 個核心關鍵性微衛星標誌，可提 供鳳梨9 個基因型之鑑定 (表 3-13；圖 48)。另外 自 680 個 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 引子與 100 個 ISSR (inter- simple sequence repeat) 引子之 PCR 分析，也分別篩選獲得 51 個
RAPD 與 26 個 ISSR 高度多型性引子，可一併提供 鳳梨9 個基因型之鑑定。
運用RT-PCR 鑑定西瓜 Crinivirus 屬病害之技 術 在台灣，新興病毒的發現造成嚴重為害如瓜類 退綠黃化病毒病 (CCYV)，已是西瓜常見之病害。
本研究已建立快速檢測技術於鑑定瓜類 CCYV 引 起之病毒性病害。使用的技術包括 RT-PCR，及定 量核酸擴增等方法並發展克服假陽性的問題。除種 子的帶毒檢測外，另外使用寄主植物或指示植物作 病原之發病檢測、潛伏感染及病毒傳播與田間發病 生態追蹤系統。其他運用PCR 技術改進在健康種子 檢測上，包括病原之偵測與定量，並發展成新式的 分子檢測方法，減少耗費勞力與時間及具有污染毒 性的物質之方法等改進。對於整批的種子可能存在 致病病原，提供更便捷檢測方法。經由CCYV 專一 性引子及探針檢測技術，結果顯示在感染之西瓜、
洋香瓜及南瓜病組織中，可產生專一性條帶與螢光 訊號做判讀，在健康植物則無法測出且不與其他瓜 類病毒 (PRSV、CGMMV、ZYMV) 反應，顯示專 一性佳。與傳統 PCR 方法做比較，發現其靈敏度 較PCR 方法提高 1,000 倍 (圖 49 與表 3-14)。在應 用上，接種CCYV 於洋香瓜與南瓜上，利用本實驗 開發之反轉錄 核酸聚合酵素 連鎖反應方法 及快速 擴增法作檢測，結果在感染之植株等不同部位皆可 檢測CCYV 之 RNA。
運用PCR 與 ELISA 檢測基改馬鈴薯之技術 生 物科技的進步與快速發展，許多不同特性的基改作物 已被開發且已大規模商業化種植，而基改作物是否會 對生態環境造成危害也成為重要的議題。為避免基因 改造作物污染自然環境中野生近緣種或農作系統之 非基改作物，許多國家均積極開發兼具快速、靈敏的 檢測方法，以區分出基改及非基改作物。針對基改馬 鈴薯的葉片及塊莖，抽取樣本的基因體DNA 進行 PCR 檢測鎮 (圖 50、圖 51、圖 52)，目標包括內生性基因 序列、載體上特定基因序列 (NPT II)、及轉殖目標基 因序列。另外也開發出可同時檢測以上三種基因片段 之Multiplex PCR，檢出能力可達 3%。並利用免疫呈 色法 (ELISA) 進行基改馬鈴薯 NPT II 蛋白的檢測。
於定量的部分，本實驗室利用螢光探針標定品系專一 性片段之即時聚合酶鏈鎖反應，可有效得知樣本中是 否含有基改馬鈴薯及其含量。以上檢測方法可有效區 分基改及非基改馬鈴薯，並可應用於開發轉殖品系專 一性的定性及定量試驗。未來將利用全球定位系統標 定環境採樣位置，並應用地理環境資訊系統進行資料 整合。
表3-13 鳳梨 9 個基因型鑑別用 4 個核心 SSR 基因座及其增幅之 alleles 剖繪
Cultivar/ genotype
Specific alleles (bp) in the selected identification SSR locus
Ac4 Ac6 Ac7 Ac8 (AY149881-1) (EU563266-1) (EU563266-2) (EU700461-1) 台農13 號 (冬蜜、甘蔗鳳梨) 252 199 184, 201 272
台農17 號 (金鑚、春蜜鳳梨) 252 199 184, 201 300 台農19 號 (蜜寶鳳梨) 252 199 191 272, 300 台農20 號＊(牛奶鳳梨) 209 199, 213 191, 208 272, 300 台農21 號 (青龍、黃金鳳梨) 252 199 191, 208 300 C64-4-117 (TN21 母本) 252 199 184, 208 300 2 號系 (正常開英種) 209 199 184, 201 272, 300 台農4 號 (剝皮、釋迦鳳梨) 252 199 191, 208 272, 300
Rough 229, 252, 267 199 191, 208 300
圖48 鳳梨 9 個基因型利用 4 個核心 SSR loci 分析之電泳圖譜。
圖49 使用發展之定量 PCR 法檢測 CCYV，顯示此反應條件與反應關係佳。
表3-14 使用定量 PCR 法與一般 PCR 法比較檢測 CCYV 之靈敏度 Dilution series a
One step RT-PCR One step qRT-PCR
ng Copy number Ct CV
10 9.9×1010 + 3.34 1.7%
1 9.9×109 + 3.81 3.3%
10-1 9.9×108 + 6.59 0.6%
10-2 9.9×107 + 10.07 1.1%
10-3 9.9×106 + 13.84 0.6%
10-4 9.9×105 + 16.78 0.9%
10-5 9.9×104 + 20.33 0.1%
10-6 9.9×103 + 23.30 0.5%
10-7 9.9×102 +/- 26.65 0.5%
10-8 9.9×101 - 29.00 0.8%
10-9 9.9×100 - 30.75 1.0%
10-10 9.9×10-1 - 31.24 0.4%
NTC - - - -
圖50 Multiplex PCR Detection of EH92-527-1。
圖51 ELISA detection of EH92-527-1。
圖52 Construction of plasmidic reference material (PRM) (left) and quantification standard curve。