水稻突變體AZ1310 白葉枯病抗性基因之研究 白葉枯病是水稻重要病害之一。抗性品種已是防治 之最上策，而抗性來源則為主要限制因素。本團隊 已 完 成SA0423 及 SA0424 水稻突變體抗性基因定 位及功能性基因體研究。故擬進行白葉枯病抗性水 稻突變體AZ1310 抗性之遺傳分析、連鎖分子標誌 之開發及抗性基因（R）之探討，進而利用分子標 誌輔助回交育種法，改良「臺中秈10 號」的白葉枯 病抗性。爰此，先以白葉枯病極感性「臺南11 號」
（TN11）與此突變體雜交後裔族群及強效病原菌分 離株（XF89b），進行遺傳分析與數量性狀基因座
（QTLs）定位。結果顯示，AZ1310 的抗性是受到 顯性QTL 所調控。QTL 定位結果，發現抗性基因
（qBBR11.1）位於 11 號染色體，可以解釋 27.9%
的抗性外表型（圖3-10）。同時，利用RNA Seq 分 析IR64、AZ1310 於接種Xoo XF89b 後 0、0.5、1、
2、4、6 小時的轉錄體，結果發現有 80 個差異性表 現基因，可能參與在AZ1310 的白葉枯病抗性（圖 3-11）。目前我們正在探討位於qBBR11.1 區間的差 異表現基因。此外，亦利用本研究所開發的分子標 誌，將AZ1310、qBBR11.1 導入「臺中秈 10 號」，
經選拔的BC2F1 個體病斑明顯較「臺中秈10 號」短，
顯示qBBR11.1 確實參與在 AZ1310 的白葉枯病抗性
（圖3-12）。這些研究成果可提供轉譯農學應用之 重要材料，闡明AZ1310 突變體之白葉枯病抗性遺 傳基礎，除可直接育成抗性品種外，亦可提供分子 標誌或抗性基因，作為今後水稻品種改良之依據。
生 物 技 術
圖3-10 AZ1310 突變體白葉枯病抗性基因遺傳圖譜。
生 物 技 術
圖3-11 AZ1310 突變體白葉枯病抗性相關之差異表現基因
熱圖。
圖3-12 AZ1310、BC2F1及「臺中秈10 號」(TSC10) 於接 種白葉枯病菌(XF89b) 28 天後之病斑長度。
建構異源基因表現之水稻分子農場 本研究旨在 驗證水稻基因功能，並積極發展相關之研究。本年度 持 續 將pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK、 pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW、pCAMBIA-Ubi-5xVYPHK 等 T1 及 T2 抗高血壓胜肽轉殖系進行同質結合體之篩選與蛋白質 表現分析。於PCR 檢測結果顯示，所篩選之 T1及T2 轉殖系皆帶有目標基因。進一步利用即時定量逆轉 錄PCR （real time RT PCR）偵測目標基因的表現量
（圖3-13 A），結果顯示轉殖系的目標基因表現量確
實高於TNG67 轉殖系中，隨後挑選其中 6 株目標基 因表現量最高的轉殖系，利用西方墨點法偵測蛋白質 表現，其中，編號pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK3.2-3-1 可以看到72 kDa 明顯訊號（圖3-13 B），顯示水稻 確實可以成功表現抗高血壓胜肽異源蛋白。於秈稻轉 殖平台之建立，將醣類來源由sucrose 改為 maltose，
改善癒傷組織褐化的情形，並取得15 株轉殖系，轉 殖效率為1.6%，經過 PCR 分子檢測，大部分轉殖株 可以偵測到ZsGFP目標基因，顯示醣類來源的更換 有助於提高秈稻轉殖成功率。另一方面，以CRISPR/
Cas9 基因編輯系統建構抗性澱粉關鍵基因sbe3載體
（圖3-14 A, B），透過農桿菌媒介轉殖取得T0擬轉 殖系，於Sbe3 CRISPR/Cas9表現系統，取得6 株轉 殖株，轉殖效率為0.6%（圖3-14 C），於pRGEB32 載體，取得14 株轉殖株，轉殖效率為 2.5%，大部分 轉殖系皆可偵測到訊號，顯示外來的表現載體已轉殖 至水稻細胞之中，未來可探討SBE3基因於澱粉生合 成的路徑所扮演的功能。
圖3-13 抗高血壓胜肽T2 轉殖系轉錄轉譯分析。
(A) pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK、pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW T2轉殖系real-time RT-PCR 檢測 (B) 利 用 西 方 墨 點 法 進 行 pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK、pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW T2轉殖系 蛋白質檢測。
P: positive control from CGT::5xACEI/pQG；
1:pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK3.2-3-1；
2: pCAMBIA-Ubi-5xGVYPHK4.3p-1-1；
3: pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW4.2-4-1 4: pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW6.2-1-1；
5: pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW6.2-2-2；
6: pCAMBIA-Ubi-5xPTHIKW6.2-5-1 (A)
(B)
生 物 技 術
(A)
(B)
(C)
圖3-14 建構sbe3 之 CRISPR/Cas9 刪減表現系統。
(A) sbe3 cDNA 及 gRNA 設計位置。
(B) sbe3 表現載體示意圖。
(C) sbe3 載體經轉殖後，於抗生素篩選後之癒傷組織，分化成植株。
甜瓜種原重要抗病性及外表型資訊之開發及應 用 甜瓜為世界重要高經濟價值作物，近年來面對品 種快速更迭及氣候變遷導致的一連串栽培逆境，有 必要建立一系列從種原至育種之完整流程，提升種 原利用性並加速育種效率以迅速回應甜瓜市場之所 需。因此本計畫包含種原的盤點、外表型調查（多 季評估）、抗病性評估、抗病基因驗證、分子標誌 輔助回交育種，前兩年度已完成種原盤點、兩季重 要園藝特性調查及抗病性評估（白粉病生理小種1 及矮南瓜黃化嵌紋病毒）。本年度（108）接續先前 計畫，持續完善甜瓜核心種原資訊，尤其補足抗病 性資訊不足問題，因此針對我國甜瓜重要病害- 白粉
病生理小種5 及木瓜輪點病毒 - 西瓜型進行抗感性評 估，結果顯示102 個甜瓜核心種原中有 17 個品系對 白粉病生理小種5 具抗性，33 個品系對木瓜輪點病 毒- 西瓜型具抗性，篩選得到之抗性種原將可用於抗 性基因之探勘及抗病育種。另外為驗證先前全基因體 關聯性分析得到之白粉病生理小種1 抗性候選基因，
本計畫亦建立F2分離族群並進行數量性狀基因座定 位（與臺灣大學農藝系合作），結果得到3 個白粉 病抗性基因座（分別位於第2、5 及 12 條染色體上），
明年度將應用此些抗性基因座於分子標誌回交育種，
快速將單一或多個抗性基因導入優良甜瓜品系中（圖 3-15）。
生 物 技 術
圖3-15 甜瓜白粉病生理小種1 抗性基因驗證族群 19-C4-F2果實外觀及果肉。(A) 母本 (B) 父本 (C) 一代雜交種 (F1) (D、E)
二代雜交種(F2)。
應用二氧化銥促進電穿孔效率以進行基因轉殖 電穿孔為對細胞施以高電壓脈衝，使細胞膜上短暫出 現微小孔洞供外界DNA 或蛋白質通過。本次選用番 椒花粉做為電穿孔試驗材料，並添加交通大學開發 之二氧化銥奈米粒子進行電穿孔試驗。在花粉活性 及花粉管萌芽檢測中，添加二氧化銥並沒有顯著性 之影響，顯示二氧化銥奈米粒子對生物不具有毒性。
在電穿孔效率方面，添加二氧化銥於500V 電壓處 理，可提升電穿孔效率達70.8% （圖3-16），且花
粉管萌芽率相較對照組並無差異。在添加外源EGFP DNA 並電穿孔處理後之花粉，經人工授粉至番椒雌 蕊，共獲得278 種子。螢光檢測 278 顆植株根部，
共計4 株具有螢光訊號 （圖3-17），以此計算轉殖 率為1.3%；PCR 檢測外源 EGFP 片段，共 183 株具 有外源DNA 片段，以此估算轉殖率為 65.8%。以此 結果顯示，二氧化銥奈米粒子確實可提高花粉電穿 孔效率，並藉此獲得帶有EGFP 螢光訊號之轉殖系。
生 物 技 術
圖3-16 於不同電壓處理下，Trypan blue 滲入花粉之程度。花粉溶液加入或不加入二氧化銥(0.1 mg/ml) 後，
於不同電壓處理下，計算Trypan blue 滲透到細胞 之比率(n=6)。
圖3-17 T1轉殖株及正常番椒根部螢光表現圖。番椒種子平
鋪於潮濕擦拭紙之培養皿上，於26℃ 且避光中誘 導發芽，約3~7 日發芽後，利用螢光解剖螢光顯微 鏡檢查根部螢光表現情形。
彩色辣椒核心種原之建立與利用 多樣性種原的 蒐集與評估有助於提升作物育種效率。種原評估工 作包含園藝性狀調查與遺傳背景分析。分子標誌是 快速評估種原遺傳歧異性的工具之一，本研究利用 分子標誌進行49 份番椒（Capsicum spp.）種原之遺
傳歧異性分析，以及辣味、果色與抗病性基因型分 析。另進行34 個園藝性狀調查，包含株高、果實成 熟期、果實產量、果色、果形與可溶性固形物等。果 實性狀結果，果重範圍0.7~82 g，單株產量 47~623 g，單株果數 3~115 個，果實可溶性固形物含量（糖 度） 4.0~14°Brix；顯示種原間性狀歧異度很大。另 合併20 個 SSR 引子進行 72 樣品（49 收集系）之遺 傳歧異度分析結果，可區分為3 群；其中C. annuum 的遺傳相似度44.1% 為最低，C. chinense 97% 為最 高（圖3-18）。本研究期綜合園藝性狀與分子標誌 分析結果，篩選高適應性（耐熱性、抗病性等）並 高遺傳歧異度之辣椒種原，以提供育種改良之利用。