單體-激態附體之形成 (Formation of monomer-excimer)

單體 (monomer) 指的是單獨的螢光團，激態複體 (excimer) 是 excited dimer 的縮寫，表示激發態螢光團的二聚體。在單體-激態複體系統中，基本要件為至少 要含有兩個或兩個以上的螢光團，而形成激態複體的反應機構有兩種：一是單體 受光激發後，由基態躍遷至激發態，由於分子間作用力，激發態螢光團會吸引基 態螢光團，當一對螢光團的 π 軌域重疊而產生激態複體，此種方式稱為動態的激 發複體 (dynamic excimer)；另一種是一對螢光團在基態時靠近而成為具有物理作 用的二聚體，吸光後直接躍遷形成此二聚體的激發態，此時激態複體能階較高，

因此會進行結構重組降低能階，此種方式稱為靜態的激態複體 (static excimer)。因 激態複體之能階差較小且沒有振動能階，所以螢光放射光譜之波長較單體長，峰 寬也較寬，如圖 1-18 (a) 所示。⁶² 最常見用來形成激態複體的螢光團為芘分子 (pyrene)，其單體放射峰波長位於 370-380 nm，激態複體放射峰波長則位於 460-480 nm。Schmuck 教授及其研究團隊曾在 2012 年發表以芘分子為基礎的胜肽信號 (peptide beacon) 探針 18，⁶³並會與雙股 DNA 作用，作用前探針分子為摺疊形式 並放出激態複體的螢光 (490 nm)，與 DNA 結合後造成結構上的改變，兩個堆疊的 芘分子被拆散並放出單體的螢光 (406 nm)，監測這兩個放射峰的相對強度 (F406 / F490)，可以比例的方式感測核酸，如圖 1-18 (b) 所示。

圖 1-18 (a) 單體與激態複體螢光放射光譜之比較。⁶² (b) 上圖為探針 18 分子結構；

下圖為探針 18 應用於比例感測 DNA 示意圖。⁵⁴

1.4 3-羥基黃酮 (3-Hydroxyflavone，3-HF) 螢光團之介紹

在 1-3 章節已經介紹過許多比例螢光的放射機制，有利用單一螢光團與分析物 反應前後造成波長變化，來達到比例螢光的目的；也有利用同一個分子內，有兩 個不同放射波長的螢光團，來達到比例螢光的目的，但不同的螢光團即使在相同 環 境 中 ， 也 會 有 不 同 驟 熄 (quenching) 效 果 及 光 分 解 效 應 (effect of photodegradation)，使得無法達到自我校正之功能，故最理想的方法是選用於不同 波長具有兩個以上放射峰的單一螢光團，利用不同波長-螢光比例之變化來達到自

我校正之效果，其中 3-羥基黃酮 (3-hydroxyflavone，3-HF) 螢光團便擁有此特性，

其結構如圖 1-19 所示。

圖 1-19 3-羥基黃酮之結構。

1.4.1 3-Hydroxyflavone 雙螢光放射機制

Kasha 教授及其研究團隊於 1979 年最先開始研究 3-hydroxyflavone 的螢光性質，

64此螢光團具有雙螢光放射峰，兩個放射峰分別由激發態分子內電荷轉移 (excited state intramolecular charge transfer，ESICT) 與激發態分子內質子轉移 (excited state intramolecular proton transfer，ESIPT) 提供。而 Demchenko 教授及其研究團隊於 2010 年發展出可用於 3-hydroxyflavone 光譜解迴旋 (deconvolution) 的演算系統，

並對此分子進行更仔細的分析。⁶⁵ 其螢光放射機制由 3-hydroxyflavone 衍生物 4'-diethylamino-3-hydroxyflavone (FE) 作 示 範 ， 若 在 非 質 子 性 溶 劑 中 (aprotic solvent)，FE 分子受激發後其電子從 normal 的基態 (N) 躍遷至激發態 (N^*)，此時 因為分子本身的性質，3 號位置羥基上的氫會進行質子轉移 (proton transfer) 至 4 號位置的羰基上，形成分子的互變異構體 (tautomer)，電子也會轉移至能量較低的 tautomer 激發態 (T^*)，隨後放出綠色螢光回到 tautomer 基態 (T)，而此放射峰即稱 為 ESIPT 放射峰，最後在歷經鬆弛後回到 normal 的基態 (N)，而部分未進行質子 轉移的電子則會從 normal 的激發態 (N^*) 放出藍色螢光回到 normal 的基態 (N)，

而此放射峰即稱為 ESICT 放射峰。Brown 教授及其研究團隊指出 3-hydroxyflavone 激發態分子內質子轉移 (ESIPT) 之半生期短於 35 飛秒 (femtosecond)，相對於其 他系統而言是非常快速的，故常溫下 3-hydroxyflavone 螢光主要由 ESIPT 路徑提供。

66而若在質子性溶劑中 (protic solvent)，4 號位置上的羰基會和溶劑中的質子形成 分子間的氫鍵，產生能階比 normal 基態略低的 normal-hydrated 基態 (N-H)，分子 受激發後躍遷至 normal-hydrated 激發態 (N^*-H)，此時 ESIPT 路徑被溶質-溶劑間 的分子間氫鍵競爭，而以 normal-hydrated 激發態 (N^*-H) 回到 normal-hydrated 基 態 (N-H)，放出波長較 ESICT 長的螢光，如圖 1-20 所示。

圖 1-20 3-羥基黃酮衍生物之螢光放射機制示意圖。

由上述 deconvolution 的演算系統中可知，3-hydroxyflavone 衍生物 FE 擁有兩 個可被激發之基態 (N，N-H)，與三個螢光放射峰 (N^*、N^*-H、T^*)，而 N^*-H 放射 峰落在 N^*與 T^*放射峰之間，如圖 1-21 (a) 所示。隨著溶劑極性上升，N^*放射峰隨 之增加；而隨著介質中水的比例上升，N^*-H 放射峰的訊號強度也逐漸增，通常 N^*-H 與 N^*兩個峰產生的螢光放射在光譜上會大部分重疊而不易區分，因此在應用上除 非有特定因素，不然均將兩峰之重疊當作一放射峰，稱之為 ESICT 放射峰，如圖

1-21 (b) 所示。若擁有多參數回應之螢光團放射峰間距過近，於自我校正時雖然不 同波峰會有消長變化，但大幅度的重疊會使其效果不彰。FE 之 ESICT 與 ESIPT 這兩個放射峰距離遠，免除了重疊之疑慮，可將比例螢光之優點完全發揮。

圖 1-21 (a) FE 分子的螢光訊號經解迴旋分解成 N^*、N^*-H、T^*三個峰 (藍色為 N^* 峰、紅色為 T^*峰、綠色為 N^*-H 峰、紫色為 N^*、N^*-H、T^*三個峰之總合)。(b) FE 分子螢光放射隨不同溶劑極性或含氫鍵程度而變化示意圖。⁶⁷

1.4.2 3-Hydroxyflavone 衍生物之應用

3-hydroxyflavone 衍生物近年來已被廣泛的運用在螢光感測器與探針上，此螢 光團具有以下優點：(1) 相較酵素免疫分析法中，使用昂貴的抗體連結酵素免疫複 合體，3-hydroxyflavone 螢光團為有機化合物，具有成本低廉、穩定性高等特色。

(2) 相 較 於 大 部 分 高 螢 光 產 率 的 螢 光 團 是 以 單 一 螢 光 變 化 來 做 偵 測 ， 3-hydroxyflavone 衍生物具有兩種螢光放射路徑，受環境極性影響大而有相對比例 的變化，可達到自我校正之效果，具有更高的可信度。

1993 年 Kelley 教授及其研究團隊，直接利用 ESICT/ESIPT 螢光放射強度比例 變化，探測未知溶劑環境極性大小；⁶⁸ 2002 年 Klymchenko 教授及其研究團隊，曾 透過延長共軛長度或修飾其他官能基，來改變 3-hydroxyflavone 螢光放射的波長位 置，增加此螢光團的應用性；^69,70同年 Suzuki 教授利用金屬與 3-hydroxyflavone 上 的羥基和羰基之結合強弱，來辨識金屬離子；⁷¹又 3-hydroxyflavone 對環境中質子

給予基團非常敏感，故可用於偵測水合能力。⁷²除此之外，3-hydroxyflavone 亦是 廣泛應用於生物方面之測試，如偵測生物膜 (biomembrane) 之偶極潛力 (dipole potential)；⁷³ 利用改變脂肪酸組成、極性端 (polar head)、溫度與膽固醇比例來偵 測磷脂質雙層 (phospholipid bilayer) 分布位置之性質。⁷⁴近幾年則將此螢光團應用 在生物體內半胱胺酸 (cysteine) 的偵測上，在 3 號位置羥基修飾上會和 cysteine 反 應的官能基，藉由反應前後 ESIPT 路徑被阻擋與否，達到偵測的目的。^75,76