I. 合成3-羥基黃酮雌二醇螢光探針並探討連接子對於分子光物理性質及自組裝行為的影響 II. 發展可快速偵測光氣之螢光探針

國立台灣大學理學院化學研究所 碩士論文

Department of Chemistry College of Science

National Taiwan University Master Thesis

I. 合成 3-羥基黃酮雌二醇螢光探針並探討連接子對於分子光物理性質 及自組裝行為的影響

II. 發展可快速偵測光氣之螢光探針

I. Synthesis of 3-Hydroxyflavone-EDIOL Fluorescent Probes to Investigate the Effect of Linkers on Photophysical Properties and Self-Assembly Behaviors

II. Development of a Fluorescent Probe to Detect Phosgene with Rapid Response

洪珮洳 Pei-Ju Hung

指導教授：陳昭岑 博士 Adivisor: Chao-Tsen Chen, Ph.D.

中華民國 106 年 10 月

October, 2017

謝誌

兩年的時間很快就過去了，一開始覺得不可能寫出來的論文也順利的生出來 了，雖然耗時許久(苦笑)。回想這兩年多了時間，老實說，不苦是騙人的，從剛來 台北就發生的宿舍小默契事件，到第一年時課業上的壓力和實驗上的碰壁，再加 上人生地不熟，讓我曾萌生放棄的念頭，有段時間還需要靠看些勵志的話語才能 撐過一天。但人生沒有過不去的關卡，家人們的支持和朋友的打氣讓我熬過來了。

一路上要感謝的人很多，最先感謝的當然是生我育我的母親大人，雖然她總 是不明白我到底在忙什麼，也總說我都把她當作提款機，但沒有她的默默支持和 照顧，我不可能走到今天，辛苦了，之後就換我當她的白金卡。再來要感謝我的 指導教授陳昭岑老師，提供一個自由發揮且充裕的研究環境，以及在研究方向、

化學知識和實驗態度上的指導與教誨，都讓我學到了很多。還要感謝我的專題指 導教授吳安台老師，給那時還是專題生且什麼都不會的我一個進入實驗室的機會，

奠定了實驗基礎。接著感謝實驗室的夥伴們，我的師傅胖哥，在他身上我學到很 多實驗上的技巧，也因為他的帶領，我才能很快的進入狀況，就算他離開實驗室 後也時常回來在實驗上給予我建議和指導；傲驕俊彥學長，雖然看起來兇兇的，

但其實你只要問他問題他都會給出很好的解答；垂死她渟葦學姊，給予了很多就 業上的建議，同時也是羽球團號昭者，讓我們有運動的動力；有機神人昱 學長，

神一般的有機知識和教科書般的論文解救了愚鈍的我；打拼好夥伴吃飯股長力瑋，

在課業上總是耐心的幫我解答問題，研究上的討論與幫助解決了許多問題；也是 打拼好夥伴的司機育晴，畢業前半年應該有一半的時間都在承受我的重量，在很 多事情上總是熱情的給予幫助；還有怕魚和你才臭勒的姿宇、有偶像包袱和互相 嘴砲的俊翔、時常慢半拍和踢毽子達人的皓晨同志，因為有你們的相伴，讓苦悶 的實驗中多了許多歡笑，也讓我能夠歡樂度過碩二的時間。要感謝的人太多，無 法一一列舉，只能在此對於所有關懷過我、幫助我成長的人致上由衷的感謝。

2017.10.17 珮洳 謹誌

目錄

目錄 ... I 圖目錄 ... V 表目錄 ... XII 簡稱用語對照表 ... XIII 中文摘要 ... XVI 英文摘要 ... XVIII

第一部分 合成 3-羥基黃酮雌二醇螢光探針並探討連接子對於分子光物理性質及 自組裝行為的影響

第一章 緒論 ... 2

1.1 自組裝概念之簡介及其應用 ... 2

1.1.1 影響自組裝形成之因素 ... 2

1.1.2 兩性分子的堆積參數和自組裝形態 ... 5

1.1.3 胜肽 (peptide) 兩性分子所形成之自組裝結構 ... 6

1.1.4 尿素 (urea) 建構單元所形成之自組裝結構 ... 8

1.1.5 生物活性建構單元所形成之自組裝結構及其應用 ... 10

1.2 類固醇之簡介與其自組裝之應用 ... 13

1.2.1 類固醇結構和種類 ... 13

1.2.2 類固醇衍生物之自組裝介紹 ... 15

1.3 比例 (ratiometric) 螢光團偵測機制 ... 17

1.3.1 激發態分子內電荷轉移 (Excited-state intramolecular charge transfer， ESICT) ... 18

1.3.2 激發態分子內質子轉移 (Excited-state intramolecular proton transfer， ESIPT) ... 19

1.3.3 螢光共振能量轉移 (Fluorescence resonance energy transfer，FRET).. 19

1.3.4 單體-激態附體之形成 (Formation of monomer-excimer) ... 20

1.4 3-羥基黃酮 (3-Hydroxyflavone，3-HF) 螢光團之介紹 ... 21

1.4.1 3-Hydroxyflavone 雙螢光放射機制 ... 22

1.4.2 3-Hydroxyflavone 衍生物之應用 ... 24

1.5 以苯併呋咱 (benzofurazan) 為骨架的螢光團之介紹 ... 25

1.5.1 以 benzofurazan 為骨架的螢光團之螢光特性 ... 26

1.5.2 以 benzofurazan 為骨架的螢光團之應用 ... 27

1.6 實驗室相關研究 ... 29

第二章 雌二醇螢光分子之合成 ... 34

2.1 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 、 DBD-7α-U-EDIOL 之分子設計 ... 34

2.2 共同前驅物化合物 8 之逆合成分析與合成步驟 ... 37

2.3 螢光團衍生物 4'-EA-3-HF 與 7-EDADBD 之逆合成分析與合成步驟 ... 41

2.3.1 螢光團衍生物 4'-EA-3-HF ... 42

2.3.2 螢光團衍生物 7-EDADBD ... 44

2.4 HF-7α-Gly-EDIOL、DBD-7α-Gly-EDIOL 之逆合成分析與合成步驟 ... 45

2.4.1 HF-7α-Gly-EDIOL ... 46

2.4.2 DBD-7α-Gly-EDIOL ... 48

2.5 HF-7α-U-EDIOL、DBD-7α-U-EDIOL 之逆合成分析與合成步驟 ... 50

2.5.1 DBD-7α-U-EDIOL ... 51

2.5.2 HF-7α-U-EDIOL ... 53

第三章 雌二醇螢光分子之物理性質探討 ... 56

3.1 螢光性質探討 ... 56

3.1.1 HF-7α-Gly-EDIOL 與 HF-7α-U-EDIOL 螢光性質探討 ... 56

3.1.2 DBD-7α-Gly-EDIOL 與 DBD-7α-U-EDIOL 螢光性質探討 ... 60

3.1.3 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 、 DBD-7α-U-EDIOL 相對臨界聚集濃度之比較 ... 62

3.1.4 螢光性質綜合討論與比較 ... 66

3.2 超結構之尺寸、表面電性與型態鑑定 ... 68

3.2.1 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 、 DBD-7α-U-EDIOL 之動態光散射與表面電位量測之結果 ... 68

3.2.2 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 、 DBD-7α-U-EDIOL 於穿透式電子顯微鏡之實驗結果 ... 70

3.2.3 超結構型態鑑定之綜合討論與比較 ... 72

3.3 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 、 DBD-7α-U-EDIOL 之細胞實驗測試 ... 75

第四章 總結 ... 78

第二部分 發展可快速偵測光氣之螢光探針 第一章 緒論 ... 81

1.1 光氣介紹 ... 81

1.2 光氣螢光探針之發展與其偵測機制 ... 84

第二章 探針 7-EDADBD 之合成 ... 89

2.1 研究動機與目的 ... 89

2.2 探針 7-EDADBD 和產物 7-IDBD 之合成步驟 ... 90

第三章 實驗結果與討論 ... 91

3.1 探針 7-EDADBD 和產物 7-IDBD 之溶劑效應 ... 91

3.2 探針 7-EDADBD 與產物 7-IDBD 之螢光性質和分子軌域能階 ... 92

3.3 探針 7-EDADBD 與光氣之反應時間與鹼滴定實驗 ... 95

3.4 探針 7-EDADBD 與光氣之滴定實驗與偵測極限 ... 99

3.5 探針 7-EDADBD 與三光氣之反應機制和選擇性實驗 ... 102

第四章 總結 ... 105

實驗部分 ... 106

一、一般敘述 ... 106

二、生物活性測試方法 ... 110

三、合成步驟及光譜數據 ... 114

參考文獻 ... 126

附錄 ... 134

圖目錄 第一部分

圖 1-1 (a) 分子之間吸引力和排斥力關係圖。(b) 不可逆聚合和可逆有序自組裝之 間本質區別之示意圖。 ... 4 圖 1-2 可由臨界堆積參數 Cpp 預測兩性分子自組裝的結構形態。 ... 6 圖 1-3 由七個 glycine 組成的胜肽鏈作為 linker 連接親疏水端的胜肽兩性分子結構 圖。 ... 7 圖 1-4 (a) 胜肽單體 G_nD₂之 3D 空間分佈分子模型 (綠色為碳，白色為氫，紅色 為氧，藍色為氮)，由上到下分別為 G4D2、G6D2、G8D2和 G10D2，而分子長度範 圍從 G₄D₂ 2.4 nm 至 G₁₀D₂ 4.7 nm。(b) G_nD₂自組裝形成奈米管狀 (上) 和奈米囊狀 (下) 結構模型示意圖 (結構模型直徑分別為 50 和 100 nm)，glycine 為被包覆在雙 層結構內部遠離水的綠色部分，aspartic acids 為外層暴露於水中之紅色部分。...

... 8 圖 1-5 (a) 尿素一維氫鍵鏈結構。(b) 由尿素氫鍵鏈和羧酸二聚體正交連接形成的 二維層狀結構。(c) 上圖為仲丁基取代的四個尿素組成一具手性分子之結構，下圖 為手性分子由尿素-尿素氫鍵組裝成的三維四方多孔結構。 ... 9 圖 1-6 大環雙尿素建構單元 (左上) 與自組裝形成空心柱狀結構 (左下) 示意圖。

一系列代表性的大環雙尿素分子結構 (右上) 和其所對應的自組裝結構 (右下) 示 意圖。 ... 10 圖 1-7 具有生物活性功能分子組成 (上端紅色為具有生物活性之基團，中端綠色 為連接鏈，下端橄欖綠為自組裝功能基團) 和其藉由非價作用力自組裝成不同的奈 米結構示意圖。 ... 11 圖 1-8 多共價效應示意圖。 ... 12 圖 1-9 (a) 自組裝 turn-on 螢光探針偵測特定蛋白之感測機制示意圖。(b) 一系列 蛋白質螢光探針之分子結構。 ... 12

圖 1-10 (a) 類固醇結構與碳數編號。(b) 類固醇中 A/B 環為反式或順式之結構。

... 13 圖 1-11 具生理活性之雌性激素結構。 ... 14 圖 1-12 以膽固醇為基礎的分子 ALS、A(LS)₂和 LS₂組分示意圖。 ... 15 圖 1-13 (a) NA 和 NADC 分子結構圖。(b) NA 和 NADC 分子於 5 ℃下自組裝結 構之 TEM 圖。(c) ISA 系統自組裝模式示意圖和 NA 和 NADC 分子於室溫下自組 裝結構之 TEM 圖。 ... 16 圖 1-14 在不同溶劑組成下 POM-Chol 分子自組裝結構示意圖。 ... 17 圖 1-15 以 ICT 機制為基礎的探針之給電子基團或接受電子基團與陽離子結合後，

能階差異與光譜偏移示意圖。 ... 18 圖 1-16 以 HBO 分子為例的 ESIPT 機制圖。 ... 19 圖 1-17 (a) (b) 供、受體吸收和放射光譜圖。左邊藍色為供體，右邊綠色為受體，

虛線為吸收光譜，實線為放射光譜，中間橙色區域表示供體放射光譜與受體吸收 光譜重疊部分。 ... 20 圖 1-18 (a) 單體與激態複體螢光放射光譜之比較。 (b) 上圖為探針 18 分子結構；

下圖為探針 18 應用於比例感測 DNA 示意圖。 ... 21 圖 1-19 3-羥基黃酮之結構。 ... 22 圖 1-20 3-羥基黃酮衍生物之螢光放射機制示意圖。 ... 23 圖 1-21 (a) FE 分子的螢光訊號經解迴旋分解成 N^*、N^*-H、T^*三個峰 (藍色為 N^* 峰、紅色為 T^*峰、綠色為 N^*-H 峰、紫色為 N^*、N^*-H、T^*三個峰之總合)。(b) FE 分子螢光放射隨不同溶劑極性或含氫鍵程度而變化示意圖。 ... 24 圖 1-22 (a) 常見以 benzofurazan 為骨架的螢光試劑之結構圖。(b) 螢光試劑之胺 類螢光衍生物結構圖。 ... 25 圖 1-23 solvatochromic 效應對螢光影響示意圖。 ... 27 圖 1-24 (a) 含聚合雙鍵官能基之苯併呋咱衍生物。(b) 不同溫度應答螢光高分子 最強放射螢光強度對溫度作圖。分別為 PNIPAM 修飾 DBD-AE (●)、NBD-AE2 (▲)、

NBD-AA (+)、ABD-TE (♦)、NBD-AE (x) 以升溫模式測量以及 DBD-AE (○) 以降

溫模式測量。 ... 28

圖 1-25 (a) 蛋白質螢光探針感測機制示意圖。(b) 一系列偵測特定蛋白質螢光探 針之分子結構。 ... 28

圖 1-26 HF-EDIOL、HF-EDINH2、HF-EDISO4H、HF-7α-EDIOL、HF-3-EDIGuid、 HF-3-EDICO2H 與 HF-7-EDISO4H 之結構圖 (藍色為余柔靚學姊分子，橘色為蘇 怡文學姊分子)。 ... 29

圖 1-27 (a-g) 上 圖 分 別 為 HF-EDIOL 、 HF-EDINH2、 HF-EDISO4H 、 HF-7α-EDIOL、HF-3-EDIGuid、HF-3-EDICO₂H 與 HF-7-EDISO₄H (10 μM) 在 不同比例 DMSO/H2O 溶劑中之螢光光譜，λex = 354、355、359、359、356、362、 357 nm，slit_ex & slit_em = 5 nm (HF-3-EDICO₂H 之 slit_ex, slit_em = 2.5, 5 nm)。(a-g) 下 圖為相對應之螢光顯像圖，由左至右 DMSO 濃度分別為 5%，20%，40%，50%， 60%，80%，100%。(h) HF-EDIOL、HF-EDINH₂、HF-EDISO₄H、HF-7α-EDIOL、 HF-3-EDIGuid 、 HF-3-EDICO2H 與 HF-7-EDISO4H (10 μM) 在 不 同 比 例 DMSO/H₂O 溶劑中之 ESICT/ESIPT 比例圖。 ... 31

圖 2-1 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 之分子結構設計與分子結構圖。 ... 35

圖 2-2 化合物 I、II、III、IIIa之結構及在乙酸乙酯 (□)、二氯甲烷 (△)、乙腈 (○) 中之螢光光譜。 ... 36

圖 2-3 化合物 8 之逆合成分析。 ... 37

圖 2-4 螢光團衍生物 4'-EA-3-HF 之逆合成分析。 ... 42

圖 2-5 螢光團衍生物 7-EDADBD 之逆合成分析。 ... 44

圖 2-6 螢光團衍生物 HF-7α-Gly-EDIOL 之逆合成分析。 ... 46

圖 2-7 螢光團衍生物 DBD-7α-Gly-EDIOL 之逆合成分析。 ... 49

圖 2-8 螢光團衍生物 DBD-7α-U-EDIOL 之逆合成分析。 ... 51

圖 2-9 螢光團衍生物 HF-7α-U-EDIOL 之逆合成分析。 ... 54

圖 3-1 HF-7α-Gly-EDIOL (10 μM) 分子在不同比例 DMSO/H2O 溶劑中之 (a) 螢 光光譜，λex = 356 nm，slitex & slitem = 5 nm；(b) 吸收光譜；(c) 相對應之螢光顯像 圖，由左至右 DMSO 濃度分別為 5%，20%，40%，50%，60%，80%，100%；(d) ESICT/ESIPT 比例圖。(e) 3-HF^-…DMSOH⁺錯合物生成示意圖。 ... 58 圖 3-2 HF-7α-U-EDIOL (10 μM) 分子在不同比例 DMSO/H2O 溶劑中之 (a) 螢光 光譜，λex = 356 nm，slitex & slitem = 5 nm；(b) 吸收光譜；(c) 相對應之螢光顯像圖，

由左至右 DMSO 濃度分別為 5%，20%，40%，50%，60%，80%，100%；(d) ESICT/ESIPT 比例圖。(e) HF-7α-U-EDIOL 分子之間氫鍵作用力示意圖。 ... 59 圖 3-3 DBD-7α-Gly-EDIOL (a-c) 和 DBD-7α-U-EDIOL (d-f) (10 μM) 分子在不同 比例 DMSO/H2O 溶劑中之 (a、d) 螢光光譜，λex = 442 nm，slitex & slitem = 5 nm；

(b、e) 相對應之螢光顯像圖，由左至右 DMSO 濃度分別為 5%，20%，40%，50%，

60%，80%，100%；(c、f) 螢光強度圖。 ... 61 圖 3-4 左圖 (A) 兩性分子結構 (B) 兩性分子於空氣-水介面的排列方式 (C) 微 胞結構。右圖為溶液表面張力對界面活性分子濃度做圖和微胞形成示意圖。 . 62 圖 3-5 不 同 濃 度 的 (a) HF-7α-Gly-EDIOL 、 (b) HF-7α-U-EDIOL 、 (c) DBD-7α-Gly-EDIOL 和 (d) DBD-7α-U-EDIOL 分子在 5% DMSO 水溶液中之螢光 表現。(a) (b) 圖為 ESICT/ESIPT 比例 vs 濃度圖，λ_ex = 356 nm，slit_ex & slit_em = 5 nm。

(c) (d) 圖為螢光強度 vs 濃度圖，λex = 442 nm，slitex & slitem = 5 nm。圖的下方為相 對應之螢光顯像圖，由左至右濃度分別為 1，2.5，5，7.5，10，30，50，100 μM。

(e) HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 分子在 5% DMSO 水溶液中之轉折點濃度表。 ... 65 圖 3-6 雌二醇螢光分子 HF-7α-EDIOL、HF-7α-Gly-EDIOL、HF-7α-U-EDIOL、

DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 之分子結構。 ... 67 圖 3-7 (a) HF-7α-Gly-EDIOL、(b) HF-7α-U-EDIOL、(c) DBD-7α-Gly-EDIOL 和 (d) DBD-7α-U-EDIOL 於 5% DMSO 水溶液之粒徑大小分布 (分子濃度均為 2 × 10^-4 M)。 ... 69

圖 3-8 (a) HF-7α-Gly-EDIOL、(b) HF-7α-U-EDIOL、(c) DBD-7α-Gly-EDIOL 和 (d) DBD-7α-U-EDIOL 於 5% DMSO 水溶液之穿透式電子顯微鏡觀測結果 (分子 濃度均為 2 × 10^-4 M)。左圖均為倍率較小之圖像，右圖均為倍率較大之圖像。72 圖 3-9 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 對 MCF-7 乳癌細胞之雷射掃描式共軛焦電子顯微鏡影像圖。圖 中波長為收光範圍，上方第一欄為收取 415-470 nm 之 ESICT 螢光放射峰；第二欄 為收取 505-550 nm 之 ESIPT 螢光放射峰；第三欄為可見光穿透影像 (Bright field)；

第四欄為前三欄之疊合 (ESICT 與 ESIPT 之激發波長均為 405 nm)。下方第一欄為 收取 555-610 nm 之螢光放射峰；第二欄為可見光穿透影像；第三欄為為前二欄之 疊合 (激發波長為 405 nm)。由上之下依序為 HF-7α-Gly-EDIOL、HF-7α-U-EDIOL、

DBD-7α-Gly-EDIOL、DBD-7α-U-EDIOL 分子。 ... 77 第二部分

圖 1-1 (a) 上圖為以 FRET 為基礎的光氣感測系統示意圖，下圖為兩個螢光分子 與光氣反應前後分子結構圖。(b) 光氣感測系統進行光氣滴定 (0.03-5 eq) 實驗之 螢光光譜圖，λ_ex = 343 nm (箭頭代表隨著光氣濃度增加螢光強度的變化)。兩個螢 光分子溶於氯仿中，濃度為 1 × 10^-3 M，以 1：1 先混合在一起，再加入 TEA (10 equiv.)，

然後進行滴定實驗。 ... 85 圖 1-2 上圖為 PY-OPD 螢光探針與光氣和 DCP 反應前後分子結構和螢光變化示 意圖；下圖右為 PY-OPD 螢光探針 (10 μM 於氯仿) 逐漸加入三光氣 (0-2 equiv.) 之螢光光譜圖，λex = 580 nm；下圖左為 PY-OPD 螢光探針 (10 μM 於氯仿) 逐漸加 入 DCP (0-100 equiv.) 之螢光光譜圖，λ_ex = 470 nm (內插圖為加入光氣或 DCP 前後 螢光顯色圖：A 為 PY-OPD，右 B 為 PY-OPD-phosgene，左 B 為 PY-OPD-DCP；

箭頭代表隨著光氣或 DCP 濃度增加螢光強度的變化)。 ... 87 圖 1-3 (a) 8-EDAB 螢光探針與光氣應前後分子結構和螢光變化示意圖 (內插圖為 加 入 光 氣 前 後 螢 光 顯 色 圖 ： 左 邊 藍 色 螢 光 為 8-EDAB ， 右 邊 綠 色 螢 光 為 8-EDAB-phosgene)。(b) 8-EDAB 螢光探針 (10 μM 於乙腈) 逐漸加入三光氣

(0-0.6equiv.) 之螢光光譜圖，λex = 390 nm (箭頭代表隨著光氣濃度增加螢光強度的 變化)。 ... 88 圖 2-1 螢光團衍生物 7-EDADBD 和三光氣反應之反應式。 ... 89 圖 3-1 (a) 7-EDADBD 和 (b) 7-IDBD (10 μM) 在不同極性溶劑中之 normalized 吸 收 (虛線) 和螢光 (實線) 光譜，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm (箭頭代表隨著溶劑極性增 加螢光波長的變化)。(c) 7-EDADBD (橄欖綠) 和 7-IDBD (藏青色) 在不同溶劑之 螢光柱狀圖。 ... 92 圖 3-2 (a) 7-EDADBD 和 7-IDBD (10 μM) 溶於 ACN 之吸收 (虛線) 和螢光 (實 線) 光譜，λ_ex = 426 nm (7-EDADBD) & 398 nm (7-IDBD)。(b) 7-EDADBD 和 7-IDBD (10 μM) 溶於 DCM 之吸收 (虛線) 和螢光 (實線) 光譜，λex = 424 nm (7-EDADBD) & 396 nm (7-IDBD)。slit_ex / slit_em = 2.5 / 5 nm (內插圖為 7-EDADBD (左) 和 7-IDBD (右) 之螢光顯色圖)。 ... 93 圖 3-3 利用 DFT 理論計算 7-EDADBD 和 7-IDBD 之電子密度分佈和前緣分子軌 域能階分佈示意圖。 ... 95 圖 3-4 7-EDADBD (10 μM) 在 (a) ACN 和 (b) DCM 溶劑中與三光氣 (0.7 equiv.) 反應之時間過程螢光光譜。(c) 特定波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 之螢光 強度和 7-IDBD 在該波長下之螢光強度比值對時間作圖。λ_ex = 398 nm (ACN) & 396 nm (DCM)，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm。 ... 96 圖 3-5 7-EDADBD (10 μM) 在 ACN (a) 和 DCM (b) 溶劑中於不同濃度 TEA 存在 下與 0.7 當量三光氣反應之特定放射波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 螢光強 度對不同 TEA 濃度作圖。λ_ex = 398 nm (ACN) & 396 nm (DCM)，slit_ex / slit_em = 2.5 / 5 nm。 ... 97 圖 3-6 (a) 7-EDADBD (10 μM) 溶於 ACN 中，在 TEA (0.1 μM) 存在下和三光氣 (0.7 equiv.) 反應之時間過程螢光光譜。(b) 7-EDADBD (10 μM) 溶於 DCM 中，在 TEA (1 μM) 存在下和三光氣 (0.7 equiv.) 反應之時間過程螢光光譜。(c) 特定波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 之螢光強度和 7-IDBD 在該波長下之螢光強度比

值對時間作圖。λex = 398 nm (ACN) & 396 nm (DCM)，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm。

... 98 圖 3-7 7-EDADBD (10 μM) 於 (a) ACN 和 (b) DCM 溶劑中在 TEA 存在下 (ACN：

0.1 μM；DCM：1 μM) 加入不同當量的三光氣 (0-2 equiv.) 進行滴定實驗之螢光光 譜。λex = 421 nm (ACN) & 413 nm (DCM)，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm (箭頭代表隨三 光氣濃度增加螢光強度的變化)。(c) ACN 和 (d) DCM 溶劑中特定波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 之螢光強度對不同三光氣當量數作圖。 ... 100 圖 3-8 7-EDADBD (10 μM) 在 (a) ACN 和 (b) DCM 溶劑中特定波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 之螢光強度對不同三光氣濃度 (0-6 μM) 作圖。λ_ex = 398 nm (ACN) & 396 nm (DCM)，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm。 ... 101 圖 3-9 探針 7-EDADBD 與三光氣反應機制示意圖。 ... 102 圖 3-10 (a) 不同活性物質之分子結構。7-EDADBD (10 μM) 於 (b) ACN 和 (c) DCM 溶劑中與三光氣 (0.7 equiv.) 和不同活性物質 (20 equiv.) 進行選擇性實驗之 螢光光譜。λex = 398 nm (ACN) & 396 nm (DCM)，slitex / slitem = 2.5 / 5 nm。(d) 特 定波長 (ACN：529 nm；DCM：507 nm) 之螢光強度柱狀圖。 ... 104

表目錄 第一部分

表 1-1 分子自組裝之主要非共價作用力強度。 ... 4 表 1-2 HF-EDIOL、HF-7α-EDIOL、HF-EDINH2、HF-3-EDIGuid、HF-EDISO4H、

HF-7-EDISO4H 與 HF-3-EDICO2H (200 μM) 之超結構型態鑑定綜合整理表。 ..

... 32 表 3-1 HF-7α-Gly-EDIOL 、 HF-7α-U-EDIOL 、 DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 之螢光性質比較。 ... 66 表 3-2 HF-EDIOL、HF-7α-EDIOL、HF-7α-Gly-EDIOL、HF-7α-U-EDIOL、

DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 於 5% DMSO 水溶液中 (分子濃度均為 2 × 10^-4 M) 之超結構形態鑑定結果整理表。 ... 74 第二部分

表 1-1 人類對不同急性光氣暴露劑量的反應。 ... 82 表 1-2 不同光氣暴露條件產生的症狀。 ... 83 表 1-3 代表性光氣螢光探針之整理表。 ... 86 表 3-1 探針 7-EDADBD 在不同溶劑和 TEA 濃度下和三光氣反應之平衡時間和轉 換率整理表。 ... 99 表 4-1 探針 7-EDADBD 相關實驗數據整理表。 ... 105

簡稱用語對照表 AA：acetic anhydride

AC：acetyl chloride ACN：acetonitrile

Boc：tert-butyloxycarbonyl Cpp：critical packing parameter CAC：chloroacetyl chloride

CAC：critical aggregation concentration CMC：critical micelle concentration

DBD：N,N-dimethyl-2,1,3-benzoxadiazole-7-sulfonamide DCC：N,N'-dicyclohexylcarbodiimide

DCM：dichloromethane DCP：diethyl chlorophosphate DFT：density functional theory DHP：3,4-dihydro-2H-pyran

DIAD：diisopropyl azodicarboxylate DIPEA：N,N-Diisopropylethylamine DLS：dynamic light scattering DMAP：dimethylaminopyridine

DMEM：dulbecco's modified eagle medium DMF：N,N-dimethylformamide

DMSO：dimethyl sulfoxide DNA：deoxyribonucleic acid EDA：ethylenediamine EDIOL：estradiol

ER：estrogen receptor

ESICT：excited state intramolecular charge transfer

ESI-HRMS：Electrospray-Ionization High-Resolution Mass ESIPT：excited state intramolecular proton transfer

FBS：fetal bovine serum

FE：4'-diethylamino-3-hydroxyflavone

FRET：fluorescence resonance energy transfer Gly：glycine

HBO：2-(2'-hydroxyphenyl)benzoxazole 3-HF：3-hydroxyflavone

HOMO：highest occupied molecular orbital HPLC：high performance liquid chromatography IR：Infrared Spectrum

ISA：ionic self-assembly LBD：ligand binding domain

LCST：lower critical solution temperature LDA：lithium diisopropylamide

LOD：limit of detection

LUMO：lowest unoccupied molecular orbital MVE：multivalent effect

NA：1-naphthylammonium chloride NaDC：sodium deoxycholate NHS：N-hydroxysuccinimide NMR：nuclear magnetic resonance OC：oxalyl chloride

OP：organophosphate

OPD：o-phenylenediamine PA：peptide amphipgile PBS：phosphate buffer saline PCC：pyridinium chlorochromate PDI：polydispersity index

PET：photoinduced electron transfer Ph：phenyl

PMA：Phosphomolybdic acid POC：phosphorus oxychloride

PPTS：pyridinium p-toluenesulfonate SC：sulfuryl chloride

SEM：scanning electron microscope S_NAr：nucleophilic aromatic substitution TC：thionyl chloride

TEA：triethylamine

TEM：transmission electron microscope TFA：trifluoroacetic acid

THF：tetrahydrofuran THP：tetrahydropyran

TLC：thin layer chromatography TP：thiophosgene

UA：uranyl acetate

UV/Vis：ultraviolet/visible spectrum

中文摘要 第一部分

自組裝已被廣泛應用於材料科學、化學和生物學中，作為自下而上建構奈米 至微米等級大小的有序且高度複雜結構的方法。基於先前研究的啟發，本論文設 計並合成了由 3-HF 或 DBD 和雌二醇組成的一系列螢光探針：HF-7α-Gly-EDIOL、

HF-7α-U-EDIOL、DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL，進一步探討若在 連接雌二醇和螢光團的連接鏈上作修飾，對分子光物理性質和自組裝行為的影響。

此外，選擇的螢光團 3-HF 或 DBD 為對環境高度敏感的螢光團，通過探測 3-HF 的 ESIPT/ESICT 螢光強度比或 DBD 的螢光強度變化，可以推測出超分子奈米結構 的形態。透過動態光散射、表面電位和穿透式電子顯微鏡成像的實驗，可以確認 這些聚集的形態。

在不同比例 DMSO/H₂O 溶劑中之螢光測試結果發現，HF-7α-Gly-EDIOL、

HF-7α-U-EDIOL、DBD-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-U-EDIOL 這四個分子均有螢 光反轉的現象，初步推測分子發生了聚集。由 DLS 和 TEM 實驗結果可進一步得 知，HF-7α-Gly-EDIOL 聚集結構為球狀，但彼此交聯在一起，大小約 70-400 nm；

HF-7α-U-EDIOL 只觀測到大小不一的不規則形狀 (類圓球狀)，尺寸直徑約落在 80 nm 左右；DBD-7α-Gly-EDIOL 聚集為不規則形狀，一樣也是彼此交聯在一起，

而交聯狀匯集處呈類圓球狀，大小約小於 100 nm；DBD-7α-U-EDIOL 聚集為完美 的球狀，大小較為均一，約為 135-160 nm。結果顯示在連接鏈上修飾甘胺酸 (Gly) 和尿素 (U) 這兩個基團則是影響分子在水中傾向聚集的能力。由細胞實驗結果可 知 ， 相 較 於 連 接 鏈 修 飾 上 尿 素 基 團 的 分 子 ， 連 接 鏈 修 飾 上 甘 胺 酸 之 HF-7α-Gly-EDIOL 和 DBD-7α-Gly-EDIOL 均能進入細胞，且大多分布在細胞質當 中，反映這兩個分子在生物上的應用是具有潛力的。

關鍵詞：自組裝、奈米結構、雌二醇衍生物、3-HF、DBD

第二部分

光氣是一種無色且劇毒的氣體，暴露於光氣會造成嚴重的急性呼吸道作用，

包括非心源性肺水腫，肺氣腫和死亡。鑑於其強大的殺傷力和大規模工業用途，

光氣幾乎對公共衛生安全構成嚴重威脅，不僅是因為恐怖分子潛在的使用，也因 工業事故造成的意外釋放。因此，為了保護公眾健康和安全不受光氣的傷害，發 展能有效且快速偵測低於安全濃度之光氣的螢光探針具有重要意義。本論文中，

使用乙二胺作為識別部分和 7 號位置有取代的 DBD 單元作為螢光團的部分，開發 出具有低至 12.2 nM 的偵測極限和小於 5 分鐘的反應時間之新型光氣探針 7-EDADBD。該探針和光氣進行加成-離去和分子內環化反應後，可得到產物 7-IDBD，其最大吸收和放射波長均藍移，螢光強度有 15.6 倍 (在 ACN 溶劑中) 或 5.3 倍 (在 DCM 溶劑中) 的增強。此外，和其他類似反應性之有毒化學物質相比，

7-EDADBD 對於光氣具有顯著的選擇性。

關鍵詞：光氣、乙二胺基團、分子內環化、DBD、螢光探針

Abstract

Part I.

Self-assembly has been widely used in materials science, chemistry, and biology as a bottom-up approach to create ordered structures at the nanometer to micrometer scale with high complexity. Inspired by our previous findings, this thesis would focus on the effects of linker linking the fluorophore and estradiol on the photophysical properties and self-assembly behaviors should be further investigated. Moreover, two environmentally sensitive fluorophores such as 3-hydroxyflavone (3-HF) and 4-sulfamonyl-7-aminobenzoxadiazole (DBD) having emission properties that are highly sensitive to their immediate environment were chosen to incorporated into the molecular designs respectively. Accordingly, a series of fluorescent probes HF-7α-Gly-EDIOL, HF-7α-U-EDIOL, DBD-7α-Gly-EDIOL, and DBD-7α-U-EDIOL consisting of either 3-HF or DBD and estradiol were designed and synthesized. By probing the ESIPT/ESICT fluorescence intensity ratios of 3-HF or the fluorescent intensity changes of DBD, the morphology of the supramolecular nanostructures can be speculated. In the combination of DLS, zeta potential, and TEM images, the morphologies of the aggregates can be confirmed.

The fluorescence spectra of HF-7α-Gly-EDIOL, HF-7α-U-EDIOL, DBD-7α-Gly-EDIOL, and DBD-7α-U-EDIOL showed fluorescence reversal in different proportions of DMSO/H2O solvents. Based on these observation, the aggregates with the fluorophore pointed inward were speculated. DLS and TEM experiments further confirmed that the aggregates of HF-7α-Gly-EDIOL are cross-linked spheres with a diameter of 70-400 nm; the aggregates of HF-7α-U-EDIOL are irregular sphere with the size of about 80 nm; the aggregates of DBD-7α-Gly-EDIOL are irregular shapes, while cross-linked area are spherical, with

the size of less than 100 nm; the aggregates of DBD-7α-U-EDIOL are perfect globular with uniform size and a diameter of about 135-160 nm. In summary, the results indicate that modifying Gly or Urea functional groups on the linker would affect the aggregate ability of molecules in the water. In the cell imaging experiments, HF-7α-Gly-EDIOL and DBD-7α-Gly-EDIOL containing Gly linker were able to enter the cells and were mostly distributed in the cytoplasm. Its reveals that the potential application of these two molecules in biology.

Keywords：self-assembly, nanostucture, estradiol derivative, 3-HF, DBD

Part II.

Phosgene is a corlorless and highly toxic gas. Exposure to phosgene has severe acute respiratory effects, including noncardiogenic pulmonary edema, pulmonary emphysema, and death. In light of its strong lethality and large-scale industrial use, phosgene virtually poses a serious threat to public health safety, not only because of its potential use by terrorists, but also because of its unexpected release during industrial accidents. Therefore, developing an efficient fluorescent probe for facile and rapid detection of phosgene with concentration below the safety margin is of great significance for protecting public health and safety from the chance of exposing harmful phosgene. Herein, a new type of phosgene probe 7-EDADBD with a detection limit down to 12.2 nM and response time of less than 5 min was developed. The probe

consisting of ethylenediamine as the recognition moiety and 7-substituted DBD unit as the fluorescence signaling component. It undergoes sequential phosgene-mediated addition-elimination reaction and intramolecular cyclization with fast rate, yielding a product 7-IDBD with blue-shifts in the absorbance and emission spectra as well as 15.6-fold (ACN) or 5.3-fold (DCM) fluorescence enhancement. Furthermore, 7-EDADBD displayed remarkable reactivity toward phosgene over other similarly reactive toxic chemicals.

Keywords ： phosgene, ethylenediamine group, intramolecular cyclization, DBD, fluorescence probe

第一部分

合成 3-羥基黃酮雌二醇螢光探針並探討連接子對於分子光物理性質及

自組裝行為的影響

第一章 緒論

1987 年其中一位諾貝爾化學家得主 Jean-Marie Lehn 曾說過一句話「不論是無

生命的物質或是生命體本身，都是由分子或分子間的相互作用力所構成。」表明 宇 宙 萬 物 都 是 分 子 所 組 成 ， 也 揭 開 以 分 子 間 作 用 力 為 核 心 之 「 超 分 子 化 學 (supramolecular chemistry) 」^1,2,3 的序幕。以往化學家大多針對共價鍵的生成與破 壞，進行化學變化的研究，也造就種類多如恆河沙數的分子，而超分子化學則是 專注於分子間的非共價作用 (noncovalent interactions) ，並控制分子間的作用力，

依自然界中熱力學最穩定之狀態，自發性組成超分子結構。超分子化學涵蓋領域 甚廣，包括分子自組裝 (molecular self-assembly)、分子辨識 (molecular recognition)、

4摺疊 (folding)、主-客體化學( host-guest chemistry) 等。而分子自組裝的核心是源 自於分子辨識，唯有透過分子辨識，超分子自組裝系統才能表現出特定選擇性結 合組裝的功能。自組裝已經廣泛應用於材料科學、化學和生物學上，作為自下而 上 (buttom up) 製造奈米至微米等級大小的有序且高度複雜結構的方法。

1.1 自組裝概念之簡介及其應用

分子自組裝普遍存在於化學，材料科學和生物學中。^5,6分子晶體 ⁷、膠體 ⁸、 雙層磷脂質⁹、相分離 (phase-separated) 的聚合物¹⁰和自組裝單層¹¹的形成都是分 子自組裝的實例，而生物體內多肽鏈折疊成蛋白質¹²或核酸折疊成其功能形態，¹³ 甚至配體與受體的結合也是自組裝的一種形式。¹⁴ 自組裝、分子識別、錯合 (complexation)，以及其他由散亂的分子組成有序排列分子的過程之間的語義界限，

會隨著使用者的想法而擴大或縮小。

1.1.1 影響自組裝形成之因素

歷史上自組裝的概念來自研究分子的過程，分子系統中自組裝成功與否由系 統的五個特徵決定：¹⁵

(1) 組件 (components)：自組裝系統由一群彼此相互作用的分子或大分子片段組成，

這些分子或分子片段可以相同或不同，而這些分子間的相互作用導致系統從較不 有序的狀態 (溶液、散亂聚集體或隨機螺旋) 到更有序的最終狀態 (晶體或折疊的 大分子)。

(2) 交互作用 (interactions)：自組裝發生在組件之間存在淨吸引力和平衡分離 (equilibrium separation) 時，而平衡分離通常代表吸引力和排斥之間的平衡，如圖 1-1 (a) 所示。這些相互作用力通常較弱 (即與熱能相當) 且為非共價作用力，例 如氫鍵 (hydrogen-bonding)、凡得瓦力 (van der Waals)、庫侖靜電作用力 (coulomb electrostatic interaction) 、 π-π 堆 積 (π-π stacking) 或 疏 水 作 用 力 (hydrophobic interaction) 等，整理如表 1-1 所示，但相對較弱的共價鍵 (配位鍵) 被認為越來越 適合於自組裝。^16,17自組裝組件之間的形狀互補性也至關重要。

(3) 可逆性 (reversibility)：自組裝為了可以產生有序結構，其過程必須是可逆的，

或必須允許組件在聚合體內可以調整它們的位置。若組分 (藍色) 之間相互作用是 不可逆的，則組分之間一旦黏附便無法再作調整，故形成不規則排列的玻璃 (綠色)；

若組分之間相互作用是一個平衡狀態，並在接觸後可以調整其位置，便可形成較 低能量的有序晶體結構 (紅色)，如圖 1-1 (b) 所示。

(4) 環境 (environment)：分子的自組裝通常在溶液中或在界面處進行以允許組件所 需的運動，組件與環境的相互作用會嚴重影響自組裝的過程。

(5) 集體運輸和攪拌 (mass transport and agitation)：為了自組裝發生，分子必須是 可移動的。在溶液中，熱運動提供了使分子接觸所需移動的主要部分。在奈米尺 度、微觀和巨觀的自組裝系統中，組分之間的相互作用和在分子系統中類似，而 在設計這種系統時，第一個挑戰往往是確保組件的移動性，隨著它們變得比分子 大，布朗運動變得無關緊要，而重力和摩擦力則變得重要，故組件之間交互作用 的選擇 (也就是選擇允許系統接近平衡的交互作用) 也很重要。

表 1-1 分子自組裝之主要非共價作用力強度。¹⁸

圖 1-1 (a) 分子之間吸引力和排斥力關係圖。(b) 不可逆聚合和可逆有序自組裝之 間本質區別之示意圖。¹⁵

自組裝在科學上是有趣的和技術上是重要的原因至少有四個：第一，它 在生活中是非常重要的，細胞中含有許多驚人且複雜的結構，例如脂質膜、折疊 的蛋白、結構化核酸、蛋白質聚集體，分子機械以及通過自組裝形成的許多其他 結構。¹⁹第二，自組裝為一系列具有規則結構的材料提供了路線，如分子晶體、²⁰ 液晶、²¹半結晶和相分離的聚合物²²等。第三，自組裝也廣泛地發生在大於分子的 結構體系中，並且在材料和凝聚物科學中具有很大的潛力。²³第四，自組裝似乎提 供了現在可用於產生奈米結構的最普遍策略之一。因此，自組裝在化學、物理、

生物、材料科學、奈米科學和製造領域都具有重要地位，通過這些領域之間概念 和技術的交換，自組裝的發展和應用想必會更深更廣。

1.1.2 兩性分子的堆積參數和自組裝形態

兩性分子是具有親水端和疏水端 (親油) 的化合物，在傳統的兩性分子中，親 油部分通常由長烴鏈 (hydrocarbon chain) 組成 (飽和或不飽和)，而親水部分可以 是離子的或非離子的，非離子親水基團通常為聚醚 (polyether) 或多羥基單元 (polyhydroxyl units)；陰離子 (anionic) 親水基團通常為羧酸鹽 (carboxylate)、硫酸 鹽 (sulfate)、磺酸鹽 (sulphonate) 和磷酸鹽 (phosphate)；陽離子 (cationic) 親水基 團通常為四級銨鹽 (quaternary ammonium)。由於它們兩性 (amphiphilicity) 的性質 (或表面活性)，兩性分子中極性頭端與水相互作用，而非極性親脂鏈將在界面上移 動 (或是在空氣中和在非極性液體中），在這種情況下，破壞界面處的內聚能有利 於兩性分子的分散相與選擇性溶劑之間的微相分離 (microphase separation)，形成 許多較小的封閉界面或微胞狀聚集體。 由於它們降低表面張力的能力，兩性分子 通常稱為表面活性劑 (surfactants)。因此，兩性分子在眾多應用中，如乳化劑、洗 滌劑、分散劑、潤濕和發泡劑等扮演很重要的角色。^24,25

兩性分子自組裝成超分子結構的形狀和尺寸取決於分子本身的幾何形狀和濃 度，還有溶液條件，如溫度、pH 值和離子強度等，其中以親水和親油部分相對體 積比為決定自組裝形態和尺寸之最重要因素。根據 Israelachvili 所提出的臨界堆基 參數 (critical packing parameter，C_pp) 可以預測自組裝的結構形態，²⁶而此參數與 兩性分子本身之關係式為 Cpp = V / (a0lc)，其中 V 是聚集核心中疏水鏈佔有的有效 體積，a₀是親水頭端在聚集界面處的有效表面積，l_c是整體分子的最大有效長度 (臨 界鏈長度)。若 Cpp＜1/3 時，兩性分子傾向形成球狀微胞 (spherical micelles)；若 1/3＜C_pp＜1/2 時，傾向形成圓柱狀微胞 (cylindrical micelles)；若 1/2＜C_pp＜1 時，

傾向形成球狀囊泡 (spherical vesical)；若 Cpp = 1 時，傾向形成平面雙層 (planar bilyer)；若 C_pp＞1 時，則傾向形成反微胞 (reversed micelle) 的聚集，如圖 1-2 所 示。¹⁸控制形狀提供了開發和操縱奈米結構的可能性。以這種方式發展出許多功能 系統，可以在不同的科學領域找到廣泛的技術應用。

圖 1-2 可由臨界堆積參數 Cpp 預測兩性分子自組裝的結構形態。¹⁸

1.1.3 胜肽 (peptide) 兩性分子所形成之自組裝結構

由於自然界存在的胺基酸擁有多樣性側鏈結構，故許多兩性分子皆引入胺基 酸形成胜肽兩性分子 (peptide amphiphile，PA)，其包含兩個部分：具有不同長度 的脂肪族疏水性尾端和通過胜肽鍵連接尾端的親水性胜肽序列。在過去二十年中，

已經發展出許多能夠自組裝成微米和奈米尺寸結構的胜肽系統，所形成自組裝結

構被胜肽骨架之間的氫鍵作用力、兩性分子的親疏水作用力或胺基酸側鏈上芳香 環部分的π-π 堆疊的組合來穩定。其中氫鍵作用力最能促進分子自組裝，而胺基酸 中又以甘胺酸 (glycine，Gly) 為基礎的兩性分子最容易被用來研究氫鍵作用力對 於分子自組裝的影響，因為其為二十個胺基酸中最簡單的分子，並無其他側鏈且 為非掌性 (achiral)，不像其他胺基酸含有胺基、胍基或芳香環側鏈，可能會有其他 作用力影響分子自組裝。2006 年 Hartgerink 教授及其研究團隊設計一胜肽兩性分 子 (peptide amphiphile，PA)，²⁷疏水端為十六個 C 的烷基鏈，親水端為五個胺基 酸形成的胜肽鏈，其中 RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser) 為一具生物活性的黏附 (adhesion) 序列，會與細胞表面上之整合素相互作用而影響細胞內信號的傳遞，而這兩端由 七個 glycine 胜肽鏈作為 linker 連接，如圖 1-3 所示，原本分子會藉由分子間親疏 水作用力和 glycine 之間形成的氫鍵網絡自組裝形成奈米絲狀結構，²⁸而通過選擇 性在不同位置的 glycine 上進行甲基化，阻擋 (block) 氫鍵的提供，僅留下一定數 量的氫鍵，研究和評估氫鍵對奈米絲狀結構的形成和自組裝結構穩定性及整體形 態的影響。

圖 1-3 由七個 glycine 組成的胜肽鏈作為 linker 連接親疏水端的胜肽兩性分子結構 圖。²⁷

調整胺基酸序列順序 ²⁹ 或其長度可以明顯的改變系統的結構特性，對於自組 裝結構也會有重大的影響。2002 年 Zhang 教授及其研究團隊發表了一系列類似表 面活性劑的胜肽分子 G_nD₂ (n = 4,6,8,10)，³⁰含有 4-10 個 glycine 作為疏水尾巴和天 門冬胺酸 (aspartic acids) 作為親水頭，分子結構如圖 1-4 (a) 所示，這些胜肽單體

在中性 pH 下在水中會形成奈米管狀和奈米囊狀結構，如圖 1-4 (b) 所示。不同 glycine 尾巴長度對於奈米結構形態會有不同的影響，但因 glycine 骨架彼此之間還 存在氫鍵作用力，造成自組裝過程較為複雜，故影響程度較無規律性，所形成之 超結構也較難預測。

圖 1-4³⁰ (a) 胜肽單體 GnD2之 3D 空間分佈分子模型 (綠色為碳，白色為氫，紅 色為氧，藍色為氮)，由上到下分別為 G₄D₂、G₆D₂、G₈D₂和 G₁₀D₂，而分子長度 範圍從 G4D2 2.4 nm 至 G10D2 4.7 nm。(b) GnD2自組裝形成奈米管狀 (上) 和奈米囊 狀 (下) 結構模型示意圖 (結構模型直徑分別為 50 和 100 nm)，glycine 為被包覆在 雙層結構內部遠離水的綠色部分，aspartic acids 為外層暴露於水中之紅色部分。

1.1.4 尿素 (urea) 建構單元所形成之自組裝結構

在化學，生物化學和材料科學領域的許多應用中，了解非共價力如何引導自 組裝和折疊結構的形成和穩定性，這一點至關重要。³¹特別令人感興趣的是定向力 (directional forces)，例如氫鍵和金屬-配體相互作用 (metal-ligand interaction)，其可 以預測地將分子組裝成特定結構，包括籠狀 (cages)，膠囊狀 (capsules) 和棒狀 (rods) 等。³² 尿素 (urea) 可以通過其兩個-NH 質子作為氫鍵供體，亦可通過羰基 (C=O) 的孤對電子作為氫鍵受體，彼此之間良好的互補性導致自身結合成穩定持

久的一維氫鍵鏈 (one-dimensional hydrogen-bonded chains)，如圖 1-5 (a) 所示。³³ 尿素-尿素氫鍵作用力被證明是可靠且可預測的自組裝驅動力。1990 年 Etter 教授 及其研究團隊最先通過 X 射線晶體學 (X-ray crystallography) 確認尿素的堆疊模 式，並製定了一套預測其組裝模式的經驗指南。³⁴ Lauher 和 Fowler 教授及其研究 團隊巧妙地設計出二維氫鍵網絡，³⁵通過羧酸和尿素基團兩者之間的互補性，合成 了一系列由尿素氫鍵鏈和羧酸二聚體正交連接形成的層狀結構，如圖 1-5 (b) 所示。

Wuest 教授及其研究團隊報導了由尿素-尿素氫鍵組裝成的三維骨架，³⁶通過仲丁基 (sec-butyl) 取代的四個尿素組成一具手性的分子，組裝形成四方多孔 (tetragonal porous) 結構，如圖 1-5 (c) 所示。

圖 1-5 (a) 尿素一維氫鍵鏈結構。³³ (b) 由尿素氫鍵鏈和羧酸二聚體正交連接形成 的二維層狀結構。³⁷ (c) 上圖為仲丁基取代的四個尿素組成一具手性分子之結構，

下圖為手性分子由尿素-尿素氫鍵組裝成的三維四方多孔結構。³⁷

由於尿素-尿素之間可形成一、二、三維的氫鍵網絡，藉由使用不同數量或調 整尿素所在位置等方法，可以建構出許多可預測的自組裝結構，目前尿素建構單

位已被用於製造柱狀 (columns)、絲狀 (fibers)、片材 (sheets)、膠帶 (tapes)、膠囊 狀 (capsules) 和凝膠狀 (gels) 等結構。^37,38 而有另一群研究者是將尿素引入 (incorporate into) 一個簡單的建構單元，由兩個尿素基團和兩個 C 形 (C-shape) 間 隔鏈 (spacer) 組成一大環雙尿素 (macrocyclic bis-urea) 分子，³⁹藉由兩個相反平 行的尿素分子提供建構單元間氫鍵作用力，自組裝形成一空心柱狀 (pillars) 結構，

如圖 1-6 所示，^37,40而圖中也列出一些較具代表性的大環雙尿素分子和這些分子間 藉由氫鍵自組裝成空心柱狀之結構。而這種多孔材料已被證明可用作吸附劑、分 離載體或反應模板，也適用於奈米流體、催化和儲存活性物質如氣體和試劑。³⁹

圖 1-6 大環雙尿素建構單元 (左上) 與自組裝形成空心柱狀結構 (左下) 示意圖。

一系列代表性的大環雙尿素分子結構 (右上) 和其所對應的自組裝結構 (右下) 示 意圖。^37,40

1.1.5 生物活性建構單元所形成之自組裝結構及其應用

具有生物活性功能分子的超分子奈米結構已被積極探索，並可作為生物技術 領域中有希望的材料。這類生物材料如此受歡迎的主要原因是它們為奈米尺寸，

從生物系統的角度來看，奈米等級的物體比大部分細胞都小得多，尺寸上相似於 亞細胞組分 (蛋白質和 DNA)、細胞胞器 (粒線體、溶酶體、核醣體和細胞骨架) 和

微生物 (病毒)。而大部分真核細胞的直徑約在數十微米左右，因此這些亞微米等 級的生物材料可被看做生物奈米結構。也因為他們很小，奈米尺度結構研究已成 為增長最快的科學領域之一，此結構在許多領域中的應用潛力也是無限的。

具有生物活性的合成奈米結構是由功能性的建構單元體 (functional building block，亦即組成的化合物) 組裝而成，而此建構單元體包含三部分：具有生物活 性部分 (bioactive function segment) 、自組裝部分 (self-assembling segment) 和連 接這兩部份之連接鏈 (linker)。不同的建構單元體於水溶液中可藉由單一非共價鍵 作用力或其組合自組裝成不同形態的奈米結構，如奈米片狀 (nano-sheet)、β-帶狀 (β-ribbon)、囊狀 (vesicle)、微胞狀 (micelle) 與圓柱狀 (cylinder) 等，如圖 1-7 所 示。⁴¹這種由下而上 (bottom-up) 的自組裝過程，可將眾多的生物功能性分子分散 至奈米結構表面上，具有多價效應 (multivalent effect，MVE)。多價效應通常定義 為與單個生物活性分子給出的貢獻總和相比，多個生物活性分子連接到同一骨架 上之單位化合物所引起的生物反應較大，舉例來說，若單一分子所能達到的抑制 作用為 1，四個單一分子單獨作用之抑制作用為 4，但接在同一骨架上之四個單一 分子的抑制作用卻為 200，如圖 1-8 所示。⁴²

圖 1-7 具有生物活性功能分子組成 (上端紅色為具有生物活性之基團，中端綠色 為連接鏈，下端橄欖綠為自組裝功能基團) 和其藉由非價作用力自組裝成不同的奈 米結構示意圖。⁴¹

圖 1-8 多共價效應示意圖。⁴²

依據不同生物活性的需求，可將建構單元體中生物活性部分置換成不同基團，

如多肽 (polypeptide)、蛋白質 (protein) 和碳水化合物 (carbohydrates) 等。2010 年 Hamachi 教授及其研究團隊將會和蛋白質結合的配體 (ligand) 作為生物活性部 分，螢光團作為自組裝部分，改變不同配體或螢光團，形成一系列能偵測特定蛋 白質之 turn-on 螢光探針。⁴³螢光單體在水溶液中會聚集成螢光團朝內的自組裝結 構，此時螢光團因聚集而造成螢光淬滅 (signal off)，當配體和目標蛋白藉由蛋白 質-配體作用力 (protein-ligand interaction) 結合時，會使自組裝結構崩解導致螢光 增強 (signal on)，如圖 1-9 所示。這些具有自組裝功能之超結構不僅可以運用在蛋 白質偵測上，也可以運在在小分子偵測、藥物傳遞或基因傳遞等生物領域上。

圖 1-9⁴³ (a) 自組裝 turn-on 螢光探針偵測特定蛋白之感測機制示意圖。(b) 一系 列蛋白質螢光探針之分子結構。

1.2 類固醇之簡介與其自組裝之應用

除了前面章節提及含有胺基酸和尿素基團之自組裝結構外，也可以利用具有 生物相容性之類固醇作為建構單元體中自組裝部分，形成許多不同型態之超結構。

類固醇為自然存在之分子，存在於所有動植物中，並且在生物系統中扮演許多重 要的角色，且類固醇分子傾向聚集的特性，能廣泛的應用在自組裝材料當中。

1.2.1 類固醇結構和種類

類固醇 (steroids) 是廣泛分佈於生物界一大類重要的有機分子之總稱，存在於 植 物 、 動 物 與 菌 類 中 ， 其 種 類 繁 多 且 功 能 各 異 ， 但 均 具 有 環 戊 烷 多 氫 菲 (cyclopentanoperhydrophenanthrene) 的共同基本結構，是由三個六碳環己烷 (A、B、

C 環) 和一個五碳環戊烷 (D 環) 組成的十七個羰之環狀化合物，此種四環核心的 結構與環上各原子的標號法如圖 1-10 (a) 所示。各種類固醇化合物主要區別在環 的立體化學、環中雙鍵、羥基或其他官能基的分佈，以及 17 號位置上的不同側鏈 (R)。3 號位置上通常有羥基或酮基，18 號位置的碳並非類固醇所共有。環戊烷多 氫菲上含有六個立體中心 (stereocenter)，各取代基與碳環之間以及環與環間均可 有不同的立體結構，A/B 環之間可為順式 (cis) 或反式 (trans) (唯一例外是雌性激 素分子 A 環是芳香環為一平面結構)，而 B/C、C/D 環均以反式為主，如圖 1-10 (b) 所示，其中以所有立體中心均為反式的異構物 (all-trans isomer) 最為常見，結構 較具平面性 (planarity) 與剛性 (rigidity)。⁴⁴

圖 1-10 (a) 類固醇結構與碳數編號。(b) 類固醇中 A/B 環為反式或順式之結構。

類固醇 (steroid) 是屬於脂類的一種，現時從植物、動物及真菌中確認的有數 以百種的類固醇。在人類生理及藥理上，最重要且最為人熟知的類固醇是膽固醇，

其在細胞的多項功能中擔任不可或缺的角色，作為構成動物細胞膜的普通元素，

也是脂溶性維生素與類固醇荷爾蒙的前驅物。大部分類固醇均由膽固醇轉化而來，

不同的激素，包括脊椎動物的性激素，都是由膽固醇建立的類固醇。在血液中，

類固醇負責運送蛋白質，但在生物系統中，類固醇最重要的角色是作為激素，類 固醇激素與其受體蛋白質結合以產生生理反應，引發基因轉錄及細胞功能的改變。

類固醇激素依功能主要區分為三類：⁴⁵

(1) 腎上腺皮質素 (adrenocortical hormones)：又分為醣皮質激素 (glucocorticoid) 和礦物皮質激素 (mineralocorticoids)。醣皮質激素主要調節新陳代謝及免疫系統，

也是醫院常用的抗發炎藥物之成分，而礦物皮質激素則是維持血液量及控制腎臟 排出電解質。

(2) 性激素 (sex hormones)：又分為雌性激素 (female sex hormones；estrogens) 和 雄性激素 (male sex hormones；androgens)，主要功能是控制人體第二性徵之發育。

(3) 神經類固醇 (neurosteroids)：主要在腦部合成，影響許多腦部的功能，包括神 經內分泌 (neuroendocrine) 和行為能力。⁴⁶

於女性身體合成之雌性激素又分三種，分別為雌激素酮 (estrone，E₁)、雌二醇 (17β-estradiol，E2)、雌三醇 (estriol，E3)，結構如圖 1-11 所示，其中又以雌二醇活 性最強，雌激素酮和雌三醇均為雌二醇之代謝產物

圖 1-11 具生理活性之雌性激素結構。

1.2.2 類固醇衍生物之自組裝介紹

類固醇是廣泛存在的天然物，不僅具有生物相容性，其分子本身平面性、剛 性與疏水性結構有助於類固醇之間的堆疊，藉由偶極-偶極作用力 (dipole-dipole interaction) 和凡得瓦力，形成類固醇-類固醇堆疊結構，⁴⁷ 若在四環核心上修飾其 他官能基能增加分子間的作用力 (通常為氫鍵或 π-π 堆疊)，或改變分子整體極性，

會影響形成聚集的自組裝方式。⁴⁸其中以類固醇中之膽固醇為基礎的自組裝材料最 被廣為研究。

1989 年 Weiss 教授及其研究團隊首位合成以膽固醇為基礎的低分子量化合物，

49 由修飾過的連接鏈 (linker，L) 連接芳香環 (aromatic moiety，A) 和類固醇 (steroidal group，S) 組成一具有自組裝能力的分子系統 (ALS)，此後便有大量研究 投入此系統中，甚至衍生出此系統二聚體 (A(LS)₂) 或連接鏈兩端皆為類固醇基團 (LS2) 的分子結構，如圖 1-12 所示。

圖 1-12 以膽固醇為基礎的分子 ALS、A(LS)2和 LS2組分示意圖。⁴⁹

雙組分 (two-component) 自組裝系統近來越來越受到關注且發展迅速，這個 領域的第一次嘗試在 1990 年代末期被報導，他們主要是基於宿主-客體 (host–guest) 複雜的相互作用來顯著地改變組分的自組裝能力。⁴⁸現今，該領域更傾向研究分子 的自組裝能力可以通過向系統中添加其他分子來進行微調，而兩個分子的相互作 用還是以氫鍵為主，但當然也可以其他作用力作為自組裝的驅動力或輔力，如π-π

堆 疊 或 靜 電 作 用 力 等 。 2009 年 Yue 教 授 及 其 研 究 團 隊 利 用 1- 萘 胺 鹽 酸 鹽 (1-naphthylammonium chloride，NA) 和脫氧膽酸鈉 (sodium deoxycholate，NaDC) 形成一離子自組裝 (ionic self-assembly，ISA) 系統，⁵⁰如圖 1-13 (a) 所示，兩個分 子具有相反電荷的親水端，可以通過庫侖吸引力結合，而系統親水性會因為形成 NA-DC 錯合物而下降，再藉由 NADC 分子類固醇骨架的疏水性和骨架上兩個羥基 形成的氫鍵網絡，在低溫 (5 ℃) 水溶液環境中會自發形成固體樣囊泡 (solid-like vesicles)，如圖 1-13 (b) 所示，隨著溫度增加囊泡狀結構會轉變為奈米帶 (nanobelts) 結構，如圖 1-13 (c) 所示。因此，通過簡單地改變 ISA 系統中不同的構建模塊，

可以發展出許多不同結構和功能的獨特有機-無機奈米材料。

圖 1-13 (a) NA 和 NADC 分子結構圖。(b) NA 和 NADC 分子於 5 ℃下自組裝結 構之 TEM 圖。(c) ISA 系統自組裝模式示意圖和 NA 和 NADC 分子於室溫下自組 裝結構之 TEM 圖。⁵⁰

除了分子本身結構會影響自組裝結構外，通過改變分子本身所在環境條件，

如溶劑組成、溫度、pH 變化、金屬配位、光照射等也可以調控分子自組裝。2016 年 Yang 教授及其研究團隊發表的分子 POM-Chol，⁵¹在不同溶劑組成下會有不同

的自組裝結構，在 DMF/Toluene 溶劑中為三維絲狀網絡 (3D fibrous network) 結構；

在 CH₃OH/CH2Cl2溶劑中為散亂短絲狀 (short fibrils) 結構；在 Acetone 溶劑中為 奈米片狀 (nanosheets) 結構，如圖 1-14 所示。

圖 1-14 在不同溶劑組成下 POM-Chol 分子自組裝結構示意圖。⁵¹

類固醇結構於自組裝領域上亮眼的表現，但以雌性激素為基礎的分子自組裝 研究卻很少，將類固醇分子修飾上螢光團並藉由螢光變化來觀察超分子結構生成 之研究更是少之又少，這引發我們的興趣並著手於雌性激素螢光衍生物自組裝的 研究，相信雌性激素分子較為平面的結構會使得分子更容易自組裝形成超分子結 構。

1.3 比例 (ratiometric) 螢光團偵測機制

螢光常做為探測或顯像的工具，因螢光訊號具有高靈敏度 (snesitivity)、高特 異性 (specificity)、時空解析度 (temporal-spatial resolution) 佳等優點，在化學、生 物、醫藥或是其他領域上都有廣泛的運用。而螢光輸出種類分為單或雙放射峰兩 種輸出方式，^52,53單放射峰 (single-emission) 螢光輸出是以單波長螢光做為感測依 據，但其螢光強度往往容易受到所使用的感測分子濃度、分析物濃度或儀器的光 源強度等因素影響，或者會因為螢光染劑降解、光漂白 (photobleaching) 而造成訊 號的誤差，且當分析物濃度極低時，也不易判斷螢光強度的變化。因此，為了克

服上述問題，可以使用雙放射峰 (double-emission) 螢光輸出的方式，利用兩個峰 螢光強度的比值 (ratiometric) 達到自我校正 (self-calibration) 的功能。要達到雙放 射峰螢光輸出的方式有幾種機制，⁵⁴分別為激發態分子內電荷轉移、^55,56激發態分 子內質子轉移、^57,58螢光共振能量轉移、55,56,59,60 單體-激態附體之形成等，^55,56 以 下就針對這幾種機制做介紹，並舉例說明如何應用。

1.3.1 激發態分子內電荷轉移 (Excited-state intramolecular charge transfer ， ESICT)

以 ESICT 機制為基礎的探針，其特徵為在同一個分子內含有給電子單元和接 受電子單元，這兩個單元以共軛的方式連接，在激發態時產生推-拉 (push-pull) 的 π 電子系統，常用於陽離子感測上，當陽離子和給電子單元有交互作用，會使得探 針給電子能力下降，造成分子整體能階提升，HOMO 因受到陽離子穩定而上升幅 度較小，而 LUMO 能階上升較多，能階差變大，造成吸收或放射光譜藍位移 (blue shift)；相反的，當陽離子和接受電子單元有交互作用，會使得探針接受電子能力 上升，造成分子整體能階下降，LUMO 因受到陽離子穩定而下降幅度較大，而 HOMO 能階下降較少，能階差變小，造成吸收或放射光譜紅位移 (red shift)，如圖 1-15 所示。

圖 1-15 以 ICT 機制為基礎的探針之給電子基團或接受電子基團與陽離子結合後，

能階差異與光譜偏移示意圖。⁵⁴

1.3.2 激發態分子內質子轉移 (Excited-state intramolecular proton transfer，

ESIPT)

ESIPT 機制通常發生在激發態時，螢光團中的羥基 (-OH) 或胺基 (-NH2、-NH) 的質子快速轉移至羰基 (C=O) 的氧或亞胺 (C=N) 的氮原子上。舉例來說，2-(2'- 羥基苯基)苯並噁唑 (2-(2'-hydroxyphenyl)benzoxazole，HBO) 在基態時傾向以烯醇 (enol，E) 的形式存在，通過分子內六圓環氫鍵穩定其能階，當以 320 nm 波長作 激發，激發態的烯醇 (E^*) 形式相對不穩定，故會進行分子內質子轉移，將分子轉 換為激發態的酮互變異構物形式 (keto tautomer，K^*)，並以此形式放出較長波長的 光 (500 nm) 回到基態 (K) 後，再進行反向質子轉移回到較穩定的烯醇形式，而 部分受激發的分子並未走 ESIPT 路徑，而以烯醇激發態形式放光回到基態，則此 放射光波長較短 (430 nm)，在許多情況下，ESIPT 螢光團都會存在烯醇形式或酮 形式的放射峰，而透過這兩個放射峰相對強度的變化，可以做為比例感測系統的 依據，如圖 1-16 所示。

圖 1-16 以 HBO 分子為例的 ESIPT 機制圖。⁵⁴

1.3.3 螢光共振能量轉移 (Fluorescence resonance energy transfer，FRET)

FRET 機制中通常含有兩個螢光團，其中一個放射波長較短作為給予光子角色 (donor)，另一個放射波長較長作為接受光子角色 (acceptor)，當供體螢光團被激發，

其放射出的能量會以非輻射形式傳遞至受體並被受體吸收，最後以受體螢光形式 釋放能量，如圖 1-17 (a) 所示。待與分析物作用後，FRET 機制會消失，只會放射 出供體螢光團之螢光，如此一來，螢光強度就會有一消一長的變化，達到比例變 化的目的。在螢光共振能量轉移系統，供體的放射光譜和受體的吸收光譜必須部 分重疊，如圖 1-17 (b) 所示，且供體是透過空間 (through space) 將能量傳遞給受 體，故兩個螢光團之間的距離會受到限制，經文獻報導，兩者之間距離須須介於 0.1-10 nm 之間，⁶¹ 除此之外，供體放射和受體吸收的偶極矩位向 (orientation of dipole moment ) 要相符合，才有辦法進行能量的傳遞。

圖 1-17 (a) (b) 供、受體吸收和放射光譜圖。左邊藍色為供體，右邊綠色為受體，

虛線為吸收光譜，實線為放射光譜，中間橙色區域表示供體放射光譜與受體吸收 光譜重疊部分。

1.3.4 單體-激態附體之形成 (Formation of monomer-excimer)

單體 (monomer) 指的是單獨的螢光團，激態複體 (excimer) 是 excited dimer 的縮寫，表示激發態螢光團的二聚體。在單體-激態複體系統中，基本要件為至少 要含有兩個或兩個以上的螢光團，而形成激態複體的反應機構有兩種：一是單體 受光激發後，由基態躍遷至激發態，由於分子間作用力，激發態螢光團會吸引基 態螢光團，當一對螢光團的 π 軌域重疊而產生激態複體，此種方式稱為動態的激 發複體 (dynamic excimer)；另一種是一對螢光團在基態時靠近而成為具有物理作 用的二聚體，吸光後直接躍遷形成此二聚體的激發態，此時激態複體能階較高，

因此會進行結構重組降低能階，此種方式稱為靜態的激態複體 (static excimer)。因 激態複體之能階差較小且沒有振動能階，所以螢光放射光譜之波長較單體長，峰 寬也較寬，如圖 1-18 (a) 所示。⁶² 最常見用來形成激態複體的螢光團為芘分子 (pyrene)，其單體放射峰波長位於 370-380 nm，激態複體放射峰波長則位於 460-480 nm。Schmuck 教授及其研究團隊曾在 2012 年發表以芘分子為基礎的胜肽信號 (peptide beacon) 探針 18，⁶³並會與雙股 DNA 作用，作用前探針分子為摺疊形式 並放出激態複體的螢光 (490 nm)，與 DNA 結合後造成結構上的改變，兩個堆疊的 芘分子被拆散並放出單體的螢光 (406 nm)，監測這兩個放射峰的相對強度 (F406 / F490)，可以比例的方式感測核酸，如圖 1-18 (b) 所示。

圖 1-18 (a) 單體與激態複體螢光放射光譜之比較。⁶² (b) 上圖為探針 18 分子結構；

下圖為探針 18 應用於比例感測 DNA 示意圖。⁵⁴

1.4 3-羥基黃酮 (3-Hydroxyflavone，3-HF) 螢光團之介紹

在 1-3 章節已經介紹過許多比例螢光的放射機制，有利用單一螢光團與分析物 反應前後造成波長變化，來達到比例螢光的目的；也有利用同一個分子內，有兩 個不同放射波長的螢光團，來達到比例螢光的目的，但不同的螢光團即使在相同 環 境 中 ， 也 會 有 不 同 驟 熄 (quenching) 效 果 及 光 分 解 效 應 (effect of photodegradation)，使得無法達到自我校正之功能，故最理想的方法是選用於不同 波長具有兩個以上放射峰的單一螢光團，利用不同波長-螢光比例之變化來達到自