外部體積擴張對脂肪幹細胞增殖、分化潛能及其細胞標記之探討

脂肪幹細胞 (adipose stem cells, ASCs) 是存在脂肪組織中的成體幹細胞，屬於 幹細胞的特定分支 (圖 31)，可視為存在脂肪組織中的間葉幹細胞 (MSCs)。ASCs 具有自我更新與複能性分化能力 (multi-potent differentiation capacity)，可輕易在生 物體擴增，並可體外誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、內皮 表現於 BM-MSCs (De Ugarte et al., 2003; Zuk et al., 2002)，而且 BM-MSCs 僅含有 非常少量 (<1%) 的 CD34⁺細胞，這是與 ASCs 的唯一差異 (Yoshimura et al., 2006)。

此外，ASCs 會隨著培養時間或繼代次數 (passage number) 的增加而改變其表面標 記，例如 CD11, CD14, CD34 和 C45 的表現水平會逐漸減少，反之 CD29, CD73, CD90 和 CD166 的表現水平會增加到第 2 代 (McIntosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006)。ASCs 相較於 BM-MSCs 會表現較高水平的 CD117, HLA-DR 和 CD34 等成 體幹細胞表面標記 (Hamid et al., 2012; Reich et al., 2012)。整體而言，大部分 ASCs 皆會表現 CD13, CD29, CD44, CD63, CD73, CD90 和 CD105 等間葉細胞標記 (mesenchymal markers)，而不表現 CD14, CD31, CD45 和 CD144 等造血細胞標記 (hematopoietic markers) (Tsuji et al., 2014)。然而經體外培養後，ASCs 會顯著增加 CD105 的表現，但有將近一半的 ASCs 會在培養後 2 週失去 CD34 的表現 (Yoshimura et al., 2006)。

先前研究顯示機械力對多種細胞類型之細胞表型，生長速率以及訊息傳遞的 影響，並可誘導間葉幹細胞之硬骨分化和平滑肌分化 (Kurpinski et al., 2006; Park et al., 2004)。然而，尚未對 EVE 作用後的組織所分離出的 SVF 其細胞組成，以及

ASCs 的增殖能力、分化潛能和細胞標記進行評估。因此，本試驗比較不同 EVE 處 理時間 (10 日和 21 日)，對李宋豬脂肪幹細胞的增殖能力、脂肪分化潛能以及細胞 表型進行定量分析。

(Huang et al., 2016) 圖 31. 成體幹細胞不同類型的分支。

Figure 31. Branches of different types of adult stem cells.

3.2.2 材料與方法

3.2.2.1 脂肪幹細胞分離、純化與培養

從李宋豬側腹部取出之皮下脂肪組織，先放入裝有 transport buffer (DMEM 內 含 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, 1.5 μg/ml amphotericin B) 之燒杯中，

再移至無菌操作台之中。首先將脂肪組織上的肌肉和結締組織去除，再以剪刀將組 織剪成小碎塊後以 phosphate-buffer saline (PBS) 進行清洗。然後將脂肪組織放入含 有 0.075% 膠 原 蛋 白 酶 (collagenase) 之 PBS 溶 液 中 (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)，於37℃進行震盪 30 分鐘。膠原蛋白酶分解過後之組織經 過濾至離心管中，於室溫下以 800g 離心 10 分鐘，將懸浮於上層的成熟脂肪細胞 和結締組織移除，而離心管底部的細胞團塊視為 stromal vascular fraction (SVF)，其 中富含脂肪來源之幹細胞 (adipose-derived stem cells)。接著以 20 ml DMEM/F12 10% FBS 培養液將 SVF 細胞沖洗打散，再於室溫以 800g 離心 10 分鐘，重複清洗 2~3 次。將最後一次清洗的細胞混和液以 70 mm 濾網過濾到新的離心管內，並使 總體積為 30 ml，進行細胞計數，每 10 cm 培養皿約 5×10⁵個細胞，於37℃及 5%CO² 進行培養。利用 ASCs 具貼附特性，經培養 24 小時後去除未貼附細胞，可得到更 豐富之 ASCs。本試驗細胞培養液使用 M-199 medium，內含 10%胎牛血清 (fetal bovine serum), 100 UI penicillin, 100 mg/ml streptomycin, 5 μg/ml 肝素 (heparin) 和 2 ng/ml 酸性纖 維母細 胞 生長因子 (acidic fibroblast growth factor) 。初代細 胞

期的一段時間 (t2–t1, Δt)，DT = (t2–t1) × log2 / log(q2–q1)，t2–t1為細胞生長時 間，q2 為對數生長期任意點的細胞觀察值，q1 為對數生長期細胞數初始值，計算 細胞數增加一倍所需時間，並比較三組 (control, 10-day, 21-day treated groups) 的 倍增時間。

細胞聚落形成分析 (colony-forming assay) 為檢測幹細胞增殖能力的另一方式，

首先將初代 (P0) 之 ASCs 利用 6 well 培養皿以 5000 cell/well 培養 7 日。七天後 將形成之細胞聚落進行 giesa stain (Gibco, 10092-013, USA)，每個聚落含有 20 個以 上的細胞才列入計算。

3.2.2.3 脂肪幹細胞體外誘導脂肪分化之分析

將 ASCs 加入脂肪分化誘導培養液 (M-199 medium 內含 10 μM dexamethasone, 0.25 μM 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 4 μM recombinant human insulin, 10 μM troglitazone, 10% fetal calf serum)，每隔 3 天換一次誘導培養液，培養至 21 天進行 油紅染色 (Oil-Red O stain)。染色前先將細胞以 PBS 清洗 2 次，加入含有 10%

formalin 之 PBS 溶液中進行固定 1 小時，再用無菌蒸餾水清洗 3 次，然後加入 Oil-Red O 染劑 (0.6% Oil Oil-Red O dye in isopropanol：water = 3：2) 於室溫染色 1 小時，

過量的染劑以無菌蒸餾水沖洗去除，並將染色細胞進行乾燥。染色的油滴以 isopropanol 含有 4% Nonidet P-40 進行溶解後，再以分光光度計波長 520 nm 進行 定量分析。

3.2.2.4 流式細胞技術分析 (flow cytometry analysis)

本試驗以流式細胞儀鑑定 ASCs 之免疫細胞表現型。將培養中的 ASCs 培養液 去除後，以 PBS 沖洗 3 次，加入 blocking solution (3% serum in PBS) 作用 30 分鐘。

細胞以 trypsin-EDTA 懸浮後取下，將細胞懸浮液以 1200 rpm 離心 5 分鐘。吸去培 養液後，以 washing buffer (49.5 ml PBS, 0.5 ml FBS) 清洗，取 10 ml washing buffer 使細胞團塊重新懸浮，再以 1200 rpm 離心 5 分鐘。將檢測欲使用之抗體 (BD

Biosciences) 與細胞混和 (1 × 10⁵ cells/100 μl)。檢測之抗體分別為 CD29-PE, CD44-PE, CD90-CD44-PE, CD105-PE 與 CD34-PE。將離心管以鋁箔紙包裹避光，置於4℃培養 30 分鐘。之後加入 500 μl washing buffer 重新懸浮，以 2000 rpm 離心 5 分鐘，此 步驟重複兩次。去除上清液後，將細胞團塊加入 500 μl fixing buffer (48.1 ml PBS, 0.5 ml FBS, 1.35 ml formaldehyde) 懸浮後進行流式細胞儀分析 (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA)。

另以多色流式細胞儀 (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) 分析 SVF cells 之 細胞組成。檢測之抗體分別為 anti–CD31-phycoerythrin, anti–CD34-phycoerythrin-Cy7, anti–CD45-fluorescein isothiocyanate (BD Biosciences, San Jose, Calif.)。根據表 面標記表現圖譜之數據計算細胞組成百分比。

3.2.3 結果與討論

3.2.3.1 脂肪幹細胞增殖能力分析

脂肪幹細胞的增殖能力會隨著繼代次數增加而逐漸下降 (Wall et al., 2007)，故 本試驗使用初代 (P0) ASCs 對其增殖能力進行定量分析。首先以平均倍增時間測 量 ASCs 之增殖速率，統計結果顯示三組之間於倍增時間上並沒有顯著差異 (圖 32A)。另外以聚落形成分析 ASCs 之增殖能力，統計結果也顯示 EVE 處理組與對 照之間並無顯著差異 (圖 32B)。此結果表示 ASCs 增殖能力並不會受到外部施加 之機械力所影響，而且與作用時間無關。

圖 32. EVE 處理組與對照組中脂肪幹細胞增殖能力分析。(A) 初代脂肪幹細胞之 倍增時間於各組中並沒有觀察到明顯差異。(B) 每組 5000 個脂肪幹細胞於初始培 養後所形成的聚落數。

Figure 32. Proliferation capacity of adipose stem cells (ASCs) from control and EVE treated groups. (A) Doubling time of P0 ASCs. No difference was noted across all groups.

(B) Number of colonies formed after 7 days of culture at initial plating of 5000 ASCs for each group.

3.2.3.2 脂肪幹細胞成脂分化潛能分析

通常成熟的脂肪細胞已不具有增殖能力，因此脂肪細胞數的增加一般認為是 從脂肪幹細胞或前驅細胞所分化而來 (Kajita et al., 2012)。而最近研究發現 EVE 作 用於小鼠背部表皮每天 2 小時連續 5 天後可明顯增加皮下組織的脂肪細胞數量 (Lujan-Hernandez et al., 2016)。本試驗將 EVE 作用後的組織所分離出的 ASCs 進行 體外脂肪分化誘導 21 天後，以 Oil-red O stain 對 ASCs 脂肪分化潛能進行定量分 析。結果顯示，儘管分化水平在每組之間各有差異，但經過統計之後三組之間呈現 Oil-red O 陽性的細胞所占百分比並沒有顯著差異 (圖 33)。

圖 33. EVE 處理組與對照組中脂肪幹細胞分化潛能分析。

Figure 33. Analysis of differentiation potentials of adipose stem cells from control and EVE treated groupd.

3.2.3.3 脂肪幹細胞表面分子標記 為細胞表面之糖蛋白，可與透明質酸 (hyaluronate)、骨調素 (osteopontin)、膠原蛋 白和 MMPs 交互作用進而參與細胞黏附和遷移 (Goodison et al., 1999)；CD90 (thymus cell antigen-1, Thy-1) 最早發現於小鼠胸腺細胞 (Ades et al., 1980)，除表現 於胸腺細胞和 T 淋巴球，另有許多幹細胞也會表現此抗原，例如間葉幹細胞、造 血幹細胞和角質幹細胞等 (Kisselbach et al., 2009)；CD105 (endoglin) 為 TGF-β 受 體組成之一，在心血管系統的發育和血管重塑中具有作用，另參與細胞骨架組成進 而影響細胞型態和遷移 (Sanz-Rodriguez et al., 2004)；CD34 則常表現於血液和骨 髓來源之前驅細胞，例如造血幹細胞和內皮前驅細胞等 (Sidney et al., 2014)。從圖 中可觀察到 ASCs 的代表性表型分析顯示，ASCs phenotype 的同質性以及 surface marker 的表現模式非常相似。另一方面，從每組分離的 ASCs 顯示與間葉幹細胞具 有共同的 phenotype，而且和 EVE 作用時間無關。也就是說，無論處理時間長短，

ASCs 同樣表現 CD29, CD44, CD90 和 CD105 等間葉細胞的 markers，而缺少 CD34 造血細胞 marker 的表現 (圖 34)。根據 Pittenger 研究團隊於 1999 年發表之文獻中 表示，人類 MSCs 的特徵在於其表面上存在特定標記蛋白，包括 CD29, CD44, CD71, CD90 和 CD105，以及缺乏白血球和造血細胞之標記蛋白，包括 CD14, CD34 和 CD45 (Pittenger et al., 1999)。說明李宋豬 ASCs 與人類 MSCs 所表現之標記蛋白非 常相似。

圖 34. 流式細胞技術分析脂肪幹細胞之表面標記。脂肪幹細胞的免疫表型顯示每 組表面標記的表現模式非常相似。流式細胞儀分析顯示 CD29, CD44, CD90 和 CD105 的表現處於高水平，CD34 的表現處於較低水平。

Figure 34. Flow cytometry analysis of surface marker expression of ASCs.

Immunophenotype of adipose stem cells (ASCs) of each group revealed very similar expression patterns of surface markers. Flow cytometry analysis showed the expression of CD29, CD44, CD90, and CD105 were at high levels and the expression of CD34 was at a lower level.

3.2.3.4 基質血管細胞之細胞組成

將脂肪組織以 collagenase 分解後並經由離心去除成熟脂肪細胞與結締組織，

最後沉澱在離心管底部的細胞團塊視為基質血管細胞 (SVF cells)。SVF 由許多異 質細胞群組成，包括脂肪和造血幹細胞及其前驅細胞、內皮細胞、紅血球、纖維母 細胞、淋巴細胞、血管外膜細胞、單核球與巨噬細胞等 (Cawthorn et al., 2012; Han et al., 2010)。本試驗使用多色流式細胞儀分析 SVF 之細胞組成，首先分為 CD34⁺

&CD45⁺ 血液來源細胞與 CD34^- & CD45^- 脂肪來源細胞，後者進一步分為 CD31⁺

& CD34⁺ 內皮細胞, CD31^- & CD34⁺ 脂肪幹細胞, CD31^- & CD34^- 其它細胞 (纖維 母細胞、壁細胞和血管外膜細胞等) (圖 35A)。CD45 為白血球之共同抗原，CD31 (PECAM-1) 大量表現於內皮細胞。CD34 主要表現於造血幹細胞及其前驅細胞，

但已有許多研究表明 CD34 同樣表現於其它類型細胞，例如間葉細胞、間質樹突狀 細胞 (interstitial dendritic cells)、角質細胞及內皮前驅細胞等 (Lin et al., 2012;

Nielsen and McNagny, 2008)。此外 CD34 也會表現於某些幹細胞，但會因體外培養 而逐漸失去其表現 (Cawthorn et al., 2012; Sidney et al., 2014)。

比較 EVE 處理對各類型細胞於 SVF 占有百分比之影響；蓋統計結果顯示三組 之間 ASCs 比例並沒有明顯差異 (對照組：5.0 ± 1.9%，10 天處理組：5.6 ± 2.5%，

21 天處理組：4.8 ± 2.3%) (p > 0.05)。相反地，EVE 處理組當中的內皮細胞所占百 分比會隨著作用時間延長明顯增加 (對照組：8.1 ± 1.9%，10 天處理組：15.2 ± 3.0%，

21 天處理組：20.3 ± 3.8%) (*p<0.05, **p<0.01) (圖 35B)。

另外計算各組中每克脂肪所含 SVF 細胞和 ASCs 的數量，統計結果顯示三組 之間基質血管細胞和脂肪幹細胞的總數沒有顯著的差異 (圖 35C)。

圖 35. 多色流式細胞儀分析基質血管細胞之細胞組成。(A) 使用多色流式細胞儀 分析 SVF 細胞之代表性繪圖數據。(B) 各組間 ASCs 的比例無差異，而 EVE 處理 組中內皮細胞的百分比與對照組相比有顯著增加（每組樣本數= 6；*p < 0.05 相較 於對照組，**p < 0.01 相較於對照組，p < 0.05 相較於 10 天處理組。(C) 脂肪幹細

圖 35. 多色流式細胞儀分析基質血管細胞之細胞組成。(A) 使用多色流式細胞儀 分析 SVF 細胞之代表性繪圖數據。(B) 各組間 ASCs 的比例無差異，而 EVE 處理 組中內皮細胞的百分比與對照組相比有顯著增加（每組樣本數= 6；*p < 0.05 相較 於對照組，**p < 0.01 相較於對照組，p < 0.05 相較於 10 天處理組。(C) 脂肪幹細