機械力與間葉幹細胞分化

間葉幹細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 屬複能性幹細胞 (multipotent stem cells)，具自我更新 (self-renew) 能力，可分離自骨髓、脂肪、肌腱、周邊血 液、骨骼肌等組織，並可體外誘導分化為源自中胚層的細胞系包括脂肪細胞、成骨 細胞、軟骨細胞、心肌細胞和平滑肌細胞等，此外也可轉分化為其它胚層細胞，例 如源自外胚層的神經細胞以及源自內胚層的肝細胞和胰臟細胞 (Zhang et al., 2012)。

幹細胞之分化命運決定於細胞所存在之微環境，包括可溶性因子、細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 以及相鄰細胞之間的相互協調作用，可提供細胞能夠增 殖、存活、遷移或分化的生物化學和機械訊號。此外，表面粘附受體，例如整聯蛋 白 (integrins) 和鈣粘素 (cadherins)，可分別調節細胞黏附於 ECM 骨架與鄰近細胞 (Li et al., 2011) (圖 14)。在可溶性因子當中，transforming growth factor-β (TGF-β)、

platelet-derived growth factor (PDGF) 和 fibroblast growth factor (FGF) 作為激活素 (activin) 所調節的三種分子訊號參與 MSCs 分化之關鍵途徑 (Ng et al., 2008)。ECM 物理性質包括剛度 (stiffness)、構型 (topography) 和組成 (composition) 可調節細 胞行為。此外，細胞會因應來自微環境中的訊息而採取不同的形狀，進而將產生的 牽引應力傳遞到相鄰細胞。若施加外部之機械力刺激例如流體剪切應力，可激活細 胞表面的離子通道、異源三聚體 G 蛋白 (heterotrimeric G proteins)、蛋白激酶和其 它膜上之訊息傳遞分子，進而觸發下游之訊息傳遞，導致機械力依賴性 (force-dependent) 之基因表現的變化 (Wang et al, 2009)。

(Li et al., 2011) 圖 14. 細胞微環境調控細胞之命運。

Figure 14. The cellular microenvironment control cell fate.

2.4.3.1 基質剛度引導間葉幹細胞之分化命運 (Substrate stiffness directs MSC fate specification)

從纖維母細胞和其它細胞之力學研究已顯示出細胞感測到 ECM 彈性性質的 重要性 (Paszek et al., 2005)。Engler 研究團隊第一次嘗試評估基質剛度 (stiffness) 對於調節人類間葉幹細胞 (hMSCs) 命運的重要性 (Engler et al., 2006)。他們生成 塗有膠原蛋白之聚丙烯酰胺凝膠 (polyacrylamide gel, PAAG) 作為體外細胞附著 之人工基質，而基質的彈性性質根據化學交聯的程度，從軟性到相對剛性。當培養 基保持相同時，測試各種彈性對 hMSCs 的影響。結果發現細胞命運由基質剛度決 定：當細胞培養於模擬腦組織彈性 (0.1-1 kPa) 的基質時，細胞會表現出神經元表

型；於模擬肌肉之中等剛度 (8-17 kPa) 的基質會表現出肌原性抗原；而於模擬膠 原骨 (collagenous bone) 之相對高剛性 (25-40 kPa) 的基質會表現成骨細胞之抗原 (Engler et al., 2006)。另以微陣列分析 (microarray analysis) 結果顯示各細胞在相應 之基質上，神經元，肌肉或骨骼之表面抗原的表現可增加四至六倍。然而，相較於 分化誘導培養基，此三種細胞之特殊標記表現水平於人工基質僅有其 50%。因此，

儘管基質彈性不足以誘導終末分化，但對於發育早期引導 MSCs 之細胞特化相當 重要。關於分子機制，Engler 等人表示非肌肉肌球蛋白 (non-muscle myosin II, NMMII) 的抑制會阻斷基質彈性所誘導之細胞特化，但不影響細胞其它正常功能，

表示基質剛度可透過不同機制調控定向分化 (directed differentiation) (Engler et al., 2006)。另有研究證實當 MSCs 和基質剛度相似性達最大值時，NMMII 於應力纖維 中的排列非專一性依賴於基質剛度，說明機械耦合 (mechanical coupling) 存在於 外部環境和細胞內部骨架組織之間 (Zemel et al., 2010)。因此微環境剛度調控細胞

基質彈性影響 MSCs 成骨分化是經由 integrin-α2/ROCK/FAK/ERK1/2 路徑 (Shih et al., 2011) (圖 15)。基質上 ECM 彈性 (elasticity) 對 MSCs 產生機械性刺激，

從而誘導 FAs 蛋白活性和重塑之變化 (Du et al., 2011)。FAs 的生長和延長取決於 培養基質的剛度，表示 ECM 彈性可調節 FAs 聚集 (assembly)。Integrins 為細胞重 要之力學感應器 (mechanical sensors)，MSCs 於柔軟培養基誘導β1 integrin 活化的 程度明顯高於堅硬培養基，但是位於細胞膜上的 integrins 卻明顯低於堅硬培養基，

其原因是柔軟的 ECM 會明顯提高 integrin 之內部化 (internalization)，此現象主要 經由 caveolae/raft-dependent 內吞作用 (endocytosis)。Integrin 內部化會抑制 bone morphogenetic protein (BMP) − Smad pathway 而誘導 MSCs 往神經細胞分化；若使 用 caveolae/raft 的抑制劑：methyl- β- cyclodextrin，將會抑制 integrin 內部化進而阻 礙 MSCs 於柔軟基質上分化為神經細胞。柔軟基質抑制 BMP − Smad pathway 部分 是經由 integrins 調節之 BMP 受體的內吞作用 (Higuchi et al., 2013) (圖 16)。

(Shih et al., 2011) 圖 15. 培養基質剛度影響間葉幹細胞分化之機制。

Figure 15. The mechanism of the effect of culture substrate stiffness on MSCs differentiation.

(Higuchi et al., 2013) 圖 16.整合素內部化經由 BMP – Smad 路徑調節間葉幹細胞分化。

Figure 16. Integrin internalization regulates MSCs differentiation via the BMP − Smad pathway.

2.4.3.2 細胞形狀調節間葉幹細胞之分化方向 (Cell shape regulates commitment of MSCs)

根據先前研究證實，細胞形狀對於細胞的增殖，存活和分化的調節至關重要 (Chen et al., 1997; Roskelley et al., 1994)。為了探討細胞形狀的變化是否可以調節 hMSCs 細胞特化，McBeath 等人通過微縮成像技術 (micropatterning technique) 來 控制細胞形狀和細胞擴散程度：當允許 hMSCs 粘附、扁平和延展時，將進行成骨 分化；反之，未延展且呈現圓細胞型的 hMSCs 將分化為脂肪細胞 (McBeath et al., 2004)。另有研究表示細胞形狀會影響 Rho 家族中 GTPases 的活性 (Ren et al., 1999)。

為了證實 RhoA 是否涉及細胞特化，McBeath 等人研究發現：ECM 調控之細胞形

狀會通過 RhoA 以及 Rho 相關蛋白激酶 (Rock) 之分子路徑決定 MSCs 分化命運 (McBeath et al., 2004)。RhoA 的活化將誘導 MSCs 之成骨分化，反之則分化為脂肪 細胞。此等藉由 RhoA 調控之細胞特化訊息需要肌動蛋白—肌球蛋白產生的張力，

而不需要可溶性分化因子參與 (Arnsdorf et al., 2009)。此項研究顯示細胞形狀，細 胞骨架力學和 RhoA 訊息傳遞是決定幹細胞分化命運的組成要素。

2.4.3.3 構型變化影響間葉幹細胞之命運 (Topographic changes influence MSC fate)

ECM 是由許多孔隙、脊梁和不同大小的纖維所組成奈米級網絡結構，研究表 示 ECM 物理構型會影響細胞行為 (Curtis and Wilkinson, 2001)。隨著電子束光刻 (electron beam lithography, EBL) 技術之發展，已可用於製造極精密之奈米形貌，

大幅地促進細胞與奈米微環境相互作用之研究。通過 EBL 技術，Dalby 等人證實 square array, DSQ)：nanopits 從原本 SQ 位置在兩軸上隨機位移至多 50 nm (DSQ50) 或 20 nm (DSQ20)；(3) RAND：nanopits 隨機在150 μm × 150 μm 的區域，並重複

表現，當 ECM 具有較高之剛度可增加細胞內的張力，導致細胞核變形並且增加 lamin A 和成骨細胞分化相關基因之表現；反之，低剛度 ECM 會降低細胞內張力，

而增加脂肪分化相關基因之表現 (Higuchi et al., 2013)。細胞黏著過程中藉由建立 細胞骨架的張力調節 MSCs 的分化方向，ECM 剛度可穩定核骨架蛋白–lamin A，

經由 serum response factor (SRF) 與 YAP1 轉而提高 SFs 相關基因之表現 (Swift et al., 2013)。lamin A 靜默 (silencing) 會促使 MSCs 在柔軟的 ECM 分化為脂肪細胞，

而 lamin A 增加則促使 MSCs 在堅硬的 ECM 分化為成骨細胞。ECM 的物理訊號 經 retinoic acid (RA) 路徑轉換至細胞核調節 lamin A 的轉錄 (Huang et al., 2015;

Swift et al., 2013) (圖 18)。

綜合上述，ECM 的物理性質決定 MSCs 的分化命運。當 MSCs 培養在具有高 剛度、尖銳邊緣或大尺寸固定區域的 ECM 基質上，會誘導成骨細胞分化；反之，

當 MSCs 培養在具有低剛度、平滑邊緣或小尺寸固定區域的 ECM 基質上，則會誘 導脂肪細胞分化 (Huang et al., 2015) (圖 19)。

(Huang et al., 2015) 圖 17. 胞外基質的物理性質調節間葉幹細胞分化。

Figure 17. Physical properties of ECM regulate MSCs fate and differentiation.

(Huang et al., 2015) 圖 18. 胞外基質的剛度經由改變細胞與核骨架的張力影響基因表現。

Figure 18. ECM stiffness affect gene expresion by altering cytoskeletal and nuclearskeletal tension.

圖 19. 胞外基質的物理因素調節間葉幹細胞之分化命運。 (Huang et al., 2015) Figure 19. Physical parameters of ECM regulate MSC fate and differentiation.

2.4.3.4 機械力調控間葉幹細胞的基因表現

MSCs 的分化除了受基質剛度 (stiffness) 和構型 (topography) 等內在機械信 號 (intrinsic mechanical cues) 所影響，外在的機械信號例如流體剪力、壓縮力、靜 水壓力和張力等，可經由細胞膜上的離子通道、細胞之間的 cadherins、細胞和胞外 基質的 focal adhesion 或細胞內的細胞骨架轉換為化學訊息，從而活化不同之分子 路徑進而調節 MSCs 的分化 (Steward and Kelly, 2015) (圖 20)。先前已有許多研究 將機械力刺激視為調節細胞結構和功能的關鍵因素。細胞將感測到的機械力傳遞 到本身或其它細胞內部，並將其轉換為化學訊號進而調節細胞之運動、分化和增殖 (Discher et al., 2009; Engler et al., 2004; Janmey and McCulloch, 2007; Yeung et al., 2005)。Kurpinski 等人使用微化條帶 (micropattened strip) 使 MSCs 的排列沿著單 軸應力的方向。結果顯示平滑肌細胞的標記 calponin 1 的表現增加，而軟骨基質標 記表現降低。然而，當細胞排列垂直於應力方向時，會減少基因表現的變化 (Kurpinski et al., 2006)。此結果表示機械力對 MSCs 的基因表現具有深遠的影響。

而另一項研究發現，若同一組中 TGF-β1 和循環之機械應力同時作用時，可協同 calponin1 基因表現增加，說明可溶性因子和機械應力可協同調控 MSCs 的基因表 現 (Kurpinski et al., 2009)。此外，流體剪力會經由活化 RhoA − ROCKII 路徑提高 actin filaments 的張力，誘導成骨細胞分化相關基因 Runx2, Wnt, Ror2 的表現。若 使用 LPA (lysophosphatidic acid) 激活 RhoA 則會抑制脂肪細胞分化相關基因 PPARγ 的表現；而使用 cytochalasin D 抑制機動蛋白聚合可增加 PPARγ 並抑制 Runx2 的表現 (Arnsdorf et al., 2009)。

(Steward and Kelly, 2015) 圖 20. 內在與外在機械信號調節間葉幹細胞之分化。

Figure 20. The intrinsic and extrinsic mechanical cues that regulate the differentiation of MSCs.