材料與方法

3.1.2.1 試驗動物飼養環境及條件

本試驗所採用三隻體重介於 43~44 公斤，6~6.5 月齡之雌性李宋豬 (Lee-Sung female pigs)，皆購自國立台灣大學動物科學系，並經國立台灣大學倫理委員會所核 准的動物協議。本試驗之實行嚴格遵照美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health, NIH) 所發布之實驗動物護理和使用指南 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 的規範。試驗流程中所使用的麻醉和止痛方式皆符合標準。

試驗豬隻飼養於專門設計之畜欄內，每日在試驗前和試驗結束時 (約早上 9 點 之圓頂狀橡膠裝置 (dome-shaped rubber device)，以塑膠管連接至真空吸力幫浦 (suction pump) (VAC Instill, San Antonio, Texas)，並將壓力設定為 700 mmAq (約 50 mmHg) (圖 24B, C&D)。此壓力設定為豬隻所能承受之最大限度，並且在試驗過程

理組，所有後端位置分配為 21 日處理組，兩者間的中間位置皆做為對照組 (圖 25C)。

由於將一頭豬的一側分為 3 組，而每頭豬的兩側都有經過 EVE 處理，因此總共三 頭豬每組樣本數為 6。各組在試驗時間結束後一日分別進行組織採樣，也就是前端 位置 (10 日處理組) 在第 11 日採樣，後端位置 (21 日處理組) 連同對照組在第 22 日採樣，每組在採樣前先以超音波測量軟組織厚度 (圖 25A)。另外每組所採取之 樣本皆進行以下分析：(1) H&E 染色觀察血管重塑以及脂肪細胞的大小和數量；(2) 免疫組織染色以 Ki67 觀察細胞增殖，α-SMA 觀察血管平滑肌細胞；(3) Image J 測 量表皮厚度；(4) 免疫螢光染色以 CD31 分析血管密度。

圖 24. 外部體積擴張裝置及其作用期間之示意圖。

Figure 24. External volume expansion device and the pig was positioned in a limited space during EVE treatment.

圖 25. EVE 處理之試驗設計和流程圖。(A) 試驗設計之實驗組別和時間流程圖。

(B) 外部體積擴張之處理模式。(C) 外部擴張裝置所採用之負壓及其作用部位。

Figure 25. The experimental designs and flow chart of EVE treatment. (A) Study groups and time chart of experimental design. (B) The EVE treatment pattern. (C) The negative pressure and treated sites of EVE device.

3.1.2.3 超音波測量軟組織厚度

軟組織厚度，包括皮膚和皮下脂肪，利用超音波單位 7.5 MHz 線性陣列之實 時傳感器 (linear-array real-time transducer) 進行測量 (LOGIQ 700 MR, General Electronic Company, Milwaukee, WI, USA)。軟組織厚度於三個時間點進行測量，分 別是 EVE 處理前 (day 0)，EVE 處理剛結束時 (day 10 或 21) 以及採樣前 (day11 或 22)。超音波測量皆由同一人進行操作。

3.1.2.4 H&E 染色以及脂肪細胞大小和數量之測量 microscope, Zeiss, Germany) 個別以 40 和 200 放大倍率 (Plan-Neofluar objective with 0.50 NA) 對組織切片中的細胞結構進行觀察，脂肪細胞的大小和數量是利用 Adiposoft 自動化程式進行分析。

Adiposoft 是一個開放性軟體 (open-source software)，可針對組織切片中白色 脂肪組織進行全自動化分析。首先描述由此程式所執行的圖像分析例程序列 (sequence of image analysis routines)，然後比較此軟體和其它方式，包括以人為對 組織切片中的細胞進行定量分析作為黃金標準 (gold standard)，以及最常用的自動 化細胞懸浮液 (cells in suspension) 分析。結果顯示 Adiposoft 和其它兩種方式之間 有明顯的一致性 (significant concordance)，並且證實 Adiposoft 能區別出三隻不同 豬隻的脂肪組織中的細胞組成。另外，Adiposoft 與手動分析的脂肪細胞直徑具有 高度相關和低分歧性 (low disagreement) (Pearson correlation = 0.856, with 95%

confidence interval) (Galarraga et al., 2012)。因此在有限的時間和人力的情況下，

Adiposoft 能夠提供精確的分析結果。

3.1.2.5 Ki67 和α-SMA免疫組織染色 (Immunohistochemistry for Ki67 and α-SMA) 檸檬酸鈉緩衝溶液之配置

Citrate Buffer Antigen Retrieval Protocol

福馬林固定會造成蛋白質交互連接 (cross-links)，而掩飾樣本組織的抗原位點， 鐘，進行抗原修復 (antigen retrieval)。

4. 將切片進入染色培養皿 (staining dish)，輕輕蓋上蓋子，水浴 20~40 分鐘 (根據

10. 將切片放入 peroxidase blocking solution，10 分鐘。

11. 以 PBS Tween 20 沖洗切片 3 次，每次 2 分鐘。

12. 與 Ki67 一級抗體 (Lab Vision, Freemont, CA) 於室溫水浴 1 小時。

冷凍切片以丙酮固定後針對 alpha smooth muscle actin (α-SMA) 進行染色 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)。α-SMA 一級抗體於 4℃水浴過夜，而 Ki67 一級抗 體 (Lab Vision, Freemont, CA) 於 室 溫 水浴 1 小 時 ， 訊 號放大 使 用 tyramide amplification system (PerkinElmer, Boston, MA)。

3.1.2.6 細胞增殖和表皮厚度之定量

脂肪和表皮細胞的增殖以 Ki67 免疫組織切片，在 200 放大倍率下個別計算，

增殖的脂肪細胞數的計算在五個高倍率視野 (five high power fields)，增殖的比率 以細胞核呈現 Ki67 陽性佔所有細胞核的百分比。另外只計算 basal keratinocytes 的 原因是在所有角質細胞中它唯一具有增殖的潛能。三個各自獨立的觀察者在不知 實驗設計模式的情況下完成分析，每次計算結果得到的平均值再進行統計分析，表 皮厚度在五個均勻空間點 (evenly space points) 進行測量再用 Image J 分析。

3.1.2.7 CD31 免疫螢光染色 (Immunofluorescence for CD31) 1. 將 3 μm 的石蠟切片進行脫蠟、再水化。

2. 將切片放入 10 mmol/L 檸檬酸鈉溶液 (pH 6.0)，微波 10 分鐘，共 2 次，進行 抗原修復 (antigen retrieval)。

3. 以含有 4% Bovine albumin solution 的 PBS 對非特異性內源性抗原 (non-specific endogenous antigens) 進行 block。

4. 使 用 未 標 定 (unlabeled) 一 級 抗 體 針 對 CD31 進 行 檢 測 (Abnova, Cat # PAB11924, Taipei, Taiwan)，於4℃水浴過夜。

5. 以 PBS 沖洗切片 3 次，每次 5 鐘。

6. 以螢光標定之二級抗體和切片於4℃進行水浴過夜。

7. 同樣以 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

8. 以螢光顯微鏡 (Axiovert 100, Zeiss) 進行觀察。

9. 將 CD31 的染色切片在 200 放大倍率下以 3 個不同視野 (three fields) 進行評 估。新生血管區 (CD31 positive cells) 以 Image J 影像分析軟體計算 CD31 陽性 區 (CD31 positive area) 佔全圖像區 (total image area) 的百分比。

3.1.2.8 血管密度和直徑之定量

為了定量血管密度，將 CD31 的染色切片在 200 放大倍率下以 3 個不同視野 (three fields) 進行評估。新生血管區 (CD31 positive cells) 以 Image J 影像分析軟 體計算 CD31 陽性區 (CD31 positive area) 佔全圖像區 (total image area) 的百分比。

血管形成管腔結構的數量和直徑以α-SMA 之免疫組織切片進行計算，每一切片隨

機選取三個視野，計算每平方釐米的血管數最後採平均值。

3.1.2.9 統計分析

本試驗之數據使用 SPSS version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) 軟體進行分析，

以 Student’s t-test 測試實驗組和對照組之差異，數據表示為平均值 ± 標準偏差 (Mean ± SD)。所有測試均為雙尾，信賴區間為 95%。使用 Shapiro-Wilk 檢測數據 的常態分布，使用 F-test 測試等方差 (equal variance)。若 H0被拒絕時，使用無母 數統計中的 Mann-Whitney U 檢定法。當 p < 0.05 時定義兩者具有顯著差異。