結果與討論

3.1.3.1 皮膚和皮下厚度之觀察

使用超音波掃描 (ultrasonography) 測量軟組織厚度，包括皮膚和皮下脂肪層 的變化，觀察時間點分別為 EVE 處理前，EVE 處理剛結束後 (第 10 天和 21 天)，

以及採樣前 (第 11 天和 22 天)。統計結果顯示，EVE 處理前以及採樣前的軟組織 厚度並沒有顯著差異 (p > 0.01)。然而，若 EVE 處理結束後立即進行超音波檢查，

則會發現相較於 EVE 處理前，軟組織厚度有顯著增加 (15.7 ± 0.99 mm vs. 13.2 ± 1.04 mm，第 10 天；15.9 ± 1.02 mm vs. 13.24 ± 0.99 mm，第 21 天，p < 0.01)，由此 可得知經過 8 小時的外部負壓作用，軟組織厚度平均增加 19% (表 2)。此外，EVE 作用剛結束後會發現經過負壓處理的部位呈現局部性腫脹 (第 10 或 21 天)，此現 象會在 EVE 作用停止後逐漸消失。此結果說明 EVE 引發軟組織的增厚屬於暫時 性效應，即使經過 21 天負壓作用，軟組織厚度也沒有明顯改變。

表 2. 超音波測量軟組織厚度。

Table 2. Measurement of soft tissue thickness by ultrasonography.

3.1.3.2 血管重塑之觀察

經由 H&E 染色進行組織型態的分析 (histomorphometrical analysis)，可以觀察 到在 EVE 處理組當中，從第 10 天到第 21 天，管腔化 (lumenization) 逐漸形成，

血管壁也逐漸增厚，進而形成穩定的血管網絡。此結果顯示 EVE 處理能有效促使 血管重塑的過程 (圖 26)。

圖 26. 免疫組織染色觀察血管重塑。在 EVE 處理組中，皮下脂肪的血管網絡的穩 定經由逐漸管腔化和血管壁的特化以維持結構上的穩定 (放大倍率；上圖：40 倍，

下圖：200 倍)。

Figure 26. The vascular remodeling was examined by IHC. In EVE treated groups, the vascular networks in subcutaneous fat were stabilized by progressive lumenization and specialization of vessel wall (magnification; upper panel: 40X, lower panel: 200X).

3.1.3.3 脂肪細胞的數量和大小

從 2012 年 Heit 研究團隊以小鼠模式的實驗結果顯示，EVE 可增加皮下脂肪 的厚度。然而，脂肪組織的擴增方式分為細胞體積的肥大 (hypertrophy) 和細胞數 量的增加 (hyperplasia)，兩者在生理上具有不同的意義，前者為胞質中油脂的堆積，

後者為幹細胞或前驅細胞之成脂分化 (adipogenic differentiation)，故本試驗使用 Adiposoft software 對皮下脂肪組織切片中的脂肪細胞大小和數量進行自動化處理 和分析。經統計結果顯示，10 天和 21 天 EVE 處理組之皮下脂肪中的脂肪細胞大 小和數量，相較於對照組，皆沒有顯著差異 (p > 0.05) (圖 27)。

圖 27. 皮下脂肪中脂肪細胞大小對脂肪細胞數之標繪圖。

Figure 27. Plotting of adipocyte size versus adipocyte number in subcutaneous fat.

3.1.3.4 細胞增殖和表皮厚度之定量分析

Ki67 是一種與細胞增殖相關的核蛋白 (nuclear protein)，並與核醣體 RNA (ribosomal RNA, rRNA) 的轉錄有關，Ki67 的失活將對 rRNA 的合成造成抑制作用 (Bullwinkel et al., 2006)。在細胞分裂間期 (interphase)，可在細胞核內專一偵測到 Ki67，而在有絲分裂中 (mitosis)，大部分 Ki67 蛋白會重新定位到染色體表面。Ki67 在細胞分裂週期中的 G1、S、G2 和 M phases 均有表現，但在細胞靜止期 G0 則不 表現。Ki67 的表現與細胞增殖有緊密的關聯性，使其成為非常好的蛋白質標記，

可設計專一性抗體與之結合，進而分析細胞的生長或增殖速率 (Rahmanzadeh et al., 2007; Scholzen and Gerdes, 2000)。

本試驗採用 Ki67 為細胞增殖標記，對活細胞的細胞核進行染色，藉由 Ki67 免 疫組織染色觀察基底角質細胞 (basal keratinocytes) 和脂肪細胞的增殖速率 (圖 28A)。另將表皮和皮下脂肪中呈現 Ki67 陽性反應的細胞進行鑑定和量化，經統計 分析後可發現，EVE 處理組的軟組織在表皮和脂肪層中 Ki67 陽性細胞所佔的百分 比相較於對照組雖然有稍微增加，然而並沒有統計上的差異性 (p > 0.05) (圖 28B)。

此外，Image J 測量表皮厚度之結果顯示，10 天和 21 天處理組和對照組之間的表 皮厚度沒有顯著差異 (p > 0.05) (圖 28C)。

圖 28. 細胞增殖和表皮厚度之定量分析結果。(A) Ki67 免疫組織染色觀察基底角 質細胞和脂肪細胞之細胞增殖 (放大率：200 倍)。(B) Ki67 所標記之基底角質細胞 和脂肪細胞的百分比無顯著差異 (n = 6 per group; *p < 0.05)。(C) 表皮厚度於所有 組別之間無顯著差異。

Figure 28. The results of the quantitative analysis of cell proliferation and epidermal thickness. (A) Immunohistochemistry stain with Ki67 for cell proliferation in basal keratinocytes and adipocytes (magnification: 200X). (B) There was no difference in the percentage of basal keratinocytes and adipocytes labeled with Ki67 (n = 6 per group; *p

< 0.05). (C) No difference in epidermal thickness across all groups.

3.1.3.5 血管密度之定量分析

血 小 板 內 皮 細 胞 黏 附 分 子 -1 (platelet-endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1) 或 稱 cluster of differentiation 31 (CD31) ， 是 免 疫 球 蛋 白 的 超 家 族 (superfamily) 成員之一，分布於血小板、單核球 (monocytes)、嗜中性球 (neutrophils) 和某些類型之 T 細胞。CD31 為內皮細胞的細胞間連接 (intercellular junction) 主要 構成蛋白，故高度表現於內皮細胞。此外，CD31 可維持血管壁的完整性，並涉及 白血球穿越微血管壁 (leukocyte transmigration)，血管生成 (angiogenesis) 和整合素 (integrin) 的活化 (Baldwin et al., 1994)。

本試驗使用 CD31 (PECAM-1) 對內皮細胞進行免疫螢光染色，進而進行血管 密度之定量分析。結果發現 EVE 處理組 (10 日與 21 日) 相較對照組，於真皮和皮 下脂肪可觀察到更多呈現 CD31 陽性細胞 (圖 29A)。另外統計結果顯示，10 天處 理組於真皮和皮下脂肪的血管密度相較於對照組明顯增加 (p < 0.05)；此外，21 天 處理組位於真皮和皮下脂肪的血管密度也明顯高於 10 天 EVE 處理組 (p < 0.05) (圖 29B&C)。此結果說明，血管密度將隨著 EVE 的作用時間而逐漸增加。

圖 29. 血管密度之定量分析結果。(A) PECAM-1 (CD31) 免疫螢光染色觀察真皮 和皮下脂肪中的新血管形成 (放大倍數：200 倍)。(B, C) 在真皮和皮下脂肪中，

EVE 處理組相較於對照組血管密度有明顯增加。

Figure 29. Quantitative analysis of blood vessel density. (A) Immunofluorescence stain with PECAM-1 (CD31) for neovascularization in dermis and subcutaneous fat (magnification: 200Χ). (B, C) In dermis and subcutaneous fat, the EVE-treated groups showed significant increases in calculated blood vessel density when compared with the control groups (n = 6 per group; *p < 0.05).

3.1.3.6 功能性血管成熟之定量分析

除了血管密度之外，血管成熟可透過血管壁中平滑肌細胞與α-SMA 的可染性

(stainable property) 來觀察。因為管壁具有平滑肌的血管被視為功能性成熟，其可 以調節血管彈性 (vasoactivity) 和血管壁的重塑 (Park et al., 2004)。本試驗利用平 滑肌細胞具有表達高水平的收縮標記蛋白 (contractile marker proteins) 例如 smooth muscle α-actin (α-SMA) 之特性，進行免疫組織染色。結果如圖 30A 所示，可觀察 到在 EVE 處理組中，具有平滑肌細胞之血管網絡形成明顯增加。具體而言，21 天 EVE 處理組每平方毫米大約有 16.8 個血管，而 10 天 EVE 處理組和對照組每平方 毫米分別只發現 7.1 和 2.5 個血管 (圖 30B)。

圖 30. 血管成熟之定量分析結果。(A) α-SMA 免疫組織染色於皮下脂肪之血管網 絡 (放大率：200 倍)。(B) EVE 處理組顯示出α-SMA 標記之血管網絡明顯增加。

Figure 30. Quantitative analysis of vascular maturation. (A) Immunohistochemistry stain with α-SMA for vascular networks in subcutaneous fat (magnification: 200X). (B) The EVE-treated groups demonstrated a significant increase in vascular networks layered with α-SMA (n = 6 per group; *p < 0.05).

3.2 外部體積擴張對脂肪幹細胞增殖、分化潛能及其細胞標記之探討