第一節 前言
許多文獻指出，非酒精性脂肪肝 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 與代謝症候群危險因子，像是肥胖、第二型糖尿病、血脂異常、高血壓與胰島素 阻抗具有高度相關性 (Bugianesi et al., 2005; Srivastava & Younossi, 2005)。
NAFLD 的主要特徵為脂肪堆積在肝中，進而造成肝臟慢性的發炎狀態，可視為 代謝症候群之肝病病徵(Cortez-Pinto et al., 1999)。
本章使用兩種刺激人類肝癌細胞株 (HepG2)產生脂質堆積現象之模式，以模 擬脂肪肝形成。模式一，使用五種長鏈脂肪酸：Oleic acid、Palmitic acid、Stearic acid、Linoleic acid、Arachidonic acid，分別為 25：40：15：15：5 之比例 (Lin et al., 2007)配製成濃度 1 mM fatty acids mixture 刺激細胞內 TG 含量增加；模式二，
以 5 μl/ml intralipid 同樣刺激細胞內 TG 含量上升。使用不同濃度之大豆異黃酮 daidzein、equol 及 genistein，分別觀察試驗材料是否具有減少細胞內 TG 與膽固 醇含量的能力。
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第二節 研究材料與方法
壹、實驗設計
貳、研究材料
(一) 人類肝癌細胞株 (Human hepatoblastoma G2, HepG2)培養
HepG2 細胞來自食工所生資中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，使用 DMEM High Glucose 培養液 (Biowest)，內含 L-Glutamine、Sodium Pyruvate，外加 fetal bovine serum 10 % (Biowest)、1 % L-glutamine (GIBCO)、1 % Non-Essential Amino Acids (GIBCO)、及 1 % Antibiotic-Antimycotic (GIBCO)。
將細胞培養於10 cm dish中。培養箱 (Thermo)環境維持37℃、5 % CO2及飽 和水蒸氣，於水盤中加入抗黴劑Methyl 4-hydroxybenzoate (SIGMA)。二天更換培 養液一次，用幫浦抽吸器 (GAST)前端接tip沿著dish邊緣吸掉舊培養液，再注入 新的培養液。
48 hrs
Hep G2
Intralipid 5 μl/ml
Incubate with or without samples
Incubate with or without sampple Model II
24 hrs
1 mM fatty acids mixture Incubate with or without samples
Model I
Protein, TG, Cholesterol
Cell assay24 hrs
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細胞成長至八、九分滿需進行繼代，用巴斯德吸管吸掉舊培養液，以PBS洗 三次，加1 ml TrpLE (GIBCO)均勻搖晃並浸潤整個dish，放置於培養箱中等待8 分鐘，取出培養皿加入3 ml新鮮培養液將貼附於dish底部之細胞沖洗下來，將細 胞懸浮液放入滅菌離心管中，以1000 rpm離心5分鐘。離心完畢後，吸掉上清液，
注入適量的新鮮培養液，視細胞量或實驗需求而定將細胞懸浮液分成數盤或種入 多孔盤中。
(二) 細胞計數
活細胞會排斥 Trypan Blue 染劑，只有死細胞會被染成深藍色，故以顯微鏡 (Nikon)計算血球計數盤上的亮點，可得知細胞之相對存活率。取 20 μl 之細胞懸 浮液加入 80 μl PBS 及 20 μl Trypan Blue (SIGMA)稀釋十倍，以血球計數盤計算 四大格總數，除以 4 乘以稀釋倍數再乘以 104，得知細胞液之密度 (細胞數/ml)。
(三) 細胞冷凍
將細胞懸浮液以 1000 rpm 離心 5 分鐘，吸除上清液，注入以 7 % DMSO (SIGMA)加上 93 %新鮮培養液配製成的冷凍保存液混合均勻，再取 1 ml 分裝至 各冷凍管中。將冷凍管放置保麗龍盒中-80℃ overnight，隔天將冷凍管放入液態 氮桶中保存。
参、樣品製備及取得
(一) Daidzein
自 Cayman chemical 購得。分子量 254.2，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 DMSO 溶解，配成 stock 濃度 8 mM。
(二) Genistein
自 Cayman chemical 購得。分子量 270.2，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 DMSO 溶解，配成 stock 濃度 8 mM。
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(三) (S)-equol
自 Cayman chemical 購得。分子量 242.3，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 100 % Ethanol 溶解，配成 stock 濃度 16 mM。
(四) Fatty acid mixture (FA)
自 Sigma 購得。長鏈脂肪酸混合物乃參考 Lin 等人並再做調整與修正，FA 包括了 Oleic acid、Palmitic acid、Stearic acid、Linoleic acid、Arachidonic acid 等 五種脂肪酸 (FFA)，比例分別為 25：40：15：15：5 (Lin, et al., 2007)，並根據 Cousin 等人方法配置 FFA/BSA complex：將 100 mM FA 溶於 0.1 M NaOH 以 70℃
加熱 10 分鐘，接著將 100 mM FA 與 1 % BSA 以 1:1 混合以 55℃加熱 10 分鐘，
依比例混合後儲存在-80℃，此為 50 mM FA stock，使用前以 55℃加熱 15 分鐘，
將 FFA/BSA complex 溶液用 0.22 μm 過濾頭過濾 (Cousin et al., 2001)。
(五) Intralipid
自 Sigma 購得。為 20 % intralipid 主要含有 20 % soybean oil、2.3 % glycerin、
1.2 % phospholipid，其中 soybean oil 中 tryglycerides 為 11.3 % palmitic acid、4.9 % stearic acid、29.7 % oleic acid、46.0 % linoleic acid 及 8.1 % linolenic acid。
肆、細胞存活率分析 (MTT assay)
以 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT；
SIGMA)為受質，該受質在活細胞中會被粒線體 dehydrogenase 還原，而產生紫色 formazan 產物。在 550 nm 有最大吸收，利用比色法來測定細胞存活率。當存活 細胞越多，產生的 formazan 也越多，可計算出細胞存活率。
在 1 mM FAs 模式，在 96 孔盤中，每個 well 內接種 5×104個細胞，待 24
小時細胞貼附後，吸去培養液，注入已配好不同濃度之大豆異黃酮純物質，培養 24 小時。另外於 5 μl/ml intralipid 之模式，每 well 接種 2×104個細胞於 96 孔盤
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中，待 24 小時細胞貼附後，吸去培養液，注入已配好不同濃度之大豆異黃酮純 物質，培養 48 小時。
培養完後吸去培養液再加入60 μl MTT 溶液 (0.5 mg/ml) 於培養箱中反應 2 小時，最後加入100 μl isopropanol with 0.04N HCl 反應約 30 分鐘，並用 shaker 輕輕搖晃以溶解細胞，最後利用 ELISA Reader (BioTek)以 550 nm 讀取吸光值，
以僅含新鮮培養液細胞之吸光值為對照組 (100 %)，再以實驗組之吸光值除以對 照組之吸光值，以計算出細胞之相對存活百分比。
伍、細胞內蛋白質濃度測定
(一) 細胞蛋白質抽取
將細胞種於 6 well plate 中，密度為 1x106/well (model I)與 5x105/well (model II)，依照實驗設計之進行後，吸去舊 medium，以冰 PBS wash 兩次，將 PBS 吸 乾，加入 150 μl 之 cell lysis buffer (CellSignaling)置於冰上 5 min，將細胞刮下，
置入 eppendorf，以 14000 rpm、4℃離心 10 min，取上清液測定蛋白質濃度，分 裝至新的 eppendorf 於 -80℃保存。
(二) 蛋白質定量
使用 Lowry method 檢測蛋白質含量，自 Bio Rad 購得 DC Protein Assay 套 組，套組包含 A、B 液，A 液為鹼性酒石酸銅溶液，B 液為稀釋後的 Folin reagent。
當樣品加入 A 液後，銅離子在鹼性溶液中與 peptide bonds 形成複合物，此複合 物可與 Folin reagent 作用，使其進行還原反應而生成藍色產物。
蛋白質標準品配製：
蛋白質濃度
(μg/ml) 0 200 400 600 800 1000 1 mg/ml BSA (μl) 0 20 40 60 80 100
DDW (μl) 100 80 60 40 20 0
將不同濃度標準品及樣品各取5 μl，先加入 A 液 25 μl，再加入 B 液 200 μl，於
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室溫作用 10 分鐘後，讀取 750 nm 吸光值。不同濃度標準品測出吸光值並與蛋白 質濃度畫出標準曲線，求出趨勢線方程式後，代入各樣品吸光值，即可以內插法 求出蛋白質濃度。
陸、細胞內三酸甘油酯含量測定
(一) 原理
Triglycerides + H2O glycerol + free fatty acid
Glycerol + ATP glycerol-3-phosphate + ADP
glycerol-3-phosphate+O2 dihydroxyacetone +phosphate+H2O2
2H2O2 + 4-aminophenazone + 4chlorophenol quinoneimine +HCl+4H2O
(二) 方法
取 50 μl 細胞破碎後的樣品加入 96 well plate 中，再加 200 μl 反應試劑，反 應時間 10 分鐘，作二重複，使用市售組合試劑 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定，波長 500 nm。利用 triglyceride calibrator standard (Randox)做一標準 曲線，標準品補 PBS 至與樣品體積相同，利用內插法推算其濃度。
柒、細胞內膽固醇含量測定
(一) 原理
利用 detergent 將膽固醇及膽固醇酯自 lipoprotein 中釋出，再以 cholesterol esterase 水解膽固醇酯可得游離膽固醇 (free cholesterol)。
Lipase
Peroxidase Glycerol phosphate oxidase Glycerol kinase
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Cholesterol ester +H2O cholesterol +fatty acids
Free cholesterol +O2 cholesterol-3-one + H2O2
2H2O2 + 4-aminoantipyrine + phenol quinoneimine + 4H2O
(二) 方法
取50 μl 細胞破碎後的樣品加入 96 well plate 中，再加 200 μl 反應試劑，反 應時間 10 分鐘，作二重複，使用市售組合試劑 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAR method 測定，波長 500 nm。利用以 cholesterol calibrator standard (Randox)做一標準曲線，標準品補 PBS 至與樣品體積相同，利用內插法推算其濃 度。
捌、統計分析
每次實驗皆有三次重複獨立實驗，結果以 mean±SD 表示。實驗數據以 SPSS 15.0 軟體進行分析。利用 Student’s t-test 以及 one-way ANOVA 事後檢定 Duncan 判定各組差異。若 p＜0.05，表示統計上具有顯著差異。
Peroxidase cholesterol oxidase
cholesterol esterase
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第三節 結果
壹、樣品對 HepG2 細胞存活率之影響
將樣品 daidzein、genistein 與 equol，分別以不同濃度與兩種誘發劑，1 mM FA 共同培養 24 小時或與 5 μl/ml intralipid 共同培養 48 小時後，利用 MTT 測定細胞 存活率。實驗中各樣品之不同濃度以不影響 HepG2 生長狀況為原則，以避免因 細胞生長狀態不同造成誤差。
(一) 1 mM fatty acids mixture 當誘發劑之模式
各種樣品不同濃度對於 HepG2 細胞存活率的影響如圖 4-1 所示。結果 daidzein 與 genistein 在 20~80 μM 以及 equol 在 5~20 μM 的濃度之下，皆不影響 細胞之存活率。
(二) 5 μl/ml Intralipid 當誘發劑之模式
各種樣品不同濃度對於 HepG2 細胞存活率的影響如圖 4-2 所示。結果 daidzein、genistein 與 equol 在濃度 2~50 μM 之下，皆不影響細胞之存活率。
因此本實驗選用不會對 HepG2 細胞造成傷害的劑量。
貳、樣品對 HepG2 細胞內三酸甘油酯含量之影響
本研究以本實驗室已建立之 HepG2 細胞三酸甘油酯堆積模式，將不同濃度 之各樣品與誘發劑共同培養，視其是否影響 HepG2 細胞內 TG 含量，結果如圖 4-3 所示。
(一) 1 mM fatty acids mixture 當誘發劑之模式
1 mM fatty acids mixture 的濃度相較於控制組，顯著上升細胞內 TG 含量，
達 1.4 倍 (p < .05)。投予不同劑量之樣品與之共同培養，結果發現 daidzein、
genistein 與 equol 在不同劑量下，相較於刺激組皆無顯著影響細胞內 TG 含量 (圖
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4-3(A))。
(二) 5 μl/ml Intralipid 當誘發劑之模式
Intralipid 5 μl/ml 的濃度相較於控制組，顯著上升細胞內 TG 含量，達 2.8 倍 (p < .05)。若投予 2 μM、10 μM 及 50 μM daidzein，相較於刺激組，細胞內 TG 含量有下降的趨勢，但只有劑量 50 μM 達顯著下降 64 % (p < .05)；genistein 濃度 在 2 μM、10 μM 及 50 μM，細胞內 TG 含量皆有下降趨勢，其中 10 μM 及 50 μM 相較於刺激組分別顯著下降 19 %及 57 % (p < .05)；equol 在 2 μM、10 μM 及 50 μM 濃度下，相較於刺激組，細胞內 TG 含量皆有減少，而 10 μM 及 50 μM 達顯著 下降 13 %及 53 % (p < .05) (圖 4-3(B))。
参、樣品對 HepG2 細胞內膽固醇含量之影響
將不同濃度之各樣品與誘發劑共同培養，視其是否影響 HepG2 細胞內膽固 醇含量，結果如圖 4-4 所示。
(一) 1 mM fatty acids mixture 當誘發劑之模式
1 mM fatty acids mixture 的濃度相較於控制組，顯著上升細胞內膽固醇含 量，達 1.4 倍 (p < .05)。投予 daidzein、genistein 與 equol 之不同劑量與之共同培 養，結果發現在不同劑量下，相較於刺激組皆無顯著影響細胞內膽固醇含量(圖 4-4(A))。
(二) 5 μl/ml Intralipid 當誘發劑之模式
Intralipid 5 μl/ml 的濃度可顯著刺激細胞內膽固醇堆積，為控制組的 1.3 倍 (p
< .05)。若投予 2 μM、10 μM 及 50 μM daidzein，相較於刺激組，僅劑量 50 μM 達顯著下降 48 % (p < .05)；genistein 濃度在 50 μM 相較於刺激組顯著下降 39 % (p
< .05)；equol 在 2 μM、10 μM 及 50 μM 濃度下，細胞內膽固醇含量皆有減少，
相較於刺激組，50 μM 達顯著下降 34 % (p < .05) (圖 4-4(B))。
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Ctrl 20 40 80 20 40 80 5 10 20 Daidzein(M) Genistein(M) Equol (M)
cell viability (% of control)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
1 mM fatty acids (+) 1 mM fatty acids (-)
圖 4-1. 1 mM fatty acids 及 daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞存活率的影響 Fig 4-1. Effects of FA alone or FA plus daidzein, genistein, or equol on viability of HepG2 cell. The cells were treated with1 mM FA plus daidzein, genistein, and equol for 24 hr. Values are means ± S.D. Data were analyzed by Student’s t-test, n = 3.
*Significantly different from the control group (p < .05).
61
Ctrl 2 10 50 2 10 50 2 10 50 Daidzein(M) Genistein(M) Equol (M)
cell viability (% of control)
0 50 100 150 200
intralipid (5l/ml)(+) intralipid (5l/ml)(-)
圖 4-2. Intralipid 及 daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞存活率的影響
Fig 4-2. Effects of intralipid alone or intralipid plus daidzein, genistein, or equol on viability of HepG2 cell. The cells were treated with 5 μl/ml intralipid plus
daidzein , genistein, and equol for 48 hr. Values are means ± S.D. Data were analyzed by Student’s t-test, n = 3. *Significantly different from the control group. (p < .05)
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control 1mM fatty acids 2 10 50 2 10 50 2 10 50 (M) daidzein genistein equol 1 mM fatty acids
TG content (% of control)
0
TG content (% of control)
0
圖 4-3. Daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞內三酸甘油酯含量的影響
Fig 4-3. Effects of daidzein, genistein, and equol on cellular triacylglycerol (TG) content in HepG2 cell. The cells were treated with medium containing 1 mM fatty acids (A), or 5 μl/ml intralipid (B), and different concentrations of daidzein, genistein and equol for 24 hr (A),or 48 hr (B). The results were presented as cellular TG relative to the untreated cells (relative value = 100). Values are means ± S.D. Data were analyzed by one-way ANOVA and Duncan multiple comparison test. n=3.
A
B
63
control 1mM fatty acids 2 10 50 2 10 50 2 10 50 (M) daidzein genistein equol 1mM fatty acids
TC content (% of control)
0
TC content (% of control)
0
圖 4-4. Daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞內膽固醇含量的影響
Fig 4-4. Effects of daidzein, genistein, and equol on cellular cholesterol (TC) content in HepG2 cell. The cells were treated with medium containing 1 mM fatty acids (A), or 5 μl/ml intralipid (B), and different concentrations of daidzein, genistein and equol for 24 hr (A),or 48 hr (B). The results were presented as cellular cholesterol relative to the untreated cells (relative value = 100). Values are means ± S.D. Data were analyzed by one-way ANOVA and Duncan multiple comparison test. n=3.
A
B
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第四節 討論與結論
壹、脂肪酸與 intralipid 兩種刺激模式
為模擬脂肪肝之形成，本研究使用 1 mM FAs mixture 與 5 μl/ml intralipid 兩 種刺激模式，結果皆能顯著刺激肝細胞內產生 TG 堆積。兩者刺激成分不同在於 intralipid 之脂肪酸以 TG 形式存在，並有 phospholipid (見表 4-1)。在脂肪酸模式 中，FFA 可直接進入細胞進行酯化 (esterification)作用形成 TG (Storch & Thumser, 2000)。SREBPs 為一轉錄因子，能調控脂質生合成之相關基因，像是 GPAT、HMG CoA synthase、HMG CoA reductase、ACC 等，有三個主要 isoform：SREBP-1a、
SREBP-1c 與 SREBP-2 (Brown & Goldstein, 1997)。SREBP-1a 與 SREBP-1c 調節 參與脂肪酸合成，當其表現增加使 TG 堆積於肝臟中，而 SREBP-2 主要參與膽
Table 4-1. The components of two models.
Components Models I：1 mM fatty acids mixture II：Intralipid Fatty acids Palmitic acid: 40 %
Stearic acid: 15 % Oleic acid: 25 % Linoleic acid: 15 % Arachidonic acid: 5 %
Triglycerides in soybean oil:
Triglycerides in soybean oil: