第一節 前言
許多臨床與動物研究指出，血脂異常會造成腎臟疾病進展與腎絲球硬化 (glomerulosclerosis)之情形 (H. J. Grone et al., 1989; Moorhead et al., 1982)。但是仍 沒有足夠證據顯示高血脂症單獨導致腎臟損傷，還有其他因素像是腎臟內高血壓 與發炎皆會造成脂質誘發的腎功能不全 (Ruan, et al., 2003)。
腎間質細胞 (mesangial cell, MC)為腎絲球其中一種細胞形式，是環繞在腎絲 球微血管叢外的變形紡錘狀平滑肌細胞，位於腎絲球微血管環之間，具有伸縮性 可調節壓力反應；也會分泌數種生長因子像是 interleukin-1 (IL-1), platelet-derived growth factoe (PDGF), insulin-like growth factor (IGF)等，在維持腎絲球細胞的增 生與轉化上扮演重要角色 (Abboud, 1991)。腎臟脂毒性會造成腎間質細胞損傷，
且在發炎刺激的環境下會加劇脂質堆積情形，oxLDL 會刺激腎間質細胞分泌過 多的細胞外基質、MCP-1 造成腎絲球硬化，進而促進腎臟疾病之進程 (Abrass, 2004; Wahba & Mak, 2007)。
本章使用 1 mM fatty acids 長鏈脂肪酸 (與第四章同)刺激小鼠腎間質細胞產 生 TG 脂質堆積，用不同濃度之大豆異黃酮 daidzein、genistein 與 daidzein 代謝 產物 equol，觀察是否可以降低 MC 之 TG、膽固醇含量；另外，同樣使用 1 mM FAs 誘發 MC 刺激 MCP-1 產生，模擬細胞發炎之情況，觀察樣品是否能可以減 少細胞發炎情形。
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第二節 研究材料與方法
壹、實驗設計
貳、研究材料
(一) 小鼠腎絲球間質細胞株(Mouse renal mesangial cell line, MC)培養
MC 細胞來自食工所生資中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，使用 DMEM High Glucose 培養液 (Biowest)，內含 L-Glutamine、Sodium Pyruvate，將 DMEN 培養液與含有 14 mM HEPEs (GIBCO)的 F12 (Biowest)培養 液以 3：1 的比例混合，再外加 fetal bovine serum 5 % (Biowest)及 1 %Antibiotic-Antimycotic (GIBCO)。將細胞培養於 10 cm dish 中。培養箱 (Thermo) 環境維持 37℃、5 % CO2及飽和水蒸氣，於水盤中加入抗黴劑 Methyl
4-hydroxybenzoate (SIGMA)。二天更換培養液一次，用幫浦抽吸器 (GAST)前端
24 hrs
24 hrs
MC
FA model
Treated with 1 mM fatty acid and co-incubated with or without samples
TG、Cholesterol
Cell lipid assay
MCP-1
Inflammatory cytokine
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接 tip 沿著 dish 邊緣吸掉舊培養液，再注入新的培養液。
細胞成長至八、九分滿需進行繼代，用巴斯德吸管吸掉舊培養液，以PBS洗 二次，加1 ml TrpLE (GIBCO)均勻搖晃並浸潤整個dish，放置於培養箱中作用2 分鐘，取出培養皿加入2 ml新鮮培養液，將貼附於dish底部之細胞沖洗下來，將 細胞懸浮液放入滅菌離心管中，以1000 rpm離心5分鐘。離心完畢後，吸掉上清 液，注入適量的新鮮培養液，視細胞量或實驗需求而定將細胞懸浮液分成數盤或 種入多孔盤中。
(二) 細胞計數
活細胞會排斥 Trypan Blue 染劑，只有死細胞會被染成深藍色，故以顯微鏡 (Nikon)計算血球計數盤上的亮點，可得知細胞之相對存活率。取 20 μl 之細胞懸 浮液加入 80 μl PBS 及 20 μl Trypan Blue (SIGMA)稀釋十倍，以血球計數盤計算 四大格總數，除以 4 乘以稀釋倍數再乘以 104，得知細胞液之密度 (細胞數/ml)。
(三) 細胞冷凍
將細胞懸浮液以 1000 rpm 離心 5 分鐘，倒除上清液，注入以 7.5 % DMSO (SIGMA)加上 92.5 % 新鮮培養液配製成的冷凍保存液混合均勻，再取 1 ml 分裝 至各冷凍管中。將冷凍管放置保麗龍盒中-80℃ overnight，隔天將冷凍管放入液 態氮桶中保存。
参、樣品製備及取得
(一) Daidzein
自 Cayman chemical 購得。分子量 254.2，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 DMSO 溶解，配成 stock 濃度 8 mM。
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(二) Genistein
自 Cayman chemical 購得。分子量 270.2，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 DMSO 溶解，配成 stock 濃度 8 mM。
(三) (S)-equol
自 Cayman chemical 購得。分子量 242.3，純度≧98 %，結晶狀固體，利用 100 % Ethanol 溶解，配成 stock 濃度 16 mM。
(四) Fatty acid mixture (FA)
自 Sigma 購得。配製同第四章第二節。
肆、細胞存活率分析 (MTT assay)
以 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT；
SIGMA)為受質，該受質在活細胞中會被粒線體 dehydrogenase 還原，而產生紫色 formazan 產物。在 550 nm 有最大吸收，利用比色法來測定細胞存活率。當存活 細胞越多，產生的 formazan 也越多，可計算出細胞存活率。
在 96 孔盤中，每個 well 內接種 1×104個細胞，待 24 小時細胞貼附後，吸 去培養液，注入已配好不同濃度之大豆異黃酮純物質，培養 24 小時後，吸去培 養液再加入60 μl MTT 溶液 (0.5 mg/ml) 於培養箱中反應 2 小時，最後加入 100 μl isopropanol with 0.04N HCl 反應約 30 分鐘，並用 shaker 輕輕搖晃以溶解細胞，
最後利用 ELISA Reader (BioTek)以 550 nm 讀取吸光值，以僅含新鮮培養液細胞 之吸光值為對照組 (100 %)，再以實驗組之吸光值除以對照組之吸光值，以計算 出細胞之相對存活百分比。
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伍、細胞內蛋白質濃度測定
(一) 細胞蛋白質抽取
將細胞種於 6 well plate 中，密度為 3x105/well，依照實驗設計之進行後，吸 去舊 medium，以冰 PBS wash 兩次，將 PBS 吸乾，加入 150 μl 之 cell lysis buffer (CellSignaling)置於冰上 5 min，將細胞刮下，置入 eppendorf，以 14000 rpm、4℃
離心 10 min，取上清液測定蛋白質濃度，分裝置新的 eppendorf 於 -80℃保存。
(二) 蛋白質定量
同第四章第二節。陸、細胞內三酸甘油酯含量測定
同第四章第二節。
柒、細胞內膽固醇含量測定
同第四章第二節。
捌、MCP-1 蛋白質含量測定
將細胞種於 6 well plate 中，密度為 3x105/well，貼附 24 小時後，加入不含 FBS 含有 1 mM fatty acids 並添加不同濃度樣本的培養基，作用 24 小時後收集細 胞上清液，以市售三明治酵素免疫分析 ELISA sets (eBioscience)分析 MCP-1 protein 之濃度。
根據 ELISA 原理測量，流程依照廠商說明書簡述如下：
73
預先在 96 well ELISA plate (costar)加入 coating capture antibody 100 μl/well 後放入 4℃ overnight，使用 wash buffer (含 0.05 % Tween-20 之 1X PBS)洗去多餘 未黏附之抗體後，加入 assay diluents 200 μl/well 進行 Blocking，以降低非特異性 的干擾。作用 1 小時後，以 wash buffer 清洗再加入配好之標準品及樣品上清液 100 μl/well，作用 2 小時後，以 wash buffer 清洗；加入 detection antibody 100 μl/well，作用 1 小時後用 wash buffer 清洗；加入 Avidin-HRP 100 μl/well 作用 30 分鐘後以 wash buffer 清洗；加入 TMB 100 μl/well 於室溫下避光呈色 15 分鐘，
最後加入 2N H2SO4終止反應，立即測量 450 nm 之吸光值。吸光值越高者表示樣 品中所含之 MCP-1 protein 濃度越高，其濃度利用標準曲線換算得之。
玖、統計分析
每次實驗皆有三次重複獨立實驗，結果以 mean±SD 表示。實驗數據以 SPSS 15.0 軟體進行分析。利用 Student’s t-test 以及 one-way ANOVA 事後檢定 Duncan 判定各組差異。若 p＜0.05，表示統計上具有顯著差異。
74
第三節 結果
壹、樣品對小鼠腎間質細胞存活率之影響
以 1 mM FAs 誘發腎間質細胞 TG 堆積模式中，將不同濃度之樣品與 1 mM FAs 誘發劑共同培養 24 小時後，利用 MTT 測試細胞存活率，監測實驗中各樣本 濃度是否影響 MC 細胞生長狀況，以避免因細胞生長狀態不同造成誤差。
各種樣品不同濃度對於 MC 細胞存活率的影響如圖 5-1 所示。結果 daidzein 及 equol 在 2~50 μM 的濃度之下，皆不影響細胞之存活率；genistein 在濃度 50 μM 存活率僅剩 47 % (p < .05)，而濃度降低至 10 μM 以下，皆不影響細胞存活率。(圖 5-1)
貳、樣品對小鼠腎間質細胞內三酸甘油酯含量之影響
1 mM fatty acids mixture 的濃度相較於控制組，顯著增加細胞內 TG 堆積，
達 4.2 倍 (p < .05)。當投予不同劑量之樣品與之共同培養，結果發現 daidzein、
genistein 與 equol 在不同劑量下，相較於刺激組皆無顯著影響細胞內 TG 含量。(圖 5-2)
参、樣品對小鼠腎間質細胞內膽固醇含量之影響
以 1 mM fatty acids mixture 刺激可顯著增加細胞內膽固醇含量，為控制組的 2.8 倍 (p < .05)。投予 daidzein 與 genistein 與之共同培養，發現在不同劑量下，
相較於刺激組皆無顯著影響細胞內膽固醇含量；而 equol 在 2 μM、10 μM 及 50 μM 濃度下，相較於刺激組，細胞內膽固醇含量皆有減少，分別達顯著下降 15 %、
17 %及 15 % (p < .05)。(圖 5-3)
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肆、脂肪酸誘導小鼠腎間質細胞 MCP-1 分泌之時程
以 1 mM fatty acids mixture 培養液於腎間質細胞分別培養 24、48、72 小時 後，收取上清液測量 MCP-1 蛋白質表現量以建立 MCP-1 誘發時間條件。結果顯 示，培養 24 小時即可顯著誘導 MCP-1 過度分泌，培養至 72 小時仍然顯著增加 (圖 5-4)，故選用 24 小時作為 MCP-1 誘發時程。
伍、樣品對脂肪酸誘導小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 之影響
使用 1 mM fatty acids mixture 刺激組的 MCP-1 含量相較於控制組，顯著增加 細胞分泌 MCP-1 達 2.4 倍 (p < .05)。投予 2 μM、10 μM 及 50 μM daidzein，相較 於刺激組，細胞分泌之 MCP-1 含量有下降的趨勢，其中 10 μM 及 50 μM 相較於 刺激組分別顯著下降 50 %及 96 % (p < .05)；genistein 濃度在 2 μM 及 10 μM，細 胞分泌之 MCP-1 含量皆有減少，但只有劑量 50 μM 達顯著下降 62 % (p < .05)；
equol 在 2 μM、10 μM 及 50 μM 濃度下相較於刺激組，細胞分泌之 MCP-1 含量 有下降的趨勢，而只有 50 μM 達顯著下降 51 % (p < .05)。(圖 5-5)
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control 2 10 50 2 10 50 2 10 50 Daidzein(M) Genistein(M) Equol(M)
cell viability (% of control)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
1mM fatty acids (+) 1mM fatty acids (-)
圖 5-1. 1 mM fatty acids 及 daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞存活率 的影響
Fig 5-1. Effects of 1 mM FA alone or FA plus daidzein, genistein, or equol on viability of mouse renal mesangial cell. The cells were treated with1 mM FA plus daidzein, genistein, and equol for 24 hrs. Values are means ± S.D. Data were analyzed by Student’s t-test, n = 3. *Significantly different from the control group. (p < .05)
*
77
control 1mM FA 2 10 50 2 10 2 10 50 (M) daidzein genistein equol 1mM fatty acids
TG content (% of control)
0
圖 5-2. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞內三酸甘油酯含量的影響 Fig 5-2. Effects of daidzein, genistein, and equol on cellular triacylglycerol (TG) content in mouse renal mesangial cell. The cells were treated with medium
containing 1 mM fatty acids and different concentrations of daidzein, genistein and equol for 24 hrs. The results were presented as cellular TG relative to the untreated cells (relative value = 100). Values are means ± S.D. Data were analyzed by one-way ANOVA and Duncan multiple comparison test. n=3.
78
control 1mM FA 2 10 50 2 10 2 10 50 (M) daidzein genistein equol 1mM fatty acids
TC content (% of control)
0
圖 5-3. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞內膽固醇含量的影響 Fig 5-3. Effects of daidzein, genistein, and equol on cellular cholesterol (TC) content in mouse renal mesangial cell. The cells were treated with medium containing 1 mM fatty acids and different concentrations of daidzein, genistein and equol for 24 hrs. The results were presented as cellular cholesterol relative to the untreated cells (relative value = 100). Values are means ± S.D. Data were analyzed by one-way ANOVA and Duncan multiple comparison test. n=3.
79
24 48 72 Time (hr)
MCP-1 (pg/mL)
0 2000 4000 6000 8000 10000
control
1mM fatty acids
*
*
*
圖 5-4. 不同時程 1 mM fatty acids 誘發小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 之誘發 Fig 5-4. Time course of MCP-1 secretion induced by 1 mM fatty acids in mouse renal mesangial cell. The cells were treated with medium containing 1 mM fatty acids for 24, 48, 72 hrs. Medium was collected for MCP-1 analysis by ELISA. Values are means ± S.D, n=3. *Significantly different from the control group each time analyzed by Student’s t-test. (p < .05)
80
control 1mM FA 2 10 50 2 10 2 10 50 (M) daidzein genistein equol 1mM fatty acids
MCP-1 (pg/mL)
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
a b b
b b
c
c
c c
c
圖 5-5. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 含量的影響 Fig 5-5. Effects of daidzein, genistein, and equol on MCP-1 secretion in mouse renal mesangial cell. The cells were treated with medium containing 1 mM fatty acids and different concentrations of daidzein, genistein and equol for 24 hrs. Values are means ± S.D. Data were analyzed by one-way ANOVA and Duncan multiple comparison test. n=3.
81
第四節 討論與結論
壹、脂肪酸模式之建立
研究指出由於高脂飲食或是糖尿病會引起過多游離脂肪酸在肥胖者上造成 其腎臟損傷 (Wahba & Mak, 2007)。先前本實驗以 1 mM FA 長鏈脂肪酸成功誘發 肝細胞 TG 堆積，使用相同之 1 mM FAs mixture 刺激腎間質細胞 TG 堆積，與控 制組相比可顯著增加達 4.2 倍 (見圖 5-2)。此外，當腎臟 MCP-1 表現增加為腎臟 損傷的特徵之一，有一研究結果顯示，若能抑制 MCP-1 作用，有改善腎絲球硬 化的情形 (Kanamori et al., 2007)。本實驗同樣以 1 mM FAs mixture 成功刺激腎間 質細胞過度分泌 MCP-1 (見圖 5-4)，建立高游離脂肪酸誘發小鼠腎間質細胞過度 生成 TG 之堆積與 MCP-1 分泌之細胞模式。
貳、大豆異黃酮對腎間質細胞毒性之影響
本研究結果顯示 genistein 在濃度 50 μM 情況下造成小鼠腎間質細胞存活率 僅剩 47 %。許多細胞實驗研究 genistein 使用 rat MC 或是 human MC。有研究使 用 rat MC 並投予不同劑量之 genistein (1, 10, 25, 50 μmol/L)，發現有
dose-dependent 抑制 MMP-9 (Yokoo & Kitamura, 1996)；Hirakata 等人同樣使用 rat MC，但給予 genistein 劑量為 100 μmol/L 可抑制 TGF-β (Hirakata, et al., 1997)。
推測由於大鼠和小鼠細胞之耐受性不同，即使相同濃度之 genistein 也會造成不同 之結果。在人體實驗方面，有研究給予 80 名停經婦女 100 mg/day isoflavone(約 含 50 % genistein 與 35 % daidzein)為期十個月，結果血漿 genistein 濃度為 144.3±50.5 μmol/dl (Nahas et al., 2007)。Tanaka 等人提供 60 mg/day isoflavones (包 含 59.5 mg 之醣基形式與 0.5 mg aglycone 形式，而其中含有 0.2 mg daidzein、0.1 mg genistein)給 28 位健康男性，為期三個月，血清 genistein 濃度自開始 81.7±80.0
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上升至 97.6±97.8 ng/ml (Tanaka et al., 2009)。另有一橫斷研究使用 soy food frequency questionnaire (soy FFQ)調查 96 名停經婦女攝取大豆異黃酮之情況，結 果發現平均每週攝取 8.1±7.7 mg 之 genistein，其血漿 genistein 濃度為 12.2±4.3
上升至 97.6±97.8 ng/ml (Tanaka et al., 2009)。另有一橫斷研究使用 soy food frequency questionnaire (soy FFQ)調查 96 名停經婦女攝取大豆異黃酮之情況，結 果發現平均每週攝取 8.1±7.7 mg 之 genistein，其血漿 genistein 濃度為 12.2±4.3