大豆異黃酮對肝細胞、腎間質細胞脂質堆積與發炎，及停經婦女之影響

全文

(1)國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系營養科學與教育組. 碩士論文. 大豆異黃酮對肝細胞、腎間質細胞脂質堆積與發炎，及停經婦女之影響 The Effects of Soy Isoflavone on Lipid accumulation and Inflammation in HepG2 cells, Mouse renal mesangial cells and Postmenopausal Women. 指導教授：吳文惠博士 (Wen-Huey Wu, Ph.D.) 研究生：賴佩郁 (Pey-Yuh Lai) 中華民國 101 年 1 月.

(2)

(3) 謝誌經歷了三年的風風雨雨，很難相信有這麼一天我會坐著這裡打出謝誌，期間歷經過低潮、退縮、想放棄，但是在我身邊的親朋好友以及師長的幫助與鼓勵下，我也完成了我人生的第一本鉅作，雖稱不上曠世，但也足夠讓我驕傲。首先要感謝我的指導教授、恩師吳文惠老師，從大學時期至研究所一路接受老師的諄諄教誨，每有疑難雜症在老師輕輕的指點下就豁然開朗，這六年的時間真的很謝謝老師的包容與體諒，也請老師要照顧自己的身體，永遠健健康康、笑容滿滿!感謝蔡帛蓉老師，在研究的路上提點迷津，總是受到老師關懷安慰的話語，讓我滿懷感激，也要請老師永保開開心心的心!還要謝謝百忙抽空擔任口委的葉松鈴老師，提供寶貴的意見給予指導，讓我的論文更加完善。謝謝擔任我人體實驗的十位受試者媽媽和阿姨們，有妳們的耐心配合，每天不厭其煩親自來實驗室領取豆漿，才能讓我的實驗得以順利進行。也很感謝台大食科所的心羽學姐，在我去台大磨豆漿的時期，都非常耐心給予我所有的幫助與指導。謝謝我的小細胞們，沒有穩定成長的你們就沒有我的細胞實驗。感謝歡樂無限實驗室，讓我的研究生活不覺枯燥乏味!感謝超佛心靜玫阿濟，在我實驗遇到瓶頸時都能替我想到絕佳解決方案，常常開導鼓勵我，真的好謝謝妳!感謝小女人妙麗阿濟，謝謝妳在實驗路上的指點，非常崇拜妳在小黑小白上那出神入化的技巧。很謝謝研究所一路陪伴我開心傷心的好夥伴仲潔，在我遇到困難時都不吝惜給我幫助，有妳爽朗的聲音時時帶動實驗室氣氛，真的很高興這一路上有妳!謝謝聰明的聰聰，一起分憂解勞，多虧妳發明的煮豆漿法，讓我事半功倍。謝謝若涵，有妳一起在實驗室同甘共苦、一起分享很多好玩有趣的事情真好!謝謝宥苡，大學同窗再加上研究所，我們真的認識好久好久，當我遇到實驗問題時，經過妳那畫龍點睛的解釋，都讓我茅塞頓開!謝謝小彬彬常幫我加油打氣，好心出借亮橘色保溫袋讓我攜帶豆漿方便快速!謝謝佑家、小新、育亭、文程公主，很謝謝你們給予實驗方法技巧上的指導。謝謝小學妹鈺涵和雅欣，有妳們兩個超可愛同為台南鄉親的支持，讓實驗室.

(4) 更增添樂趣!謝謝葵蓉，在我急需統計高手與飯友時及時伸予援手。謝謝盈堤、嘉玲和幸芷，有妳們一起在不見天日地下室奮鬥打拼，不覺孤單! 謝謝高中與大學好友們的加油打氣，當我感到疲憊想哭時，都有你們適時的關懷鼓勵，讓我有動力堅持下去! 感謝我最親愛的家人，謝謝爸爸給予我所有的支持與鼓勵，讓我無後顧之憂完成學業；謝謝媽媽無私的奉獻與包容、在我無助需要幫忙時都能拉我一把；謝謝賴弟在我有問題需要時都能隨時幫助我；謝謝阿嬤在我回台南休憩時都會煮豐盛等待我；謝謝表兄弟姐妹們時時鼓勵我；這三年讓你們擔心許多，但你們就是我永遠的避風港，給我信心還有正面力量，我愛你們! 感謝上天提供這樣的環境淬鍊我、成長我，雖然研究路上跌跌撞撞，但都會適時出現貴人逢凶化吉，在大家的幫助與鼓勵下，我完成了人生的一個里程碑，沒有你們就沒有這樣一本論文、這樣的我，永遠謝謝你們!. 佩郁. 2012/2.

(5) 中文摘要停經婦女由於缺乏雌激素，會造成體重、腹部脂肪量、腰圍以及心臟病危險因子增加。許多研究指出肥胖與非酒精性脂肪肝或是腎臟脂毒性之間具有高度相關。大豆異黃酮為植物性雌激素之一種，對心血管疾病與代謝症候群具有保護作用。本研究分別以人體及細胞實驗模式，探討介質研磨豆漿對於停經婦女之影響，以及大豆異黃酮對肝細胞、腎間質細胞脂質堆積與發炎之影響。人體實驗：招募 10 位健康、腰圍大於 80 cm、停經一年以上之婦女，採用隨機、單盲之交叉試驗。試驗期 5 人先飲用介質研磨豆漿 4 週，經 3 週的洗滌期 (wash-out period)後，改飲用傳統豆漿 4 週，另外 5 人次序相反，每日分早晚兩次飲用 (500 ml/day)。比較體重、BMI、腰圍、腰臀比、血糖、胰島素、creatinine、 GOT、GPT、血脂 (TG、TC、NEFA、HDL、LDL)、發炎因子 CRP 與性激素結合球蛋白(SHBG)濃度的變化。結果顯示上述所有數值不因投予傳統豆漿或介質研磨豆漿而有顯著改變。另分析受試者之尿液異黃酮含量，結果發現攝取介質研磨豆漿而非傳統豆漿，有顯著增加尿中異黃酮含量。細胞實驗：以人類肝癌細胞株 (HepG2)為模式，以 1 mM 脂肪酸 (Oleic acid、Palmitic acid、Stearic acid、Linoleic acid、Arachidonic acid, 1 mM FA)或 5 μl/ml intralipid 兩種模式誘發細胞內 TG 堆積，並投予不同劑量之大豆異黃酮 (daidzein, genistein 與 equol)，共同培養 24 小時或 48 小時。結果發現，脂肪酸模式下，大豆異黃酮對肝細胞內 TG 與膽固醇含量無顯著影響；但在 intralipid 模式，大豆異黃酮能顯著降低肝細胞內 TG 與膽固醇含量。細胞實驗：以小鼠腎間質細胞 (mouse renal mesangial cell, MC)為模式，以 1 mM FA 誘發細胞內 TG 堆積，並投予不同劑量之大豆異黃酮共同培養 24 小時。結果顯示，大豆異黃酮對 MC 細胞內 TG 含量無顯著影響，但發現 equol 能顯著下降細胞內膽固醇含量。另外，用此刺激模式誘發 MC 細胞分泌促發炎激素單核球趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)，結果發現 daidzein、 I.

(6) genistein、equol 皆能顯著下降 MC 細胞分泌 MCP-1。總結：介質研磨豆漿或許能提高停經婦女對大豆異黃酮的生物利用率。在體外實驗，大豆異黃酮能降低 intralipid 誘發之肝細胞 TG 與膽固醇含量，並且能顯著降低由 FA 誘發之腎間質細胞分泌 MCP-1。. 關鍵詞：大豆異黃酮、停經婦女、脂質堆積、HepG2、小鼠腎間質細胞. II.

(7) Abstract Postmenopausal women increase body weight, abdominal fat mass, waist circumference, and risks of heart disease due to the lack of estrogen. Many studies revealed a strong association between obesity and nonalcoholic fatty liver, or renal lipotoxicity. Soy isoflavones, partly as a phytoestrogen, have protective effects on cardiovascular diseases and metabolic syndrome. This study investigated the effects of media-milled soymilk in postmenopausal women and soy isoflavones on lipid accumulation and inflammation in HepG2 cells and mouse renal mesangial cells (MC). In human study, a randomized, single-blinded and crossover-controlled trial was conducted on ten apparently healthy postmenopausal women with the waist circumference over 80 cm. Subjects were supplemented with 500 ml/day either media-milled soymilk or tranditional soymilk for 4 weeks each, which were intervened by a wash-out period of 3 weeks. Fasting blood and first morning urine samples were collected at baseline and at the end of each feeding phase for the measurements of blood biochemical indices (glucose, insulin, creatinine, GOT and GPT), blood lipids (TG, TC, NEFA, HDL and LDL), C-reactive protein and sex-hormone binding globulin. No significant changes in these parameters were found. Analysis of urinary genistein, daidzein, and equol showed the levels were increased significantly by media-milled soymilk but not traditional soy milk. In HepG2 study, cells were treated with 1 mM fatty acid (FA) mixture containing oleic, palmitic, stearic, linoleic and arachidonic acids, or 5 μl/ml intralipid for 24h or 48h to induce intracellular TG accumulation. The results showed the co-incubation of daidzein, genistein or equol did not decrease intracellular TG and cholesterol content in 1 mM FA model, but significantly suppressed intracellular TG and cholesterol accumulation in intralipid model. In MC study, cells were treated with 1 mM FA mixture with or without daidzein, genistein and equol for 24h to induce intracellular TG and cholesterol accumulation. Isoflavones did not affect intracellular TG content, but intracellular cholesterol level was decreased signigicantly by equol. Secretion of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) was increased by FA, but the level was significantly suppressed by the co-incubation of genistein, daidzein or equol. In conclusion, media-milled soymilk may increase the bioavailability of isoflavones in postmenopausal women. Genistein, daidzein and equol decrease intralipid-induced TG and cholesterol accumulation in HepG2, and significantly suppressed FA-induced MCP-1 secretion in MC cells. III.

(8) Keywords: soy isoflavones, postmenopausal women, lipid accumulation, HepG2, mouse mesangial cell. IV.

(9) 目錄中文摘要………………………………………………………................................... I Abstract ……………………………………………………………………………. III 目錄.............................................................................................................................. V 表目錄......................................................................................................................... IX 圖目錄......................................................................................................................... .X 第一章緒論............................................................................................................. 1 第二章文獻探討 ..................................................................................................... 3 第一節大豆異黃酮 (Soy isoflavone) .................................................................. 3 壹、大豆之介紹 ................................................................................................ 3 貳、大豆異黃酮之種類及代謝 ......................................................................... 4 参、大豆異黃酮之生理活性............................................................................. 8 第二節停經婦女 (Postmenopausal women) .......................................................12 壹、停經婦女之定義 .......................................................................................12 貳、停經婦女之生理變化 ...............................................................................12 参、停經婦女與腹部肥胖及代謝症候群之關係 .............................................13 肆、腹部肥胖造成之可能病理機轉 ................................................................14 第三節奈米科技 (Nanotechnology) ..................................................................16 壹、奈米之定義 ...............................................................................................16 貳、奈米科技...................................................................................................17 第四節非酒精性脂肪肝病 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) ............20 壹、非酒精性脂肪肝病之定義與病理機轉 ....................................................20 貳、大豆異黃酮對非酒精性脂肪肝之影響 ....................................................21 第五節腎臟損傷 (Renal injury) .........................................................................22 壹、腎臟脂毒性 (Renal lipotoxicity)與發炎之影響........................................22 V.

(10) 貳、大豆異黃酮對腎臟損傷之影響 ................................................................24 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響 ..............................................25 第一節前言 ........................................................................................................25 第二節研究材料與方法 .....................................................................................26 壹、研究對象...................................................................................................26 貳、研究設計...................................................................................................26 參、研究材料與藥品 .......................................................................................29 肆、樣本收集與處理 .......................................................................................33 伍、分析項目與方法 .......................................................................................34 第三節結果 ........................................................................................................37 壹、受試者基本資料 .......................................................................................37 貳、受試者體重、腰臀圍與血壓之變化情形.................................................37 参、受試者血糖與肝腎功能之變化情形 ........................................................37 肆、受試者血脂、發炎因子及性激素結合球蛋白之變化情形 ......................37 伍、受試者尿液異黃酮含量之變化情形 ........................................................38 第四節討論與結論.............................................................................................46 壹、受試者基本資料 .......................................................................................46 貳、受試者體重、腰臀圍與血壓之變化情形.................................................46 参、受試者血液生化值之變化情形 ................................................................47 肆、受試者血脂及發炎因子之變化情形 ........................................................47 伍、受試者性激素結合球蛋白之變化情形 ....................................................48 陸、受試者尿液異黃酮之變化情形 ................................................................48 柒、結論 ..........................................................................................................49 第四章大豆異黃酮對肝細胞脂質堆積之影響 ......................................................51 第一節前言 ........................................................................................................51 第二節研究材料與方法 .....................................................................................52 VI.

(11) 壹、實驗設計...................................................................................................52 貳、研究材料...................................................................................................52 参、樣品製備及取得 .......................................................................................53 肆、細胞存活率分析 (MTT assay) .................................................................54 伍、細胞內蛋白質濃度測定............................................................................55 陸、細胞內三酸甘油酯含量測定 ....................................................................56 柒、細胞內膽固醇含量測定............................................................................56 捌、統計分析...................................................................................................57 第三節結果 ........................................................................................................58 壹、樣品對 HepG2 細胞存活率之影響 ...........................................................58 貳、樣品對 HepG2 細胞內三酸甘油酯含量之影響 .......................................58 参、樣品對 HepG2 細胞內膽固醇含量之影響 ...............................................59 第四節討論與結論.............................................................................................64 壹、脂肪酸與 intralipid 兩種刺激模式............................................................64 貳、大豆異黃酮在兩種模式下對肝細胞脂質堆積之影響 .............................65 参、結論 ..........................................................................................................67 第五章大豆異黃酮對腎間質細胞脂質堆積與發炎之影響 ..................................68 第一節前言 ........................................................................................................68 第二節研究材料與方法 .....................................................................................69 壹、實驗設計...................................................................................................69 貳、研究材料...................................................................................................69 参、樣品製備及取得 .......................................................................................70 肆、細胞存活率分析 (MTT assay) .................................................................71 伍、細胞內蛋白質濃度測定............................................................................72 陸、細胞內三酸甘油酯含量測定 ....................................................................72 柒、細胞內膽固醇含量測定............................................................................72 捌、MCP-1 蛋白質含量測定 ...........................................................................72 VII.

(12) 玖、統計分析...................................................................................................73 第三節結果 ........................................................................................................74 壹、樣品對小鼠腎間質細胞存活率之影響 ....................................................74 貳、樣品對小鼠腎間質細胞內三酸甘油酯含量之影響 .................................74 参、樣品對小鼠腎間質細胞內膽固醇含量之影響 .........................................74 肆、脂肪酸誘導小鼠腎間質細胞 MCP-1 分泌之時程 ...................................75 伍、樣品對脂肪酸誘導小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 之影響 ........................75 第四節討論與結論.............................................................................................81 壹、脂肪酸模式之建立 ...................................................................................81 貳、大豆異黃酮對腎間質細胞毒性之影響 ....................................................81 参、大豆異黃酮對腎臟脂質堆積與發炎之影響 .............................................82 肆、結論 ..........................................................................................................83 第六章總結與未來建議 ........................................................................................84 第七章參考文獻 ....................................................................................................87 附錄一 ................................................................................................................... 102 附錄二 ................................................................................................................... 103 附錄三 ................................................................................................................... 105 附錄四 ................................................................................................................... 107 附錄五 ................................................................................................................... 109. VIII.

(13) 表目錄表 3-1. 介質研磨豆漿及傳統豆漿之蛋白質與異黃酮含量 ...................................30 表 3-2. 受試者基本資料 .........................................................................................39 表 3-3. 受試者體重、BMI、WHR、與血壓在試驗期間的變化...........................40 表 3-4. 受試者在試驗期間之血糖與肝腎功能 ......................................................41 表 3-5. 受試者在試驗期間之血脂、發炎因子與 SHBG 濃度 ...............................42 表 3-6. 受試者在試驗期間之尿液異黃酮含量 ......................................................43 表 4-1. 兩種刺激模式之成分 .................................................................................64 表 6-1. Daidzein、equol 與 genistein 對肝細胞與腎間質細胞的影響 ....................86. IX.

(14) 圖目錄圖 2-1. 異黃酮之化學結構式 .................................................................................. 7 圖 2-2. 異黃酮與其代謝之結構 .............................................................................. 8 圖 2-3. 肥胖與胰島素阻抗 .....................................................................................15 圖 2-4. 不同事物的尺度大小 .................................................................................16 圖 2-5. 肥胖與胰島素阻抗在腎臟血管及間質造成的發炎途徑............................23 圖 3-1. Cross-over 研究設計 ....................................................................................27 圖 3-2. 研究設計流程圖 .........................................................................................28 圖 3-3. 介質研磨及傳統豆漿之製程 ......................................................................31 圖 3-4. 奈米濕磨機 .................................................................................................32 圖 3-5. 進出料攪拌缸 .............................................................................................32 圖 3-6. 操作頁面.....................................................................................................32 圖 3-7. HPLC Daidzein、equol 與 genistein 波峰圖 ................................................44 圖 3-8. HPLC equol producer urine 波峰圖 ..............................................................44 圖 3-9. HPLC non-equol producer urine 波峰圖.......................................................44 圖 3-10. 兩位 equol producers 與八位 non-equol producers (means±SD)在攝取兩種豆漿前後之尿液 equol 排出曲線圖 ........................................................................45 圖 4-1. 1 mM fatty acids 及 daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞存活率的影響 60 圖 4-2. Intralipid 及 daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞存活率的影響 ............61 圖 4-3. Daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞內三酸甘油酯含量的影響 ............62 圖 4-4. Daidzein、genistein 與 equol 對肝細胞內膽固醇含量的影響 ....................63 圖 4-5. SREBP-1c 參與脂質生合成作用.................................................................65 圖 4-6. 大豆異黃酮經由抑制 SREBP 抑制膽固醇生成之路徑 .............................67 圖 5-1. 1 mM fatty acids 及 daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞存活率的影響 .....................................................................................................................76 X.

(15) 圖 5-2. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞內三酸甘油酯含量的影響 .................................................................................................................................77 圖 5-3. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞內膽固醇含量的影響.....78 圖 5-4. 不同時程 1 mM fatty acids 誘發小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 之誘發 .....79 圖 5-5. Daidzein、genistein 與 equol 對小鼠腎間質細胞分泌 MCP-1 含量的影響 .................................................................................................................................80. XI.

(16) 第一章緒論. 第一章緒論大豆及其製品在中國已有超過二千年的歷史，自古以來也是亞洲東方地區食用的傳統食品之一。其含有豐富的蛋白質及多種維生素，營養價值高。而大豆中的大豆異黃酮 (soy isoflavone)包括 daidzein、equol、genistein 在許多研究也發現能預防心血管疾病、癌症、骨質疏鬆症，改善停經症候群，具抗氧化能力等(Cassidy, 1996; Han et al., 2002; Ma et al., 2008; Xiao et al., 2008)。由於其與女性荷爾蒙雌二醇 (17β-estradiol)之構造與作用相似，會與雌激素受器 (estrogen receptor)結合，因此具有雌激素活性 (Tham et al., 1998)，在停經婦女雌激素的治療上具有重要影響。女性停經後由於體重、腹部脂肪量及其分布、腰圍的增加，會造成代謝症候群 (metabolic syndrome)的發生率與心臟病危險因子的上升 (Lobo, 2008)。代謝症候群是指一群代謝危險因子，例如：肥胖 (obesity)、高血糖、高血壓 (hypertension)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)濃度低及低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)濃度高等。此外，非酒精性脂肪肝 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、腎臟脂毒性 (renal lipotoxicity)、肥胖及代謝症候群之間有高度的相關性 (Rector et al., 2008; Wahba & Mak, 2007)。而大豆異黃酮具有雌激素活性，對心血管疾病與代謝症候群可能具有保護作用。故本研究給予停經婦女攝取富含大豆蛋白與異黃酮之介質研磨及傳統兩種不同製成之豆漿，探究婦女停經後伴隨而來的代謝危險因子，是否能有改善效果；以及比較兩種豆漿在尿液異黃酮含量上是否有影響。體外模式一，選用人類肝癌細胞株 (human hepatoblastoma G2, HepG2)，以脂肪酸與 intralipid 兩種刺激模式誘發細胞內三酸甘油酯 (triglycerides, TG)堆積，模擬脂肪肝形成，以探討大豆異黃酮對於脂肪肝防治之功效。體外模式二，選用小鼠腎間質細胞株 (mouse 1.

(17) 第一章緒論. renal mesangial cell line)為模式，以脂肪酸誘發細胞內 TG 堆積與刺激細胞過度分泌 MCP-1，探究大豆異黃酮對於腎間質細胞脂質堆積與抑制 MCP-1 分泌之影響，是否具有預防腎臟脂毒性之形成與抑制發炎情形。. 2.

(18) 第二章文獻探討. 第二章文獻探討第一節大豆異黃酮 (Soy isoflavone) 壹、大豆之介紹 (一) 大豆大豆 (亦稱黃豆，soybean)，其學名 (Glycine max (L.) Merrill)，屬於莢豆科 (Leguminosae)、大豆屬 (Glycine)，為一年生草本植物。明代《本草綱目》記載大豆味甘，性平，入脾、大腸經；能「治腎病，利水下氣，製諸風熱，活血，解諸毒」，也就是說其有解毒滋補的功效，可以消除體內瘀血、消腫治痛，並可促進消化、改善腹脹，對風濕及中風引起偏癱也有一定的功效 (國學書院系列編委會，2009)。大豆為豐富蛋白質的來源，主要三大營養素比例為35 %蛋白質、24 %醣類及19 %脂肪，其他另有不飽和脂肪酸、大豆卵磷脂 (soy lecithin)、皂素 (saponins)、膳食纖維、維生素B1、B6、E及礦物質鈣、鉀、磷、鎂等 (劉益廣， 2008)。另外，根據許多流行病學研究，發現大豆的高攝取能下降心血管疾病 (cardiovascular disease)、荷爾蒙相關的乳癌 (breast cancer)及前列腺癌 (prostate cancer)、停經症候群 (menopausal syndrome)、大腸癌 (colon cancer)、骨質疏鬆症 (osteoporosis)等疾病的發生 (Adlercreutz, 1990; Adlercreutz et al., 1992; Clarkson, 2000; Wu et al., 1998; H. Yu et al., 1991)。. (二) 豆奶豆奶 (亦稱豆乳、豆漿，soymilk)為亞洲地區廣泛利用的大豆加工製品之一。 3.

(19) 第二章文獻探討. 豆奶為大豆之水萃物，外觀呈白色乳狀，一般豆奶的製作過程為大豆經篩選、清洗、浸泡、磨碎、加熱及濾除豆渣即為豆奶之成品，而工廠製作之豆奶必須再經過脫臭、調味、均質化及殺菌後再進行充填製成豆奶之產品。在製作豆奶前先浸泡大豆可減少後續磨豆過程當中能源的耗損，進而提高豆奶產率。此外，生大豆中含有胰蛋白酶抑制劑 (trypsin inhibitor)，進入哺乳類動物的消化道後，會抑制消化道中的蛋白酶活性，使動物無法完全的消化與吸收養分，加熱的功用不僅可以達到殺菌的目的，還能去除豆臭味和抑制蛋白酶抑制劑的活性，藉此提升豆奶之營養價值 (陳世爵，1986)。豆奶保留許多大豆中的營養成分，包括蛋白質、不飽和脂肪酸及多種維生素，且不含膽固醇及乳糖，可作為對牛奶過敏者、乳糖不耐受者及素食主義者一個很好的營養補充品 (J.-R. Liu & Lin, 2000)。另外，也有研究發現豆奶有下降血壓 (Rivas et al., 2002)、抗氧化的能力 (Y.-C. Wang et al., 2006)，Tsai 等人使用倉鼠，發現豆奶能降低血清膽固醇及下降主動脈的動脈硬化斑塊，因此具有預防動脈粥狀硬化的功效 (Tsai et al., 2009)。. 貳、大豆異黃酮之種類及代謝 (一) 大豆異黃酮 (soy isoflavone) 植物性雌激素 (phytoestrogens)主要有三類：異黃酮 (isoflavones)、木質素 (lignans)及香豆素 (coumestanes)，其中異黃酮是目前研究最為廣泛的。異黃酮大都存在於大豆中，屬於酚類化合物 (phenolic compound)下之類黃酮 (flavonoids) 的家族成員之一 (R. H. Liu, 2004)。大豆異黃酮主要可以分為三種，且每一種各有四種化學結構，包括不具醣基 (aglycones)形式與三種具醣基 (glycosides)形式，有含 β-葡萄糖苷 (β-glucosides)形式、含乙醯葡萄糖苷 (acetylglucosides)形式、以及含丙二醯葡萄糖苷 (malonylglucosides)形式，共有十二種衍生物 (Nurmi 4.

(20) 第二章文獻探討. et al., 2002) (圖 2-1)。其中之 genistein、daidzein 及 daidzein 代謝後之產物 equol (圖 2-2)，被認為是在許多生理方面最具有良好的功效 (Hutchins et al., 1995)。異黃酮因與女性荷爾蒙雌二醇 (17β-estradiol)之構造與作用相似，因此具有雌激素活性 (Tham, et al., 1998)。雌激素有兩種雌激素受器 ERα (estrogen receptor-alpha)與 ERβ (estrogen receptor-beta)兩種，兩種接受器的功能相似，不過在調節機制、分佈及對物質結合親和力上卻不盡相同，ERα 多分佈於卵巢、子宮、睪丸、腎上腺、腦下垂體等器官，而 ERβ 主要分佈在心臟、卵巢、骨骼、血管、腦、腎、尿道等器官 (Enmark & Gustafsson, 1999)。異黃酮會與雌激素受器結合，因此展現了雌激素活性 (estrogenic)與拮抗雌激素活性 (anti-estrogenic)的作用；且與 ERβ 的親和性大於 ERα (Kuiper et al., 1998)，因此可以解釋當器官組織有較多的 ERβ 表現時，也是異黃酮較具有影響的地方 (Anderson et al., 1999)。由於異黃酮同時具有雌激素促進劑 (agonistic)與拮抗劑 (antagonistic)的效用，因此可視為一種選擇性雌激素受體調節器 (selective estrogen receptor modulators, SERMs)。. (二) 大豆異黃酮之代謝大豆異黃酮與許多營養素相同，主要在生物體的小腸內被吸收，不過具醣基形式的異黃酮因其分子量大與較高的親水性，使其在小腸的吸收較差 (X. Xu et al., 1995)。需要將具醣基部分水解成不具醣基形式，始能透過被動運輸快速通過小腸絨毛刷狀緣；此外，葡萄糖苷酶 (glycosidase)可作用在食物本身、胃腸黏膜細胞或透過結腸微生物的分泌 (Scalbert & Williamson, 2000)。不具糖苷形式的異黃酮可在十二指腸空腸近端進行水解而吸收 (Watanabe et al., 1998)。異黃酮吸收後進入肝臟後經由酵素轉化作用進行醣醛酸苷化 (glucuronidation) 形成複合物，並經由尿液及糞便排出體外 (Axelson, 1984)。小腸黏膜細胞及細菌皆會分泌 β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)幫助異黃酮去 5.

(21) 第二章文獻探討. 醣基 (Winter & Bokkenheuser, 1987)。哺乳類的 β-葡萄糖苷酶主要儲存在小腸、肝臟及腎臟 (A. J. Day et al., 1998)。另外腸道中的細菌，像是 Bacteroides、 Bifidobacteria 也能製造 β-葡萄糖苷酶，幫助腸道吸收 (X. Xu, et al., 1995)。所以維持正常的腸道菌落對於在攝取大豆異黃酮或其補充品之餘也是相當重要的。. (三) 大豆異黃酮之生物利用率 Equol 是 daidzein 在腸道經腸道細菌代謝產生出的獨特產物，但並非所有人都可以將 daidzein 代謝為 equol (Decroos et al., 2005)。Lampe 等人研究不同種族吃大豆製品會代謝產生出 equol 的族群比例，發現白人族群為 30~40 %，亞洲地區為 45~60 % (Lampe et al., 2001)。Equol 為對掌光學異構物，包括有 R-equol 及 S-equol 二種；研究發現 S-equol 與 ERβ 的親和性佳，而 R-equol 則與 ERα 的親和性佳 (Muthyala et al., 2004)。許多研究指出 equol 在抗氧化及與雌激素受器結合的能力都比 daidzein 來的佳 (Mitchell et al., 1998; Sathyamoorthy & Wang, 1997)。有許多研究顯示，不只有一種細菌可以將 daidzein 代謝產生 equol (Decroos, et al., 2005; Hur et al., 2000)。因此，有無 equol 的產生，可能取決於個體的菌落組成與細菌酵素的表現 (Turner et al., 2003)。尿液 equol 的排泄似乎與 daidzein 及 ODMA (O-desmethylangolensin)呈現負相關(圖 2-2) (Lampe, et al., 2001)，可以表示 daidzein 要優先代謝為 equol 或是 ODMA，決定於腸道細菌或其他內在因素 (Larkin et al., 2008)。個體產生 equol 的能力與腸道菌落的平衡之間之關係雖然目前尚不清楚，但可能與攝取大豆及其製品時對健康之益處有關 (Atkinson et al., 2005)。飲食對大豆異黃酮之生物利用率的影響很重要，因為飲食習慣對腸道細菌組成有很大的影響，遺傳也會決定吸收和代謝的路徑，因而影響異黃酮生物利用率的程度 (Larkin, et al., 2008)。 6.

(22) 第二章文獻探討. 圖 2-1. 異黃酮之化學結構式 (Nurmi, et al., 2002). 7.

(23) 第二章文獻探討. 圖 2-2. 異黃酮與其代謝之結構 (Larkin, et al., 2008). 参、大豆異黃酮之生理活性已有許多文獻指出大豆異黃酮在很多疾病及一些疾病的風險因子都有預防及降低的效果 (Adlercreutz, 1999; Setchell, 1998; Setchell & Cassidy, 1999; Tham, et al., 1998)，以下分別敘述之： 8.

(24) 第二章文獻探討. (一) 預防心血管疾病心血管疾病與飲食及一些風險因子，像是高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症與低密度脂蛋白膽固醇 (low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)升高、高密度脂蛋白膽固醇 (high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)降低、高血壓、肥胖與糖尿病有關係 (Erdman, 2000)。已有很多 in vivo 及 in vitro 實驗證實大豆蛋白及大豆異黃酮能夠降低心血管疾病的風險，包括了降低總膽固醇 (total cholesterol, TC)、三酸甘油酯 (triacylglycerol, TG)、及增加 HDL/LDL ratio 透過體內脂質代謝的調控，像抑制膽固醇吸收、增加膽酸 (bile acid)排除及向上調控肝臟 LDL receptor 活性等 (Owen et al., 2004; Xiao, et al., 2008)。Lichtenstein 的研究指出膽固醇之下降可透過甲狀腺功能、膽酸之平衡及 genistein 和 daidzein 的雌激素活性等機制調控 (Lichtenstein, 1998)。 Wangen 等人針對停經婦女給予三種濃度的大豆異黃酮，包括 7、65 及 132 mg/day，發現下降 LDL-C 濃度，且有 dose-dependent 的效應 (Wangen et al., 2001)。美國的 Framinghan 研究，發現大豆異黃酮的攝取與三酸甘油酯濃度及代謝症候群指數呈現負相關 (de Kleijn et al., 2002)。Goodman-Gruen 與 Kritz-Silverstein 給停經婦女每日 1.3 mg 的 genistein 補充，發現其與 HDL-C 濃度呈正相關、而與胰島素含量呈現負相關 (Goodman-Gruen & Kritz-Silverstein, 2001)。. (二) 預防癌症有大量流行病學研究顯示，不同種族的癌症發生率有顯著的差異，被認為部分歸因於飲食習慣。與亞洲國家相比，如日本和中國，美國和歐洲國家的乳癌、前列腺癌及大腸癌發生率遠高於前述兩個國家，其中一個主要原因是日本和中國攝取大量傳統飲食─大豆及其製品 (Sarkar & Li, 2003)。Cassidy的研究指出大豆異黃酮抗癌的機制是透過其雌激素受器的表現，藉由與雌激素競爭相同之標的接 9.

(25) 第二章文獻探討. 受器 (target receptor)，以減少天然雌激素促進細胞增生作用，進而達到抑制高活性雌激素所造成的癌症 (Cassidy, 1996)。目前研究大豆異黃酮抑制癌症之機制尚有：腫瘤血管生成之抑制劑、抑制腫瘤細胞生長、抑制酪胺酸酶 (tyrosine kinase) 及DNA拓樸異構酶 (DNA topoisomerase)的活性、調節細胞凋亡 (apoptosis)等 (Boersma et al., 2001; Klein, 2005; Su et al., 2005) Peterson與Barnes的研究發現，genistein可抑制人類乳癌細胞：MDA-468、 MCF-7及MCF-7-D-40的生長 (Peterson & Barnes, 1991)。但另有研究發現， genistein和daidzein能有效延長大鼠乳癌細胞之潛伏期，且針對腫瘤也有降低發生率及生長量，但是對於已成熟之癌細胞則失去降低其數量及大小的能力 (Jin & MacDonald, 2002)。. (三) 改善停經症候群婦女停經後，雌激素分泌量逐漸減少，會有許多不適症狀產生，像是熱潮紅 (hot flash)、失眠 (insominia)、心悸、盜汗等，此外，也會因雌激素分泌不足而致罹患心血管疾病、骨質疏鬆症等疾病的機率升高 (Hernandez et al., 2003; Lobo, 1989)。許多文獻發現，異黃酮可以改善停經症候群之症狀，由於不含糖苷形式之異黃酮結構類似動物雌激素 (17β-estradiol)，故可與雌激素受器與性激素結合球蛋白 (sex hormone-binding globulin, SHBG)結合，亦能促進SHBG合成，取代原本與SHBG鍵結之雌激素或其他荷爾蒙，使荷爾蒙與正確標的細胞結合 (Han, et al., 2002; Hendrich, 2002; Howes et al., 2006)。. (四) 預防骨質疏鬆症雌激素在骨質含量之維持發揮重要作用，停經後血清雌激素濃度下降致雌激素缺乏而加速骨質流失，因而易造成骨質疏鬆症 (osteoporosis)。有研究發現 genistein、daidzein 可增強骨合成細胞 (MC3T3-E1 cells)的礦物質化作用 (bone 10.

(26) 第二章文獻探討. mineralization) (Kanno et al., 2004)、抑制大鼠蝕骨細胞的活性 (Gao & Yamaguchi, 2000)。有很多人體實驗針對停經婦女攝取大豆異黃酮，觀察其骨質含量、骨質密度 (bone mineral density, BMD)等。一個後設分析研究指出，停經婦女攝取大豆異黃酮可增加脊椎骨質密度 (Ma, et al., 2008)。Legette 等人餵予去卵巢大鼠不同劑量之 equol (0、50、100 與 200 mg/kg diet)，發現接受 200 mg equol/kg 的去卵巢鼠其股骨鈣離子濃度比低劑量的高，但仍比假手術的濃度低 (Legette et al., 2009)。. (五) 抗氧化能力植物性雌激素具有酚類結構，具有抗氧化的能力，而異黃酮屬於此家族之一，也同樣有此活性 (Mitchell, et al., 1998)。異黃酮抗氧化的機制主要為提供氫原子來清除自由基、螯合金屬離子及抑制脂質過氧化酶等 (Romero et al., 2004)。此外，大豆異黃酮會透過抑制脂質的過氧化 (peroxidation)，特別是 LDL 來調節脂質代謝 (Larkin, et al., 2008)。Harper 等人研究發現，異黃酮抑制 DNA 氧化之機制可透過羥自由基之清除、與鐵螯合及與 DNA 結合等 (Harper et al., 1999)。. (六) 其他功能目前研究發現大豆異黃酮在其他生理功能尚有：genistein 可作為抗發炎之物質，透過影響顆粒球 (granulocytes)、單核球 (monocytes)及淋巴球 (lymphocytes) 來調節 (Verdrengh et al., 2003)；調節健康停經婦女的 B cell 之免疫功能 (Ryan-Borchers et al., 2006)；不論男性或女性，均可顯著改善短期和長期記憶 (File et al., 2001)。. 11.

(27) 第二章文獻探討. 第二節停經婦女 (Postmenopausal women) 壹、停經婦女之定義根據行政院衛生署對更年期 (climacteric)及停經 (menopause)的定義：女性在四、五十歲時，因為卵巢功能逐漸萎縮，雌激素分泌逐漸減少，月經週期變的不規則，終至完全停止，並且一年以上不再有月經，這種現象稱作停經。而婦女卵巢生理機能逐漸減退以致完全喪失的這段過渡時期稱為更年期 (行政院衛生署，2002)。如將婦女生命週期以月經的有無來做區分，可分為三個階段：停經前 (premenopause)指月經週期仍規律，停經中期 (perimenopause)指更年期開始至停經及停經後 (postmenopause)。另外，Jonathan (2002)在 Novak’s Gynecology─Menopause. 12th ed.中將停經定義為：女性之月經週期至少停止一年以上，其中亦與卵巢中的濾泡功能降低而減少雌激素分泌量減少有關。本研究將停經婦女指停經達一年以上的婦女。. 貳、停經婦女之生理變化雌激素在身體內影響很多目標組織的生理功能，像是心臟血管系統、生殖系統、中樞神經系統、骨骼等的生長、分化與其自身功能 (Zhu & Conney, 1998)。雌激素分泌下降會造成停經婦女生理及心理方面的不適，Ho 等人將停經症候群分成五大類：第一，心理方面：集中困難 (difficulty in concentration)、神經緊張 (nervous tension)、心跳加快 (rapid heartbeat)、不易入眠、憂鬱；第二，肌肉骨骼與腸胃道：腹瀉和/且便祕、關節僵硬 (joint stiffness)、背痛、胃不適；第三，非特定身體疾病：體力下降、頭暈 (dizzy spells)、頭痛；第四，呼吸：持續咳嗽、喉嚨痛、呼吸短促 (shortness of breath)；第五，神經血管；冒冷汗 (cold sweats)、失去食慾、熱潮紅 (hot flushes)等 (Ho et al., 1999)。此外，雌激素的分泌下降也 12.

(28) 第二章文獻探討. 會增加罹患冠狀心臟疾病 (coronary heart disease) (Lobo, 1989)、高血壓 (Maas & Franke, 2009)、骨質疏鬆症 (Hernandez, et al., 2003)等。性激素為固醇類激素 (steroid hormones)相對不溶於水，因此在血液內運輸透過與性激素結合球蛋白 (sex hormone-binding globulin, SHBG)與白蛋白 (albumin) 結合，隨後運送到標的細胞；但只有游離形式或是未結合形式的性激素被視為具有生理活性 (Tham, et al., 1998)。SHBG 為肝細胞合成的一種醣蛋白 (glycoprotein)，主要調節游離及結合形式的性激素之平衡，進而影響其活性。大豆異黃酮可以刺激 HepG2 cell 合成 SHBG (Loukovaara et al., 1995; Mousavi & Adlercreutz, 1993)。給予停經婦女荷爾蒙補充劑治療 (hormone replacement therapy, HRT)，若能同時增加血液中 SHBG 濃度，則可以緩解激素對乳房組織的刺激 (Nachtigall, 1999)。Geola 等人認為 SHBG 可作為評估 estrogenic effect 的一個指標，雌激素增加時，SHBG 亦會增加 (Geola et al., 1980)。. 参、停經婦女與腹部肥胖及代謝症候群之關係婦女在停經後的體重、腹部脂肪量及其分布、腰圍的增加，會造成代謝症候群的發生率與心臟病危險因子的上升 (Lobo, 2008; Sowers et al., 2007)。雌激素會促進下半身脂肪 (gluteo-femoral fat)的累積，但停經後因雌激素的流失而造成中央型脂肪的堆積 (Krotkiewski et al., 1983; Poehlman et al., 1995)。美國一項代謝症候群盛行率的調查，停經婦女有 40~50 %同時有代謝症候群的症狀 (Park et al., 2003)。女性在停經後之血脂狀態與停經前女性相比，有較高的總膽固醇 (TC)、低密度膽固醇 (LDL-C)、三酸甘油酯 (TG)及 lipoprotein (a)，與較低的高密度膽固醇 (HDL-C)等現象 (Li et al., 1996; Stevenson et al., 1993)。上述血脂異常狀態與腹部脂肪堆積造成胰島素阻抗、游離脂肪酸濃度增加與 adiponectin 濃度下降有關 (Carr, 2003)。有許多研究發現停經婦女的空腹血糖 (fasting glucose)及空腹胰 13.

(29) 第二章文獻探討. 島素 (fasting insulin)濃度較停經前女性來的高 (Dallongeville et al., 1995; Razay et al., 1992)。但至目前為止，停經與胰島素阻抗之間的關係尚不清楚，需更進一步的研究來釐清。此外，婦女停經後會造成血壓上升，可能因體內雌激素之下降進而透過以下機制來調控血壓，像是雄激素 (androgen)濃度相對上升、活化腎素-血管收縮素系統 (renin-angiotensin system)與較高之腎素、血漿內皮素 (endothelin)濃度增加、高鹽敏感性、胰島素阻抗增加、與體重上升等 (Maas & Franke, 2009)。婦女停經後，發現到體內的發炎因子，像 C-反應蛋白 (C-reactive protein, CRP)、IL-6、纖維酶原活化子抑制劑 (plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)及組織纖維酶原活化劑 (tissue plasminogen activator, tPA)的濃度增加 (Lindoff et al., 1993; Pfeilschifter et al., 2002)，這些因子可促進發炎反應，進而增加心血管疾病與代謝症候群之發生。. 肆、腹部肥胖造成之可能病理機轉腹部肥胖 (abdominal obesity)，尤指腹部內或內臟脂肪組織增加 (Despres et al., 2008)。有許多文獻指出肥胖與發炎反應有關，因而造成胰島素阻抗 (insulin resistance)的情形增加，胰島素阻抗會造成血液游離脂肪酸 (free fatty acids, FFAs) 濃度上升、脂質異常累積、阻礙骨骼肌葡萄萄攝入且會增加肝臟葡萄糖製造(de Luca & Olefsky, 2008; Smith et al., 2007; H. Xu et al., 2003; Zeyda & Stulnig, 2009) (圖2-3)。肥胖可視為一個慢性、低度發炎的狀態，起始可能是由於內質網壓力 (endoplasmic reticulum stress, ER stress)所致。內臟脂肪組織增加，會造成胰島素阻抗，使肝臟中游離脂肪酸濃度上升損害肝臟正常代謝功能，此外，脂肪組織亦會分泌許多促發炎因子，像介白素-6 (interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)，促使胰島素阻抗增加 (Bastard et al., 2006; Despres, et al., 2008)。 14.

(30) 第二章文獻探討. 圖 2-3. 肥胖與胰島素阻抗 (de Luca & Olefsky, 2008). 此外，這樣低度發炎狀態會改變細胞激素之生成及發炎反應訊息傳遞路徑之活化。細胞激素會活化胰島素受器 (insulin receptor substrate, IRS)的絲胺酸磷酸化 (serine phosphorylation)，因此阻礙胰島素正常訊息傳遞路徑，造成胰島素阻抗情形 (Zeyda & Stulnig, 2009)。Uysal 等人使用剔除 TNF-α 的肥胖小鼠，發現能保護由肥胖所引起的胰島素阻抗情形 (Uysal et al., 1997)。. 15.

(31) 第二章文獻探討. 第三節奈米科技 (Nanotechnology) 壹、奈米之定義奈米 (nanometer, nm)是一長度單位，為十億分之一公尺 (10-9 m)。現今廣泛接受的定義：物質或材料的三維尺寸中有任一者介於100 nm以下，該物質或材料屬於奈米級；介於100 nm~1000 nm間則為次微米級。與實際物質相比來說：病毒的大小約為60 ~ 250 nm、紅血球約為2000 nm、金屬原子間距約為0.2 ~ 0.3 nm，所以在1 nm的長度內可排列4 ~ 5顆金屬原子或10顆氫原子 (林景正、賴宏仁， 1999)。自然界中存在著許多奈米現象，像是生物體內細胞中的DNA、蛋白質、酵素等均在奈米尺度以內；而自然界中如蓮花出淤泥而不染，是因蓮花葉片表面上的絨毛與絨毛之間只有奈米級的距離，使其具有疏水、不吸水的表面，而有「蓮花效應 (lotus effect)」 (Neinhuis & Barthlott, 1997)。不同事物的尺度大小以圖2-4 來做比較。. 圖 2-4. 不同事物的尺度大小 (美國國家奈米計畫網站 http://www.nano.gov/nanotech-101/what/nano-size) 16.

(32) 第二章文獻探討. 貳、奈米科技奈米科學是對 1 nm 至 100 nm 之間的材料進行物理、化學性質和功能研究的科學。奈米技術即是對奈米級材料結構的製造、操縱和量測等技術和儀器的研發應用，涵蓋領域相當廣泛，包括機械、電機、材料、光學、量測、生化、醫藥及環境資源等 (陳輝煌等人，2011)。. (一) 奈米材料製造方法 Hu & Shaw (1999)將奈米材料的製造方式主要分為兩大類：一為「由下而上 (bottom-up)」的次微米組合法，如化學溶膠凝膠法、氣相沉積法，可將粒子控制在數個奈米，粒徑分佈較為均一，但成本高且濃度不易提高，也不適用於天然聚合物之生成。二為「由上而下 (top-down)」的極小型化法，如珠磨法、物理粉碎法等，是採用物理的方法透過外加機械力量，將粉體粒子由大變小，在多種物理降解法中，以介質研磨最為簡單直接，但是粒徑分佈較為寬廣。此介質研磨技術可分為乾式及濕式兩種，乾式研磨在製造奈米/次微米顆粒時有其安全上的顧慮，因此濕式研磨逐漸取代乾式研磨 (E. Hu & Shaw, 1999)。奈米介質研磨乃是利用機械能量、研磨介質 (研磨珠)與材料懸浮液之間的碰撞作用產生之漿料流體-流體與流體-研磨珠間的剪切力，將大粒子破碎與分散，常用於塗料或奈米粉體製備。使用之研磨球珠一般多小於1 mm，此種濕磨方式物料為漿狀，可避免高溫的產生，有利於對熱敏感之有機材料 (包括食品材料、中草藥等)的處理 (劉盈吟，2007)。. (二) 奈米食品將奈米技術應用在食品的栽種、生產、加工以及包裝製備過程而成的食品，即稱為奈米食品。此應用於將具保健成分的原料製成奈米粒子，透過增加其表面 17.

(33) 第二章文獻探討. 積以提高吸收率，來強化有效成分的效用；另一方面，把有效成分分別包埋在奈米粒子中，其包埋與釋放效果均優於傳統方法，可添加入食品中成為具保健效用的複方食品 (陳輝煌等人，2001)，另外，以奈米技術製備之微膠囊載體，可裝填不易溶於水溶劑的營養活性物質，例如：輔酶Q10、異黃酮、β-胡蘿蔔素、植物固醇、ω-3脂肪酸、維生素A、D、E、K等，其能提升食品的清澈感與透光性，並因應加工或是生理之需求來調整營養活性物質的溶解性質，以達到提高吸收率與延長保存期限的目的 (陳仲仁，2010)。 Moraru等人提到奈米科技於食品上之應用大致可分為：(1)材料：奈米材料、奈米複合材料、奈米乳液、奈米粒子；(2)加工：奈米反應工程、奈米生物技術、分子合成；(3)產品：成分遞送、配方、包裝；(4)食品衛生與安全 (Moraru et al., 2003)。近年來，使用奈米技術應用於食品方面是一大研究重點。類胡蘿蔔素 (carotenoids)具有許多有益健康的功能，一般以反式結構存在於食物中，但當經過加工處理會變成順式，此更利於類胡蘿蔔素之生理功能，像是提高茄紅素 (lycopene)的生物利用率與活性 (Schieber & Carle, 2005)。研究發現植醇 (phytosterols)能透過抑制人體膽固醇之吸收，進而降低總膽固醇與LDL-C，其易受到氧化而破壞，透過膠囊化可以增加其氧化安定性，提高人體利用率 (McClements et al., 2007; Ostlund, 2004)。其他像是將薑黃素 (curcumin)、兒茶素 (catechins)、紅麴 (red mold rice)等活性成分運用奈米技術製成奈米粒 (nanoparticle)或奈米膠囊 (nanocapsule)，以增進這些成分的人體吸收性與安定性 (B. Hu et al., 2008; Yen et al., 2010; C. C. Yu et al., 2008)。而奈米物質主要以皮膚接觸、肺部吸入與腸胃道攝食三大途徑進入體內 (Hillyer & Albrecht, 2001; Warheit et al., 2004)。. (三) 奈米科技之產品以色列NutraLease公司開發出可以包覆lycopene、β-carotenes與phytosterols的 18.

(34) 第二章文獻探討. 奈米尺寸結構技術 (Nano-sized Self-assembled Liqid Stuctures, NSSL)，可以增加被包覆營養素的生物利用性。澳洲George Weston Foods公司生產的「TIP TOP® bread」產品，將鮪魚油以奈米膠囊包覆，當膠囊到達pH值低的胃部時才會釋放出富含omege-3脂肪酸的鮪魚油。有研究討論使用這樣的技術，發現運用奈米包覆技術的脂溶性抗氧化劑更有益處 (Mozafari et al., 2006)。目前台灣市面上已有相關奈米產品，例如統一推出含有奈米鈣與奈米鐵的營養強化牛奶、味全有含奈米鐵之健康益生女性專用奶粉、九鼎生技研發之奈米中草藥等。由於奈米食品的材料粒子小，其吸收率應較高，對嬰兒、老人或消化系統不良者在攝取必須的營養物質上有所助益，且可應用於一般食品或中草藥，使藥效更容易發揮 (陳輝煌等人，2011)。此外，保健食品是目前以及未來的市場趨勢，但有許多具有功用的成分萃取不易且溶解性較低，抑或是不利於人體吸收，如能將食物直接奈米化，可望能增加其吸收與利用，不僅能直接獲取完整的活性成分，也能減少食物的廢棄量，讓製造商與消費者皆能受惠。. 19.

(35) 第二章文獻探討. 第四節非酒精性脂肪肝病 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 壹、非酒精性脂肪肝病之定義與病理機轉非酒精性脂肪肝病 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)之特徵為三酸甘油酯 (TG)在肝臟細胞堆積；診斷為堆積情形≧5 %的肝臟重量且個體攝取酒精含量一天未超過 20 公克。非酒精性脂肪肝在病理組織上的範圍包括了單純的脂肪肝 (simple hepatic steatosis)、非酒精性脂肪肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis , NASH)、纖維化 (fibrosis)及肝硬化 (cirrhosis) (Rector, et al., 2008)。非酒精性脂肪肝在美國的盛行率有 30 %，而在義大利為 25 %，台灣則為 11.5 % (Bellentani & Marino, 2009; C. H. Chen et al., 2006)。非酒精性脂肪肝病的病因有許多，如肥胖、代謝症候群、高血脂症等 (Brunt & Tiniakos, 2002)。Day 與 James 針對非酒精性脂肪肝之病程提出二次衝擊理論 (two-hit theory)，第一次衝擊 (first hit)與胰島素阻抗有關，造成游離脂肪酸過多浸潤在肝臟細胞，使肝臟開始出現脂肪堆積，此第一次衝擊造成肝臟易受到毒物與外在氧化壓力 (oxidative stress)等的影響；第二次衝擊 (second hit)起因於氧化壓力，造成肝細胞膜上脂質過氧化 (peroxidation)、並藉由釋放促發炎細胞激素 (pro-inflammatory cytokines)，使細胞發炎、纖維化甚至死亡 (C. P. Day & James, 1998)。肝臟脂肪的堆積可透過，飲食攝取過多熱量或油脂、肥胖情形 (尤其是腹部內脂肪過多)，進而造成胰島素阻抗及 adiponectin 濃度下降。非酒精性脂肪肝與胰島素阻抗之間的關係，可能是透過胰島素抑制脂肪分解 (lipolysis)之調控進而使過多游離脂肪酸進入肝臟，而高胰島素血症 (hyperinsulinemia)也會透過誘導固醇調節結合蛋白-1c (Sterol regulatory binding protein-1c, SREBP-1c)表現重新刺激 20.

(36) 第二章文獻探討. 脂肪合成 (de novo lipogenesis) (Postic & Girard, 2008; Utzschneider & Kahn, 2006). 貳、大豆異黃酮對非酒精性脂肪肝之影響 HepG2細胞常作為脂蛋白 (lipoprotein)、膽固醇及膽酸 (bile acids)代謝使用之細胞模式 (Javitt, 1990)。Owen等人使用HepG2細胞，研究雌激素與植物雌激素對低密度脂蛋白受器 (LDL receptor)之影響，發現isoflavonoids、daidzein能提高 LDL receptor的活性 (Owen, et al., 2004)。SREBP-1為一轉錄因子，能調控脂質合成的基因，像是SCD1 (stearoyl coenzyme-A desaturase1 )、GPAT (glycerol-phosphate acyltransferase)、ACC-1 (acetyl-CoA carboxylase-1)及ACC2 等，有研究發現大豆異黃酮可以向下調節HepG2細胞之SREBP-1及其相關基因的表現 (Mullen et al., 2004; Shin et al., 2007)。過氧化體增殖活化受器α (peroxisome proliferators-activated receptors α, PPARα)主要表現於脂肪酸代謝高的組織器官，包括肝臟，其他亦表現於腎臟、心臟、骨骼肌及棕色脂肪組織等，具有調節參與FFAs氧化及傳送的蛋白質表現之功能，進而調控脂質代謝 (Desvergne & Wahli, 1999)。Kim等人發現在HepG2 細胞，genistein可以做為PPARα的ligand進而活化促進PPARα對脂質代謝基因的表現 (Kim et al., 2004)。. 21.

(37) 第二章文獻探討. 第五節腎臟損傷 (Renal injury) 壹、腎臟脂毒性 (Renal lipotoxicity)與發炎之影響脂毒性 (lipotoxicity)是指三酸甘油酯以及非酯化脂肪酸 (nonesterified fatty acids, NEFA)堆積在實質細胞 (parenchymal cells)內，像是骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞等，造成細胞慢性功能障礙及損傷 (Weinberg, 2006)。脂毒性與肥胖及肥胖相關之代謝症候群有關係，被認為造成器官功能障礙，像是腎臟疾病；而腎臟脂毒性會造成腎臟間質細胞 (mesangial cell)與上皮細胞 (epithelial cell)損傷進而促進腎臟疾病之進程 (Wahba & Mak, 2007)。此外，研究發現當在發炎刺激情況下，會加劇脂質堆積情形，特別是氧化型LDL會刺激腎間質細胞分泌過多的細胞外基質 (extracellular matrix)、單核球趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)造成腎絲球硬化 (glomerulosclerosis) (Abrass, 2004; E. F. Grone et al., 1992)。有研究發現，餵食C57BL/6J小鼠高脂飲食，發現比餵食低脂飲食鼠有顯著較高的腎臟SREBP-1及SREBP-2表現，此較高表現也造成腎臟堆積較多的TG與膽固醇 (Jiang et al., 2005)。血脂異常被視為會促進腎臟及心血管疾病之進程因素，也是促進動脈粥狀硬化之風險因子。發炎性細胞激素可影響脂質的攝入，因此發炎反應與發炎調節介質會影響到間質細胞的膽固醇平衡並促使轉變成泡沫細胞 (Ruan et al., 2003)。肥胖者的血液循環中有較高的發炎調節介質，是對腎臟功能造成負面影響的主因 (Kamei et al., 2006)。此外，肥胖者的氧化型LDL也上升，會刺激單核球黏附在腎絲球內皮細胞 (glomerular endothelial cells)上，造成腎絲球損傷增加 (Kamanna et al., 1999)。巨噬細胞浸潤與促發炎細胞激素，像是IL-6、IL-1及TNF-α 的釋放會造成血管內皮功能障礙與腎臟損傷 (圖2-5)。IL-6會直接對內皮細胞及血管平滑肌細胞造成影響，刺激黏附分子與血管收縮素II第一型接受器 22.

(38) 第二章文獻探討. (angiotensin II type 1 receptors)的表現，進而造成發炎、氧化壓力與腎臟血管損傷 (Wassmann et al., 2004)。有研究發現第二型糖尿病患，其TNF-α濃度增加，並且較高的TNF-α濃度與腎臟功能降低及胰島素阻抗之間有強相關性(Dominguez et al., 2005)。. (Knight & Imig, 2007) 圖 2-5. 肥胖與胰島素阻抗在腎臟血管及間質造成的發炎途徑. 轉錄因子 (nuclear factor kappa B, NFκB)濃度與腎臟損傷有關，NFκB轉錄被活化是肥胖誘導的胰島素阻抗與腎臟損傷的特徵；NFκB也會增加腎臟促發炎細胞激素與黏附分子的表現 (Klahr & Morrissey, 2003; Lee et al., 2004)。另外，NFκB 會刺激促發炎細胞激素的轉錄，像是MCP-1，抑制NFκB可以減輕發炎性腎臟損傷 (Wilson et al., 2005)。MCP-1可由脂肪細胞或是不同型式的腎臟細胞，包括腎臟間質細胞、腎小管上皮細胞 (tubular epithelial cells)製造，會造成發炎刺激，像是NFκB、IL-1、IL-4或TNF-α (Y. Wang et al., 1999)。MCP-1會聚集巨噬細胞至發 23.

(39) 第二章文獻探討. 炎的位置，此外也會刺激促發炎細胞激素的製造，例如IL-6、細胞間黏附分子-1 (intracellular adhesion molecule, ICAM-1)與蛋白激酶C (protein kinase C, PKC) (Viedt et al., 2002)。近來許多研究指出肥胖、MCP-1和其相關發炎細胞激素在胰島素阻抗與腎臟損傷扮演重要角色。有腎臟疾病的動物和人體發現其尿液MCP-1 排放會增加 (Banba et al., 2000)。. 貳、大豆異黃酮對腎臟損傷之影響大豆異黃酮，尤其是genistein具有潛在抑制蛋白質酪胺酸酶 (protein tyrosine kinases, PTKs)的功用，而PTKs與一些細胞生長因子有關，包括表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)、血小板衍生生長因子 (platelet-derived growth factor, PDGF)、纖維母細胞生長因子 (fibroblast growth factor, FGF)與單核球吞噬細胞生長因子 (mononuclear phagocyte growth factor)等 (Akiyama et al., 1987; Velasquez & Bhathena, 2001)。Yokoo與Kitamura研究使用間質細胞，並用不同濃度之genistein (1、10、25與50 μmol/L)，發現有dose-dependent下降基質金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)表現與抑制NFκB活化 (Yokoo & Kitamura, 1996)。此外，有些研究發現genistein能抑制間質細胞的增生、抑制促纖維化生長因子 (transforming growth factor-β, TGF-β)與PDGF的表現 (Hirakata et al., 1997; Kato et al., 1999)。有研究使用Wistar大鼠，投予equol與利尿劑藥物furosemide，發現equol效果雖不如furosemide佳，但具有潛在增加利尿、腎絲球過濾率 (glomerular filtration rate, GFR)、提升尿中排鈉與血管緩和劑的功效 (Gimenez et al., 1997)。Choi與 Song的研究比較餵食高脂含0.1 % genistein的卵巢切除大鼠與僅餵食高脂的卵巢切除大鼠，發現前者腎臟中的三酸甘油酯與膽固醇濃度、血清胰島素濃度以及胰島素阻抗指數都較後者低 (Joo Sun Choi & Jihyun Song, 2009)。. 24.

(40) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響第一節前言女性停經後，由於雌激素分泌下降，會引起一系列生理及心理的不適，像熱潮紅、心悸、失眠等，且罹患冠狀心臟疾病、高血壓、骨質疏鬆症的機率升高。此外，雌激素下降會讓身體脂肪含量及其分佈，由下半身移到腹部引起腹部肥胖，而腹部肥胖是一系列代謝危險因子的主因 (Carr, 2003)。婦女在停經後的體重、腹部脂肪量及其分布、腰圍的增加，會造成代謝症候群的發生率與心臟病危險因子的上升 (Lobo, 2008)。豆奶為傳統大豆加工製品，含有豐富蛋白質及多種必需胺基酸，且異黃酮含量也高，具有預防心血管疾病、癌症、骨質疏鬆症、改善停經症候群、具抗氧化活性等生理功效。而大豆異黃酮與女性荷爾蒙雌二醇 (17β-estradiol)之構造與作用相似，會與雌激素受器結合，因此具有雌激素活性 (Tham, et al., 1998)。故本章研究目的為提供停經婦女富含大豆蛋白與異黃酮之傳統豆漿及介質研磨豆漿，介質研磨豆漿為使用 5 %黃豆就已達到口感濃稠之程度，而作為對照用之傳統豆漿為配合介質研磨豆漿之蛋白質濃度，使用了 5.6 %的黃豆。探究兩種豆漿是否能對停經後引起之代謝症候群危險因子產生影響，觀察腰圍、血脂、血糖、發炎因子，以及性激素結合球蛋白的變化等。另外使用高效能液相層析儀 (high-performance liquid chromatography, HPLC)分析受試者尿中異黃酮 (daidzein、equol 與 genistein)之含量，比較兩種豆漿對其排出量之影響。. 25.

(41) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 第二節研究材料與方法壹、研究對象於台師大校園附近招募年齡在 50-70 歲健康停經婦女共十人。受試者須符合腰圍大於 80 cm、非素食者、停經一年以上、近一年內沒有使用任何荷爾蒙治療、無服用植物性雌激素有關的健康食品。無慢性疾病或需長期服藥的疾病，例如：糖尿病、心臟病、肝腎疾病，而其他需長期服藥者 (高血壓藥物)除外。首先招開說明會，願意參加實驗之受試者，先進行問卷調查及訪談確定符合資格始可參加。問卷調查內容包括個人資料、飲食狀況與健康狀態等項目。但結果僅募得八位符合腰圍大於 80 cm，其他二位之腰圍接近 80 cm。實驗進行前，對受試者詳細說明實驗目的、實驗流程，並講解實驗安全性及無副作用之疑慮，最後簽立受試者同意書。. 貳、研究設計本研究採用交叉試驗 (cross-over) (圖 3-1)、單盲比較設計，受試者在實驗期間並沒有被告知正在飲用哪種研究食材。在實驗開始前兩週，請受試者們每天維持正常且原來的飲食習慣，但是需避免食用黃豆及黃豆製品之食物，作為 run-in period。十位受試者中，每人每天飲用兩次 (500 ml/day)豆漿，五人飲用介質研磨豆漿四週，休息三週的洗滌期 (wash-out period)後，改飲用傳統豆漿四週，另外五人次序相反，共歷時十一週。(圖 3-2) 實驗期間指導受試者避免食用黃豆及黃豆相關製品，同時減少食用肉類一份，並且盡量維持一般規律的飲食習慣、生理活動與日常生活作息。. 26.

(42) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 介質研磨豆漿（500 ml/day）五位. run-in. 傳統豆漿（500 ml/day）五位. wash-out. 傳統豆漿（500 ml/day）五位. 介質研磨豆漿（500 ml/day）五位. 先喝介質研磨豆漿先喝傳統豆漿. 圖 3-1. Cross-over 研究設計. 27.

(43) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 於台師大校園附近招募停經婦女，先進行問卷調查及訪談，評估其健康狀況、飲食與用藥情形，確定符合資格始可參加。共 10 位受試者. 進行 2 週規律的飲食（run-in period）抽血、收集尿液飲用介質研磨豆漿（500 ml/day）4 週. 飲用傳統豆漿（500 ml/day）4 週抽血、收集尿液. 3 週的洗滌期（wash-out period）抽血、收集尿液飲用傳統豆漿（500 ml/day）4 週. 飲用介質研磨豆漿（500 ml/day）4 週. 抽血、收集尿液樣本處理與分析. 體位測量： BMI、WHR. 血壓. 血液生化值：. 血脂及發炎因子：. 尿液異黃酮. 血糖、insulin、GOT、. TG、TC、NEFA、. (HPLC):Daidzein. GPT、Creatinine、SHBG. HDL、LDL、CRP. 、Equol、Genistein. 資料整理與統計分析. 圖 3-2. 研究設計流程圖. 28.

(44) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 參、研究材料與藥品 (一) 研究材料 (1) 黃豆黃豆自加拿大進口，屬於非基因改造黃豆 (取自花蓮農改場)。. (2) 介質研磨豆漿與國立臺灣大學食品科技研究所葉安義老師合作。以 5 %比例取黃豆經隔夜泡水後，再加水使用奈米濕磨機 (圖 3-4、圖 3-5、圖 3-6)研磨 2 小時，其研磨出的顆粒直徑大小為 100 ~1000 nm。介質研磨豆漿之粒子較一般豆漿細小，且於製程中可大幅降低黃豆廢棄率，充分保留黃豆的營養成分。研磨出的生豆漿之後再經加熱滾 10 分鐘即可。(圖 3-3). (3) 傳統豆漿以 5.6 %比例取黃豆經隔夜泡水後，加水使用研磨果菜機研磨，過濾掉豆渣而得生豆漿，再加熱滾 10 分鐘即可。(圖 3-3). (4) 豆漿成分分析以上兩種豆漿之黃豆比例，委請國立臺灣大學農化系賴喜美老師研究室分析蛋白質之含量，依照分析數據進行調整，使兩種豆漿蛋白質含量相似。此外，兩種豆漿之異黃酮含量以 HPLC 進行分析。(表 3-1). (5) 食用方式試驗期間之週一至週六早晨，請受試者前來並立即飲用一杯 250 ml 豆漿，並再給予一杯 250 ml 豆漿於傍晚時飲用 (500 ml/day)。週六來時，除了當日的量，會再多給予二杯各 250 ml 豆漿請受試者分別於星期日早晨及傍晚飲用完畢。 29.

(45) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 表 3-1. 介質研磨豆漿及傳統豆漿之蛋白質與異黃酮含量 Table 3-1. The contents of protein and isoflavones in tranditional soymilk and media-milled soymilk. Tranditional soymilk. Media-milled soymilk. 2.1. 2.1. Daidzein (mg/100 ml). 1.54. 1.75. Genistein (mg/100 ml). 2.79. 3.98. Total isoflavone (mg/100 ml). 4.33. 5.73. Protein (g/100 ml) Soy isoflavones:. 30.

(46) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 介質研磨豆漿(5 %). 傳統豆漿(5.6 %). 6 公升的豆漿，需 300 克的黃豆. 5 公升的豆漿，需 280 克的黃豆. 以 1500 ml 的水浸泡隔夜. 以 2500 ml 的水浸泡隔夜. 第二天. 第二天準備剩下之 2500 ml 的水。加入黃豆同時加水投入研磨果菜機. 再添加 1000 ml 的水，用果汁攪拌機打黃豆. 組裝奈米濕磨機：蠕動幫浦：150 rpm 主軸馬達：500 rpm. 結束後清理剩餘豆渣. 打好的豆漿(料)進濕磨機步驟： 1.先倒入 3000 ml 的水進攪拌缸 2.開始循環，注意看出料口能不能流出來 3.流出水後開始進料，隨時注意水流大小 4.進料完的桶子，用剩餘的 500 ml 水沖洗一下再倒入缸裡 5.需在 40 分鐘內進料完成 6.進料完成開始豆漿循環 1.5 小時即可. 烹煮豆漿步驟： 1. 分兩次煮 2. 3. 4. 5.. 用大火(中火)煮，並同時攪拌預防沉底等泡泡冒起來，轉小火開小火煮 10~15 分鐘，並同時攪拌煮好用鍋蓋防止蒸發流失，放涼後置於冷藏庫儲存圖 3-3. 介質研磨及傳統豆漿之製程 31.

(47) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 圖 3-4. 奈米濕磨機. 圖 3-5. 進出料攪拌缸. 圖 3-6. 操作頁面 32.

(48) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. (二) 實驗儀器 (1) 奈米濕磨機：工研院製造。 (2) 奈米研磨珠：德國 Netzsch 廠牌，型號 MiniPur，0.8 mm，。 (3) 研磨果菜機：貴夫人鳳梨牌。 (4) 身體組成分析儀 (Inbody 3.0) (5) 高效能液相層析儀 (high-performance liquid chromatography, HPLC)： ECOM SPOL. S.R.O. 偵測器：LCD 2084 UV-VIS Detector (6) 離心機：Beckman. (三) 分析用試藥 (1) (R, S)-Equol：美國 LC laboratories (2) Daidzein、Genistein；美國 Cayman chemical (3) β-glucosidase、sodium acetate：美國 Sigma. 肆、樣本收集與處理 (一) 血液收集每次收集血液及尿液樣本之前一天早上領取豆漿時告知隔日抽血與注意事項。血液樣本為禁食十小時以上之空腹血，受試者在前一天晚上 10 點過後至隔天早上抽血前需要禁食，除開水以外禁止食用任何食物或飲料。由專業醫療人員進行抽血，抽取 20 ~25 ml 之上臂靜脈血液，分別收集一管不含抗凝血劑之真空管 (紅頭管)，一管含有 EDTA (Ethylenediaminetetra-acetic acid)的真空管 (紫頭管)，及一管含有 NaF (Sodium fluoride)的真空管 (灰頭管)，每管收集約 5 ~10 ml 的血液。收集到的血液樣本靜置於室溫凝血十分鐘後以 3000 rpm、15 分鐘、4℃的低速條件下分離血清、血漿及血球，分裝前皆保存於碎冰 33.

(49) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 中。離心完後取出上層血清或血漿分裝儲存在-80℃以待分析。. (二) 尿液收集尿液樣本為抽血當天早上第一次的尿液 (晨尿)，裝於事先準備好內含有 10 mg 硼酸粉末的 15 ml 離心管中，共收集一管，置於含冰塊之的夾鍊袋中以維持低溫，避免尿液中的物質變性而影響測量結果之準確性。受試者需在家中收集好後，於抽血當天時交出。收集到的尿液樣本同樣以 3000 rpm、15 分鐘、4℃的條件離心，使沉澱物分離於管內底層，取出澄清部分，分裝儲存於-80℃直到分析。. 伍、分析項目與方法 (一) 人體測量受試者於實驗開始前 (baseline)、四週後、七週後與十一週時於台師大保健中心測量身高、體重、血壓，並利用身高、體重計算身體質量指數 (body mass index, BMI)。此外，由同一位施測者幫忙測量受試者的腰圍及臀圍並記錄，以此計算腰臀比 (Waist-to-hip ratio, WHR)並於生理生化實驗室使用身體組成分析儀 (Inbody3.0)，Inbody3.0 應用生物電阻原理，測量體內所含的水份、蛋白質與脂肪的相對含量。. (二) 檢體分析委請邱內科醫學檢驗診所以血液自動分析儀分析各項血液生化值。於實驗室使用市售套組試劑 (Randox)分析非酯化脂肪酸 (non Eaterified Fatty Acids, NEFA)。. 34.

(50) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. (三) 豆漿異黃酮含量分析 (1) 豆漿前處理：參考 Shao 等人之豆漿前處理條件再做修正 (Shao et al., 2011)。取 3 ml 之豆漿，與 7 ml 60 % acetonitrile 均勻混合，以 3000 rpm，10 mins 離心吸掉上清液，剩下之 residue 再以 10 ml 60 % acetonitrile 混合以超音波震盪 30 mins，再添加 60 % acetonitrile 至 20 ml。經萃取後之豆漿取 100 μl 與 900 μl 1.3 M HCl 混合再放至超音波震盪 30 mins，經 80ºC 水浴加熱 2 小時，過濾後取 20 μl 打入 HPLC 分析。. (2) HPLC 分析條件：分離管柱：Phenomenex C18 (10μ) 300 × 3.9 mm 移動相為 A：B = 60 %：40 % 移動相 A：2 % acetic acid in water 移動相 B：acetonitrile 注射 20 μl 的樣品，流速 1.0 ml/min，從滯留時間和標準品來辨識 peak。紀錄波長 260 nm 吸光值。並計算 daidzein 與 genistein 在樣品中的含量。. (四) 尿液異黃酮含量分析 (1) 尿液前處理：參考 Maubach 等人之 HPLC 條件並再做調整與修正 (Maubach et al., 2003)。自-80ºC 冰箱取出已分裝為 1 ml 之尿液回溫，加入 110 μl 之 0.78 M 醋酸鈉 (sodium acetate, pH 4.9) 及 5 μl 之 β-glucosidase (From Helix pomatia： ≧100000U/ml)，放至 37ºC 培養箱 17 小時以水解醣基，之後加入 800 μl ethyl acetate 萃取，以 12000 rpm，10 mins 離心取上清液。將上清液以氮氣吹乾，再以 35.

(51) 第三章大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響. 0.05 % formic acid in water 200 μl 回溶，過濾後取 20 μl 打入 HPLC 分析。. (2) HPLC 分析條件：分離管柱：Phenomenex C18 (10μ) 300 × 3.9 mm 移動相為 A：B = 60 %：40 % 移動相 A：0.05 % formic acid in water 移動相 B：methanol – acetonitrile (v:v = 80:20) 注射 20 μl 的樣品，流速 1.0 ml/min，從滯留時間和標準品來辨識 peak。紀錄波長 230 nm 吸光值。並計算 daidzein、equol 與 genistein 在樣品中的含量。. (五) 數據分析使用 Peak-ABC Chromatography Data Handling System 分析處理數據。. (六) 統計分析以SPSS 15.0軟體分析數據。實驗數據以平均值±標準差 (mean±SD)表示。以 Wilcoxon signed rank test分析給予傳統豆漿與介質研磨豆漿的前測及後測間差異。並使用前後測差值 (差值＝後測－前測)分析兩組間差異。若p＜0.05，表示統計上具有顯著差異。. 36.