第三章 大豆異黃酮對停經婦女代謝症候群之影響
第二節 研究材料與方法
壹、研究對象
於台師大校園附近招募年齡在 50-70 歲健康停經婦女共十人。受試者須符合 腰圍大於 80 cm、非素食者、停經一年以上、近一年內沒有使用任何荷爾蒙治療、
無服用植物性雌激素有關的健康食品。無慢性疾病或需長期服藥的疾病，例如：
糖尿病、心臟病、肝腎疾病，而其他需長期服藥者 (高血壓藥物)除外。
首先招開說明會，願意參加實驗之受試者，先進行問卷調查及訪談確定符合 資格始可參加。問卷調查內容包括個人資料、飲食狀況與健康狀態等項目。但結 果僅募得八位符合腰圍大於 80 cm，其他二位之腰圍接近 80 cm。
實驗進行前，對受試者詳細說明實驗目的、實驗流程，並講解實驗安全性及 無副作用之疑慮，最後簽立受試者同意書。
貳、研究設計
本研究採用交叉試驗 (cross-over) (圖 3-1)、單盲比較設計，受試者在實驗期 間並沒有被告知正在飲用哪種研究食材。在實驗開始前兩週，請受試者們每天維 持正常且原來的飲食習慣，但是需避免食用黃豆及黃豆製品之食物，作為 run-in period。
十位受試者中，每人每天飲用兩次 (500 ml/day)豆漿，五人飲用介質研磨豆 漿四週，休息三週的洗滌期 (wash-out period)後，改飲用傳統豆漿四週，另外五 人次序相反，共歷時十一週。(圖 3-2)
實驗期間指導受試者避免食用黃豆及黃豆相關製品，同時減少食用肉類一 份，並且盡量維持一般規律的飲食習慣、生理活動與日常生活作息。
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圖 3-1. Cross-over 研究設計 介質研磨豆漿（500 ml/day）
五位
傳統豆漿（500 ml/day）
五位
介質研磨豆漿（500 ml/day）
五位 傳統豆漿（500 ml/day）
五位
先喝介質研磨豆漿 先喝傳統豆漿
run-in wash-out
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圖 3-2. 研究設計流程圖
抽血、收集尿液
抽血、收集尿液
抽血、收集尿液
抽血、收集尿液 3 週的洗滌期（wash-out period）
飲用傳統豆漿（500 ml/day）4 週 飲用介質研磨豆漿（500 ml/day）4 週
樣本處理與分析
於台師大校園附近招募停經婦女，先進行問卷調查及訪談，評 估其健康狀況、飲食與用藥情形，確定符合資格始可參加。
共 10 位受試者
進行 2 週規律的飲食（run-in period）
飲用介質研磨豆漿（500 ml/day）4 週 飲用傳統豆漿（500 ml/day）4 週
體位測量：
BMI、WHR
尿液異黃酮 (HPLC):Daidzein
、Equol、Genistein 血液生化值：
血糖、insulin、GOT、
GPT、Creatinine、SHBG
血脂及發炎因子：
TG、TC、NEFA、
HDL、LDL、CRP 血壓
資料整理與統計分析
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參、研究材料與藥品
(一) 研究材料 (1) 黃豆
黃豆自加拿大進口，屬於非基因改造黃豆 (取自花蓮農改場)。
(2) 介質研磨豆漿
與國立臺灣大學食品科技研究所葉安義老師合作。以 5 %比例取黃豆經隔夜 泡水後，再加水使用奈米濕磨機 (圖 3-4、圖 3-5、圖 3-6)研磨 2 小時，其研磨出 的顆粒直徑大小為 100 ~1000 nm。介質研磨豆漿之粒子較一般豆漿細小，且於製 程中可大幅降低黃豆廢棄率，充分保留黃豆的營養成分。研磨出的生豆漿之後再 經加熱滾 10 分鐘即可。(圖 3-3)
(3) 傳統豆漿
以 5.6 %比例取黃豆經隔夜泡水後，加水使用研磨果菜機研磨，過濾掉豆渣 而得生豆漿，再加熱滾 10 分鐘即可。(圖 3-3)
(4) 豆漿成分分析
以上兩種豆漿之黃豆比例，委請國立臺灣大學農化系賴喜美老師研究室分析 蛋白質之含量，依照分析數據進行調整，使兩種豆漿蛋白質含量相似。此外，兩 種豆漿之異黃酮含量以 HPLC 進行分析。(表 3-1)
(5) 食用方式
試驗期間之週一至週六早晨，請受試者前來並立即飲用一杯 250 ml 豆漿，
並再給予一杯 250 ml 豆漿於傍晚時飲用 (500 ml/day)。週六來時，除了當日的 量，會再多給予二杯各 250 ml 豆漿請受試者分別於星期日早晨及傍晚飲用完畢。
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表 3-1. 介質研磨豆漿及傳統豆漿之蛋白質與異黃酮含量
Table 3-1. The contents of protein and isoflavones in tranditional soymilk and media-milled soymilk.
Tranditional soymilk Media-milled soymilk
Protein (g/100 ml) 2.1 2.1
Soy isoflavones:
Daidzein (mg/100 ml) 1.54 1.75
Genistein (mg/100 ml) 2.79 3.98 Total isoflavone (mg/100 ml) 4.33 5.73
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圖 3-4. 奈米濕磨機
圖 3-5. 進出料攪拌缸
圖 3-6. 操作頁面
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(二) 實驗儀器
(1) 奈米濕磨機：工研院製造。
(2) 奈米研磨珠：德國 Netzsch 廠牌，型號 MiniPur，0.8 mm，。
(3) 研磨果菜機：貴夫人鳳梨牌。
(4) 身體組成分析儀 (Inbody 3.0)
(5) 高效能液相層析儀 (high-performance liquid chromatography, HPLC)：
ECOM SPOL. S.R.O.
偵測器：LCD 2084 UV-VIS Detector (6) 離心機：Beckman
(三) 分析用試藥
(1) (R, S)-Equol：美國 LC laboratories
(2) Daidzein、Genistein；美國 Cayman chemical (3) β-glucosidase、sodium acetate：美國 Sigma
肆、樣本收集與處理
(一) 血液收集
每次收集血液及尿液樣本之前一天早上領取豆漿時告知隔日抽血與注意事 項。血液樣本為禁食十小時以上之空腹血，受試者在前一天晚上 10 點過後至隔 天早上抽血前需要禁食，除開水以外禁止食用任何食物或飲料。
由專業醫療人員進行抽血，抽取 20 ~25 ml 之上臂靜脈血液，分別收集一管 不含抗凝血劑之真空管 (紅頭管)，一管含有 EDTA (Ethylenediaminetetra-acetic acid)的真空管 (紫頭管)，及一管含有 NaF (Sodium fluoride)的真空管 (灰頭管)，
每管收集約 5 ~10 ml 的血液。收集到的血液樣本靜置於室溫凝血十分鐘後以 3000 rpm、15 分鐘、4℃的低速條件下分離血清、血漿及血球，分裝前皆保存於碎冰
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中。離心完後取出上層血清或血漿分裝儲存在-80℃以待分析。
(二) 尿液收集
尿液樣本為抽血當天早上第一次的尿液 (晨尿)，裝於事先準備好內含有 10 mg 硼酸粉末的 15 ml 離心管中，共收集一管，置於含冰塊之的夾鍊袋中以維 持低溫，避免尿液中的物質變性而影響測量結果之準確性。受試者需在家中收集 好後，於抽血當天時交出。收集到的尿液樣本同樣以 3000 rpm、15 分鐘、4℃的 條件離心，使沉澱物分離於管內底層，取出澄清部分，分裝儲存於-80℃直到分 析。
伍、分析項目與方法
(一) 人體測量
受試者於實驗開始前 (baseline)、四週後、七週後與十一週時於台師大保健 中心測量身高、體重、血壓，並利用身高、體重計算身體質量指數 (body mass index, BMI)。此外，由同一位施測者幫忙測量受試者的腰圍及臀圍並記錄，以此計算 腰臀比 (Waist-to-hip ratio, WHR)並於生理生化實驗室使用身體組成分析儀 (Inbody3.0)，Inbody3.0 應用生物電阻原理，測量體內所含的水份、蛋白質與脂肪 的相對含量。
(二) 檢體分析
委請邱內科醫學檢驗診所以血液自動分析儀分析各項血液生化值。於實驗室 使用市售套組試劑 (Randox)分析非酯化脂肪酸 (non Eaterified Fatty Acids, NEFA)。
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(三) 豆漿異黃酮含量分析
(1) 豆漿前處理：
參考 Shao 等人之豆漿前處理條件再做修正 (Shao et al., 2011)。
取 3 ml 之豆漿，與 7 ml 60 % acetonitrile 均勻混合，以 3000 rpm，10 mins 離心吸掉上清液，剩下之 residue 再以 10 ml 60 % acetonitrile 混合以超音波震盪 30 mins，再添加 60 % acetonitrile 至 20 ml。經萃取後之豆漿取 100 μl 與 900 μl 1.3 M HCl 混合再放至超音波震盪 30 mins，經 80ºC 水浴加熱 2 小時，過濾後取 20 μl 打入 HPLC 分析。
(2) HPLC 分析條件：
分離管柱：Phenomenex C18 (10μ) 300 × 3.9 mm 移動相為 A：B = 60 %：40 %
移動相 A：2 % acetic acid in water 移動相 B：acetonitrile
注射 20 μl 的樣品，流速 1.0 ml/min，從滯留時間和標準品來辨識 peak。紀 錄波長 260 nm 吸光值。並計算 daidzein 與 genistein 在樣品中的含量。
(四) 尿液異黃酮含量分析
(1) 尿液前處理：
參考 Maubach 等人之 HPLC 條件並再做調整與修正 (Maubach et al., 2003)。
自-80ºC 冰箱取出已分裝為 1 ml 之尿液回溫，加入 110 μl 之 0.78 M 醋酸鈉 (sodium acetate, pH 4.9) 及 5 μl 之 β-glucosidase (From Helix pomatia：
≧100000U/ml)，放至 37ºC 培養箱 17 小時以水解醣基，之後加入 800 μl ethyl acetate 萃取，以 12000 rpm，10 mins 離心取上清液。將上清液以氮氣吹乾，再以
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0.05 % formic acid in water 200 μl 回溶，過濾後取 20 μl 打入 HPLC 分析。
(2) HPLC 分析條件：
分離管柱：Phenomenex C18 (10μ) 300 × 3.9 mm 移動相為 A：B = 60 %：40 %
移動相 A：0.05 % formic acid in water
移動相 B：methanol – acetonitrile (v:v = 80:20)
注射 20 μl 的樣品，流速 1.0 ml/min，從滯留時間和標準品來辨識 peak。紀 錄波長 230 nm 吸光值。並計算 daidzein、equol 與 genistein 在樣品中的含量。
(五) 數據分析
使用 Peak-ABC Chromatography Data Handling System 分析處理數據。
(六) 統計分析
以SPSS 15.0軟體分析數據。實驗數據以平均值±標準差 (mean±SD)表示。以 Wilcoxon signed rank test分析給予傳統豆漿與介質研磨豆漿的前測及後測間差 異。並使用前後測差值 (差值＝後測－前測)分析兩組間差異。若p＜0.05，表示 統計上具有顯著差異。
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