第三章 材料與方法
第三節 實驗方法
一、脂質過氧化物質測定：丙二醛(Malondialdehyde; MDA) (一) 實驗原理
當生物體內的活性氧物質(ROS)攻擊細胞膜上的多元不飽和脂肪酸，經氧化 反應後形成醛類，而丙二醛(MDA)為其主要的脂質過氧化產物之一，MDA 含量 愈高，表示脂質過氧化程度愈高。
LPO-586 主要是利用 Reagent 1 和 MDA 在 45℃時會產生呈色反應，一分子 的 MDA 和兩分子的 R1 產生一個穩定的色基，在 586nm 有最大吸光値。反應式 如下：
(二) 儀器設備
1. 紫外線/可見光譜儀(Hitachi U-1800，益弘)。
2. 高速冷凍離心機。
(三) 樣本前處理
1. 配置 5％ BHT：0.25g BHT in 5mL methanol (100％)。
2. 將 5％BHT 與 EDTA plasma 以 1：100 的比例混合均勻。
(四) Kit 與試劑
1. Oxis Bioxytech LPO-586 (Oxis International, Inc, USA)：
R1：N-methy-2-phenylindole in acetonitrile。
R2：Methanesulfonic acid。
MDA Standard：1,1,3,3-Teramethoxypropane in Tris-HCl。
Diluent：Ferric Iron in Methanol。
2. 37％ HCl (Merk, Germany)。
3. BHT：Butylhydroxytoluene (Sigma, USA)。
4. 二次去離子水：電阻係數大於或等於 18mΩ之純水。
(五) 分析前處理
1. Diluted R1：取 R1 與 Diluent 以 3 比 1 之比例稀釋，保存於 4℃。
2. S2：取 20μlMDA Standard加二次水定量至 10mL。
3. 配製 MDA 標準品(Standard)：
Std conc. (μM) 0 0.5 1 2 3 4
S2 (μl) 0 25 50 100 150 200
二次水 (μl) 200 175 150 100 50 0
(六) 測定流程
1. 取 Sample (EDTA plasma 加 5％ BHT)及 Standard 各 200μl。 2. 分別加入 Diluted R1 650μl於 Sample 及 Standard 中，混勻。
3. 分別加入 37％ HCl 150μl於 Sample 及 Standard 中，混勻。
4. 水浴 45℃，60 分鐘。
5. 離心 1,5000 x g，10 分鐘。
6. 取上清液，在波長 586nm 下測吸光值，並先以 Blank(即 STD=0)將 吸光值歸零。
a df b A
586
(七) 濃度計算
【MDA】 = 單位：μM
A586：樣品在 586nm 的淨吸光値。
a：標準曲線的斜率。
b：標準曲線的截距。
df：稀釋倍數。
MDA
y = 0.1172x - 0.0021 R2= 0.9998
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0 1 2 3 4 5
MDA std conc.(μmol/L)
Abs(586nm)
圖 3-4- 1 MDA 標準品在波長 586 nm 下之檢量線圖
二、麩胱肽(Glutathione; GSH)測定 (一) 實驗原理
穀胱甘肽(GSH)是提供一個電子給 GPx (Glutathione Peroxidase)，將體內 H2O2 代謝為 H2O。
GSH-400 是利用 Reagent 1 經過專一取代反應產生硫醚(thioether)。反應式如 下：
接著 GSH 會和硫醚結合，經過 Reagent 2 催化後，形成呈色的 Thione，在 400nm 有最大吸光値。反應式如下：
(二) 儀器設備
1. 紫外線/可見光譜儀(Hitachi U-1800，益弘)。
2. 高速冷凍離心機。
(三) 樣本前處理
1. 以 0.9％生理食鹽水洗滌紅血球三次，存放於-80℃冰箱，直至分析。
2. 配置 5% mmole/L reduced glutathione(GSH)。
(四) Kit 與試劑
1. Oxis Bioxytech GSH-400 (Oxis International, Inc, USA)：
R1：Solution of chromogenic reagent in HCl。
R2：30％ NaOH。
Buffer：Potassium phosphate, containing diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA) and lubrol。
2. GSH：Reduced glutathione (Merk, Germany)。
3. MPA：Metaphosphoric acid (Showa, Tokyo)。
4. 二次去離子水：電阻係數大於或等於 18mΩ之純水。
(五) 分析前處理
1. 將紅血球(紫頭)與冰冷的 5％ MPA 以體積 1：4 的比例混合後，以 3000 rpm，4℃離心 10 分鐘。
2. 取其上清液置於 4℃冰箱備用(一小時內分析完)。
3. 配製 GSH 標準品(Standard)：
STD Conc.(μM) 0 20 40 60 80 100
Buffer (μl) 900 860 820 780 740 700
0.5M GSH(μl) 0 40 80 120 160 200
4. 至少做三個 Blank (即 STD=0)，吸光值平均之後為 A0。 (六) 測定流程
1. 取 Sample (上清液)200μl加入 Buffer700μl，混勻。
2. 分別加入 R150μl於 Sample 及 Standard 中，混勻。
3. 分別加入 R250μl於 Sample 及 Standard 中，混勻。
4. 於室溫下(25±3℃)下避光 10 分鐘。
5. 在波長 400nm 下測吸光值，並先以 Buffer 將吸光值歸零。
(七)
濃度計算【GSH】= 單位：μM
A400：樣品在 400nm 的吸光値。
A0：以 Buffer 為空白的吸光。
ε：標準曲線的斜率。
I：比色管的 optical path (cm)。
D：稀釋倍數。
GSH std conc. (μmol/L)
Abs(400nm)
三、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase; SOD)測定 (一) 實驗原理
SOD 可將體內超氧離子(O2˙－)代謝為 H2O2，而體內 SOD 有三種形式：
Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。
SOD-525 是利用 Reagent 2 去除樣本中硫醇類(mercaptans, RSH)的干擾，反應 式如下：
接著加入 Reagent 1，在鹼性環境下，SOD 活性可在 525nm 有最大吸光値。
反應式如下：
(二) 儀器設備
1. 分光光度計。
2. 高速冷凍離心機。
(三) 樣本前處理
以 0.9％生理食鹽水洗滌紅血球三次，存放於-80℃冰箱，直至分析。
(四) Kit 與試劑
1. Oxis Bioxytech SOD-525 (Oxis International, Inc, USA)：
R1：5,6,6a, 11b-tetrahydro-3,9,10-trihydroxybenzo fluorine, in HCl containing diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and ethanol。
R2：1-methyl-2-vinylpyridinium trifuloromethanesulfonate, in HCl。
Buffer：2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, containing boric acid and DTPA, pH=8.8(at 37℃)。
2. 二次去離子水：電阻係數大於或等於 18mΩ之純水。
(五) 分析前處理
1. 取適量的 Buffer，置於一開放式容器中，使之在 37℃與空氣接觸，
並利用 pipet 快速吸取 Buffer 數次。
2. 取適量血球樣本加入其 4 倍體積量之冰水中，混合均勻。
(六) 測定流程
1. 取 Buffer 900μl置待測於之 Blanks 及 Samples 離心管中。
2. 每次實驗至少配置 4 個 Blank。
3. 分別加入 40μl的 Blanks 及 Samples。
4. 分別加入 R2 30μl於 Blanks 及 Samples 中，混勻。
5. 水浴 37℃，1 分鐘。
6. 加入 R1 30μl分別於 Blanks 及 Samples 中，混勻。
7. 在波長 525nm 下，先以二次去離子水將吸光值歸零。
8. 於第 60 秒及第 120 秒測其吸光値。
(七) 濃度計算
1. 計算出 Blanks 與 Samples 的ΔA/min。Blank 標示為 Vc，Sample 標示為 Vs。
2. 將 4 次 Blank 的 Vc 取其平均值。
3. 將 Samples Vs 値除以 Vc。Vs/Vc 値必須大於 1，且 Vs/Vc 值範圍 在 3-8 為最佳，若值大於 8 則樣本需再稀釋後分析。
4. 由 Vs/Vc 比值間接求出 SOD 活性，如表 3-4-1(單位為 units/mL)。
5. 表中 SOD 活性，再乘以稀釋倍數及單位換算，則為樣本 SOD 活性。
例如：Vs / Vc= 2.90，則查表後 SOD 活性為 2.05 units/mL；
乘以稀釋倍數：2.05×5×25=256.25 U/mL
單位換算：256.25(U/mL) / 0.15(g/mL)=1708.33 (U/g Hb)
表 3-4- 1 SOD 活性計算：Vs/Vc Ratio
四、血液中鋅、銅濃度測定 (一) 儀器設備
火焰式原子吸收光譜儀(Flame Atomic Absorption Spectrometry; FAAS)，Model Z-5000 series Polarized Zeeman, Hitachi
(二) 試劑與試藥
1. 65％ HNO3，分析試藥級 (Merck, Germany)。
2. 單一金屬標準溶液(鋅、銅)：分析試藥級，1000ppm (Merk, Germany)。
3. 二次去離子水：電阻係數大於或等於 18mΩ之純水。
4. 標準參考品：Standard reference material (SRM)，LOT JL4409 (SERO, Sweden)。
(六) 濃度計算
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
Zn std conc. (ppm)
Abs
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 Cu std conc. (ppm)
Abs
圖 3-4- 4 元素銅之檢量線
表 3-4- 2 金屬元素分析-FLAAS 儀器參數
Element Zn Cu
Signal Mode BKG Corr. BKG Corr.
Measurement Mode Integral Integral
Slicing Height (%) 10 10
Wavelength (nm) 213.9 324.8
Determine the W.L. Auto Auto
Slit Width (nm) 1.3 1.3
Time Constant (s) 1.0 1.0
Lamp Current (mA) 6.5 9.0
表 3-4- 3 金屬元素分析參數
Element Zn Cu
Atomizer Standard Standard
Flame Type Air-C2H2 Air-C2H2
Fuel Flow (L/min) 2.0 2.2
Oxidank (kpa) 160 160
Oxidant (L/min) 15.0 15.0
Burner Height (mm) 7.5 7.5
Delay Time 5.0 5.0
Measurement time 5.0 5.0
表 3-4- 4 血清標準品參考值(SRM)之分析結果
金屬種類 單位 標準品參考值 測定值 準確度 (%) CV (%)
鋅 (Zn) mg/L 0.845
(0.791-0.899) 0.824± 0.034 1.54-6.63 4.13
銅 (Cu) mg/L 1.060
(0.997-1.123) 0.989± 0.003 6.42-6.89 0.30
五、測量分析之品質管制 (1) 空白值的配置：
每一批樣品進行前處理時，同時以二次水置備空白樣品，以檢測樣品是 否遭受污染。
(2) 重複分析：
每支樣品均做二重複，且變異係數(RSD%)須小於 15%。
(3) 標準品的檢測：
以 NIST (National Institute of Standard technology)之標準品參考 樣品(SRM)進行測試，以確定其準確度。
(4) 儀器偵測極限：
使用二次水上機連續測六次，求其標準差，取三倍標準差值即為儀器偵 測極限。
(5) 檢量線配置：
每次進行分析前均重新製作檢量線，相關係數須大於 0.995，才視為有效 檢量線。
(6) 回收率：
添加已知濃度在樣本中，並於相同樣條件下經過消化，上機測定，計算 其回收率，回收率須在 80%－120%間。