第四章 討論 ( Discussion )
第二節 實驗結果討論
在本實驗中，以RNAi 大規模篩選口腔癌特異性生物標記，初步篩 選51 個基因對於 HSC-3 細胞有大於 90%的生長抑制率。之後，由生 物資訊軟體分析可能的分子傳遞路徑；我們找出有興趣的路徑，由軟 體推測出 TGFBR2 引起 SMAD4 磷酸化作用造成細胞增生；也可能由 TGFBR2 引發 MAPK 相關蛋白磷酸化(或是 NF-ΚB 分子路徑磷酸 化)。此推測的分子傳遞路徑待後續實驗證實。
1. TGFBR2 分子傳遞路徑
TGF-beta 是一種細胞激素(cytokine)，在正常細胞胚胎參與發育 調控 (embryonic development)與組織間的恆定(tissue homeostasis) [43]。TGF-beta 的分子傳導路徑的發生，是由 TGF 的分子蛋白 (有四 種 TGF-beta 1、2、3、4；TGF-beta 1 常見於癌細胞的調控)，與細 胞膜上的受器TGF-beta receptor type II 結合後，磷酸化受器 TGF-beta receptor type 1，在細胞內進行一連串的訊息傳遞，主要是藉由 SMAD 蛋白作為傳遞分子( 亦有非依賴 SMAD 蛋白型的 TGF-beta 訊息傳 遞，如 MAPK 等蛋白)，產生癌細胞增生、移動或轉移等現象。研究 發現 TGF-beta 的訊息傳遞效應，在癌細胞有促進或抑制的效果，在癌 症初期大部份是抑制的作用，而在晚期時反而會促進癌細胞生長並擴 散 [44] 。 在 我 們 的 實 驗 中 TGF-beta receptor type II 的 兩 個 shRNA( TGFBR2-h、TGFBR2-i)與 SMAD4 的兩個 shRNA( SMAD4- d、SMAD4-e) 抑制 mRNA 的表現後，會造成人類口腔癌細胞 HSC-3 的死亡。
在 GeneGO 軟體推測的分子路徑圖中(圖二十二、二十四)，
TGFBR2 會磷酸化下遊的 p38MAPK 即( MAPK 14 ) ，使細胞產生移 動的現象。在我們的研究中，TGFBR2 是否會磷酸化口腔癌細胞 HSC-3 的MAPK14 蛋白，需要進一步由西方墨點法 ( Western blot )證實。並 且 TGF-beta receptor ll 的分子傳遞路徑在口腔癌細胞中的功能性(促 進增生、血管新生、腫瘤轉移)也待進一步實驗評估。
2. MAP 相關磷酸化蛋白 MAPK9 ( JNK2 )
MAP 磷酸化蛋白家族的一員，參與多項細胞處理過程，如: 細胞 增 生 、 分 化 、 轉 錄 調 控 與 細 胞 發 育 過 程 。 此 激 酶 會 與 轉 錄 因 子 (transcription factor)
作用，造成細胞不同的表現 (NCBI, Entrez Gene)。過去已有研究發 現 MAPK9 (JNK2)在人類頭頸癌細胞中活性增加，會造成癌細胞增 生，且與EGFR、VEGF、IL8 有關，被探討其抑制劑作為頭頸癌的藥 物治療的可能性[45]。
MAPK14 ( p38 )
MAP 磷酸化蛋白家族的一員，參與多項細胞處理過程，如: 細胞 增生、分化、轉錄調控與細胞發育過程。藉由環境的壓力或發炎反應 相關的細胞激素刺激後，由 MAP kinase kinases (MKKs)磷酸化作用 或自體磷酸化作用而活化。它的受質有轉錄調控因子ATF2、MEF2C、
MAX；細胞週期調控蛋白質 CDC25B，與抑癌蛋白 p53 (NCBI, Entrez
Gene)。研究發現，若抑制 p38 的活性，會提升癌細胞對放射線治療 的敏感性[46]。
MAP2K1IP1
Mitogen-activated protein kinase kinase 1 interacting protein 1，
活化MAPKK，目前較少研究發現其功能性 (NCBI, Entrez Gene)。
MAP3K13 ( LZK )
為 serine/threonine 蛋白激酶家族一員，含有 leucine-zipper motif，
其基因位於染色體3q27。可磷酸化 MAPK8/JNK 、MAP2K7/MKK7，
於 JNK/SAPK 分 子 路 徑 中 扮 演 MAPKKK (NCBI, Entrez Gene) [47]，目前較少研究其參與癌細胞的作用機轉的相關性。
MARK4
MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4，研究指出 MARK4 在大腦中影響神經細胞微管束的形成，可能參與 Alzheimer's disease 中 Tau 蛋白磷酸化的過程[48]。目前較少研究其參與癌細胞的作用機轉 的相關性。
3. NF-κB 分子傳遞路徑 IKBKB (IKK-beta)
IKBKB (IKK-beta)是 NF-κB 分子傳遞路徑的下游蛋白。在細胞質內 NFKB1 (p50) 或 NFKB2 (p52) 與 Rel 蛋白或 RelA (p65) 或 RelB 結 合成為 NF-κB 複合體蛋白 (NF-κB complex)；藉由細胞膜上的受器與 受質結合活化 IKBKA 或 IKBKB 蛋白質後，使 NF-κB 複合體蛋白中的 IκBα 磷酸化，由 ubiquitination 作用將其分解。此時 NF-κB 複合體蛋 白 成 為 活 化 態 ， 進 入 細 胞 核 內 與 特 定 的 DNA 區 段 (response elements；RE) 結合，影響 DNA 轉錄作用，引起細胞發炎反應或增 生等現象。已有許多的研究發現 NF-κB 傳遞路徑調控頭頸癌細胞的增 生作用 [49]。