RNAi 簡介
RNA 干擾 (RNA interference，縮寫為 RNAi) 是指一種分子生物學上 由雙股 RNA 誘發的基因沉默現象。當細胞中導入與內源性 mRNA 編碼區 同源的雙股 RNA 時，該 mRNA 發生降解而導致基因表達沉默。RNAi 現象 在生物中普遍存在， RNAi 與轉錄後基因沉默 (post-transcriptional gene silencing and transgene silencing) 在分子層面上證實是同一種現象。
RNA 干擾現象是 1990 年由 R. Jorgensen 研究小組在研對花青素合成 速度的影響時，為得到顏色更深的矮牽牛花而過量表達查爾酮合成酶 (Chalcone synthase)，結果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽牛花，此外，
他們發現轉植了過量查爾酮合成酶基因的矮牽牛花，其查爾酮合成酶的濃度 比正常矮牽牛花中的濃度反而低 50 倍。因而推測外源轉入的編碼查爾酮合 成酶的基因同時抑制了花中內源查爾酮合成酶基因的表達 [17]。1992 年，
Romano 和 Macino 也在粗糙鏈孢霉中發現了外源導入基因可以抑制具有同 源序列的內源基因的表達 [18]。1995 年，Guo 和 Kemphues 在線蟲中也發 現 了 RNAi 現象 [19]。1998 年，Andrew Z. Fire 等在秀麗隱桿線蟲
（C.elegans）中進行反股 RNA 抑制實驗時發現，作為對照加入的雙股 RNA 相比正股或反股 RNA 顯示出了更強的抑制效果，並將種現象命名為 RNA 干擾 [20]。2006 年， Andrew Z. Fire 與 Craig C. Mello 由於在 RNAi 機制 研究中的貢獻獲得諾貝爾生理及醫學獎。
而最早研究證明確認 RNAi 的作用機轉是需要經過四個步驟，乃是藉 由果蠅胚胎細胞 (S2 cells) 所得到的生化實驗研究結果。它的反應起始步驟
是 ATP-dependent ， 經 由 dicer (RNase III family of dsRNA-specific endonucleases) 將長片段的 dsRNA 剪成小片段(21-25 nucleotide)的 dsRNA 稱為 siRNAs (small interfering RNAs)。而這些 siRNA duplexs 隨後 與一些目前尚未確定與 RNAi 有關的一些 protein complex 結合在一起。接 著這個siRNA duplex 經由 ATP-dependent 進行 remodeling 解開整個纏繞 結構，形成 active RNA-induced silencing complex (RISC)，最後可能需要 少量的 ATP 幫助下，active RISC 可以辨認及切割 target RNA 將 specific target gene 以”Knockdown” [20] (圖七)。
圖七、RNA interference 運作機轉 [21]
另有研究發現，RNAi 現象在人體中內生性 (endogenous) 的發生，而 調控体內的生理現象者，同樣為21-25 nt 片段，稱之為微小型 RNA (micro RNA, miRNA)，與外源性 siRNA 不同的是，miRNA 藉由結合 mRNA 的 3`UTR，或者藉由阻止蛋白合成 (Translational repression)，而造成基因沉 默現象；而一般的 siRNA 是與 mRNA 產生完美性結合 (perfect match) 造 成 mRNA 的降解 [22, 23] (見 表七)。在植物與線蟲 (nematoges) 的研究 中發現RNAi 具有傳遞性。細胞內 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) 會藉由原本的 siRNA 當作引子 (Primer)，合成出新的 siRNA，作用類似 PCR 放大效應；或者可能直接由 RdRP 合成新的 siRNA 片段，造成 mRNA 的降解。並且，這樣的 siRNA 會在 2~5 個細胞之間傳遞，或者有更遠距離 的傳遞效果 (圖八) [22]。此外在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）上實驗時還可 使子一代產生基因突變。
圖八、RNAi 的放大及傳遞作用 [22]
Ds-RNA 藉由 (cholesterol、liposome、
antibody) 送入細胞的 Cytosol 中
在 2002 年研究發現， RNAi 現象不僅發生在 post-transcriptional 層 次 ， 由 Dicer 切 割 後 的 siRNA 會 與 RNA-induced initiation of gene silencing (RITS) complex 結合，在染色體上進行 RNA transcript 降解作用，
稱之為 Epigenetic silencing (圖九)。此外，還有研究發現，siRNA 參與 DNA 的甲基化作用 (methylation) [24]。
圖九、RNAi 作用於染色體上
[24]
RNAi 之載體設計
根據 RNAi 的作用特性，科學家們可以針對特定標記基因設計 shRNA (見表七)，藉由病毒感染作用 (Virus infection) ，將建構好的 shRNA 載體 直接送入細胞核內，由 RNA polymerase III 合成 shRNA，送至細胞質中。
或者是可以直接合成標地基因的 siRNA ，由轉染作用 (Transfection) 直接 將 ds-RNA 送入細胞的 Cytosol 中，藉 Dicer 切成 21-23 的片段，再與 Risc 結合，至終達到降解 mRNA，產生特定基因的沉默現象。
siRNA 使用載體較多樣化: 有結合在 Cholesterol (膽固醇)上，也有與抗 體結合，較常見的試用 liposome (微脂質體)。而 shRNA 則以病毒載體為 主。而動物實驗中，則以載體結合好的 siRNA 或 shRNA 在定位注射，或 者在小鼠的尾巴靜脈注射之(圖十)。
圖十、RNAi 載體使用分類 [25]
在早期的分子生物學家對於研究蛋白的生物功能之最常見的方法，是利 用突變技術將該基因進行突變，再觀察該基因的突變表現型 (mutant
phenotype) 對生物個體的影響，此技術稱為 forward genetics (Silva et al., 2004)。但是這項技術耗時且不具成本效益，故隨著 1998 年線蟲基因體 計畫 (C. elegans genome project) 的完成後，科學家便積極的開發找尋一 些快速及有效率的方法來進行大規模基因體 (Large-scale genome) 的研 究。在國內，中央研究院於 2004 年代表臺灣加入美國麻省理工學院/哈佛 大學的 Broad 研究所發起的核醣核酸干擾聯盟國際合作計畫 (TRC) (圖十 一)。至 2011 年前台灣可從此聯盟獲得（一）可沉默人類及老鼠各 16,000 基因的 shRNA RNAi 試劑庫 (10 shRNAs/ gene)；（二）獲得全部 shRNA RNAi 試劑庫之 knockdown 資料庫。圖十二為 TRC 設計的 shRNA 載體 (圖 十二)。
圖十一、RNAi collection 的策略聯盟 [26]
圖十二、TRC 設計的 shRNA 載體及序列 [27]