第四章 討論 ( Discussion )
第一節 RNAi 大規模篩選平台討論
1. RNAi 篩選平台的優缺點
由TRC 設計的 RNAi 篩選平台有許多的優點。主要針對蛋白質 激酶(Kinases)及蛋白質磷酸水解酶 (Phosphatases)等 1236 個基因所 的合成 6502 個 shRNA 序列，平均一個基因設計約有 5 個不同 mRNA 結合位置的 shRNA，以避免所謂的偏離標地效應 (Off-target effect)。
所有的 shRNA 序列由假慢病毒載體攜帶，置放於 96 孔盤中(共 71 盤)，每盤還附有兩孔是 no-targeted 的控制組病毒 shLuc。只需將細 胞種於另一 96 孔盤後，將病毒的 96 孔盤轉染至細胞。在實驗操作上 避免了如 cDNA microarray 所需抽取細胞的 mRNA，或 Proteomics approaoch 需要抽蛋白並跑二維電泳等步驟。並且由慢病毒為載體的 shRNA 轉染效率較好，篩選出來的基因若需要進一步由動物實驗證 實，亦可直接把以慢病毒為載體的 shRNA 注入動物體內，無需再另 外設計載體。實驗的二重覆結果相近，可能有不錯的再現性。有其缺
點為，(1) 因著以病毒為 shRNA 載體，需在 P2 級實驗室全程操作，
假若實驗操作不慎，可能造成人體的傷害； (2) 病毒存放於-80℃並冰 箱存放，使用前需先解凍，若實驗需多次存放，可能造成其感染力下 降，所以在轉染過程中，儘量一次完成。在病毒轉染過程，需以人工 操作，一批實驗一次只能操作五盤，二重覆(共 71 盤)，如此一個轉染 過程耗時五天，在連續的轉染實驗，花了將近兩到三個月的時間才完 成，相當費時，若有機械手臂操作，71 盤可一次轉染完成，總共只需 五天的時間。在資料的統整與分析上，亦為另一耗時的工作。
2. cDNA microarray 篩選平台的優缺點
過去已有學者藉由基因微陣列 (cDNA microarray) 方式，來篩選 口腔癌的特異性生物標記 [42]。此篩選平台是利用抽取口腔癌的組織 或細胞的 mRNA，與正常組織的 mRNA，轉成 cDNA 後，與 DNA 晶 片上的設計的成千至萬的 DNA 片段進行雜合作用 (Hybridization)，由 雜 合 後 產 生 的 螢 光 加 以 比 對 ， 同 樣 的 需 要 由 生 物 資 訊 方 法 (Bioinformatics) 分析有顯著差異的基因，作為特異性生物標記 [38]。
此平台的優點是能夠大量 (可設計含蓋所有人類基因體的 DNA 片段) 篩選，並且作用時間較短，雜合作用時間大約16 小時，較為省時。然 而其缺點乃是在抽取 mRNA 並轉成 cDNA 的過程較為繁瑣，在實驗過 程中需非常小心，避免所抽取的mRNA 受到污染或破壞；並且其實驗 結果的再現性較差，每次的結果可能稍有出入。
3. Proteomics approach 篩選平台的優缺點