2. 設計抑制呼吸道感染之病毒的 siRNA
在2005 年，學者 Bitko, V. 等人設計針對兩種呼吸道感染病毒
(Respiratory syncytial virus；RSV 和 parainfluenza virus；PIV ) 的 siRNA
序列。這兩種病毒於當時並無適當的疫苗或抗病毒藥物，研究發現經 siRNA 處理的細胞比起未加 siRNA 的控制組細胞，其 RSV 與 PIV 有明顯的下 降；動物實驗亦有類似的結果 [33]。3. 設計抑制神經性退化疾病 ALS 突變基因 SOD1 的 shRNA
Ralph,G.S.等人，於 2005 年發表的研究成果。乃針對神經性退化疾病 ALS 突變基因 SOD1 設計 shRNA 。在 ALS 小鼠模式實驗中，注入能夠 抑制突變基因 SOD1 之 shRNA 的小鼠的存活率大於控制組的小鼠。並且
從小鼠腦幹與脊髓之組織染色切片後發現，注入抑制突變基因 SOD1 之
shRNA 的小鼠，其神經元的正常型態及存活率大於控制組小鼠 [34]。4. RNAi 方式大規模篩選致病基因
在2005 年 Jeffrey 等人用 RNAi 方式大量篩選 Hela cell 中的蛋白質激 酶與蛋白質磷酸水解酶基因，(650 個蛋白質激酶，222 個蛋白質磷酸水解 酶)，得到了一些新的細胞凋亡調控蛋白質；在他們的實驗中發現了具有化 療抗藥性的基因；另外，他們利用篩選出來能夠抑制癌細胞生長基因的序 列，與低劑量化療藥物合併使用後，產生藥物協同作用，可以促使 Hela cell 發生細胞凋亡的現象 [35]。在 2007 年 Susan E.等人，同樣用 RNAi 方式 篩選 3700 個基因於三種不同的癌細胞株: H1299 (肺癌細胞)、MDA-MB-468
(乳癌細胞)、 DLD (直腸癌細胞)的影響。發現了三個基因 (Ran,TPX2,SCD1) 可以作為癌細胞的生物標記 [36]。 Moffat,J. 團隊於 2006 年發表利用 shRNA 來篩選調控癌細胞的基因的研究成果。他們利用核醣核酸干擾聯盟 國際合作計畫 (TRC)所合成 5000 個慢病毒載體的 shRNA 序列 (針對 1028 個基因)，轉至 HEK293T 細胞株內，篩選出 100 多個調控細胞分裂的基因 [37]。
第五節 實驗目的 ( Experimented Aim )
隨著分子生物研究的進步，越來越多疾病的探討已朝向基因體層次發 展， 以找出真正的致病機轉，癌症也不例外。由於癌症是由許多基因的突 變產生的，且具有高度生長及變異性，為臨床醫學治療上的一大難題，現有 傳統的化學治療已經無法應付。雖說癌症在臨床上的藥物治療，已逐漸進入 標靶藥物的時代，但現今在藥物的開發與使用上，仍處於萌芽階段，只有少 數幾種藥物在臨床上被使用。
近十年來，藉由分子生物方法，找出各種癌細胞的作用機轉，進而研發 出許多針對癌細胞分子標地的藥物。大部份研究乃是針對乳癌、肝癌、肺癌，
在口腔癌方面系統性的研究尚處於萌芽階段。在 2004 年，學者 Warner,G.C 等人利用 cDNA microarray 方式，找到口腔癌轉移相關蛋白質 CLDN1 [38] 。之後在 2006 年，學者 Lo,W-Y 等人蛋白質體學方法，藉由正常檢體 與癌症檢體的蛋白質二維電泳膠的分析比較後，找到幾個在口腔癌中過度表 現的蛋白質，作為生物標記；再利用 LC-MS/MS 分析其蛋白質的胺基酸序 列。其中 Vimentin、Tropomyosin2、MnSOD、HSP27 等蛋白質被發現有 過度表現的現象 [39]。 2008 年，學者 P Holfman 等人，利用 Tissue microarray 的方式，找到 actin-binding Src substrate - Cortactin 作為頭頸 癌的臨床生物標記 [40]。
由於目前國人口腔癌的罹患率有節節升高的趨勢，但對於口腔癌的分子 機轉及生物指標並無全面性的研究，因此本研究乃由中央研究院國家基因體
中心 RNAi 核心設施 (National RNAi core facility)購入敏感性干擾性核糖核 酸庫 (sensitized RNAi library)，以大規模的 RNAi 技術篩選口腔癌的特異 性基因。本研究總共使用 6502 個 shRNA clone constructs 的部份 shRNA 慢病毒 (Lentivirus) 載體，乃針對有 1236 個基因所設計；包括 737 是蛋白 質激酶、 209 蛋白質磷酸水解酶 和 30 基因有雙重功能 (表八)。偵測各個 shRNA 對癌細胞生長的影響。再藉由生物資訊軟體 GeneGo 分析篩選可能 的致病基因間的相互關係與訊息傳遞路徑。我們認為本研究將有助於早期診 斷口腔癌的檢測試劑的開發，或是發展出更多對抗此標的分子 (Therapeutic targets) 的標靶藥物。
表八、1236 個 shRNA 基因分類
Gene Category Gene
number Percentage
Kinase 737 59.63%
Phosphatase 209 16.91%
Kinase & Phosphatase 30 2.43%
Subtotal 976 78.96%
Transcription factor 37 2.99%
Tumor suppressor 16 1.29%
Transcription factor & Tumor
suppressor 15 1.21%
Subtotal 68 5.50%
None 64 5.18%
Others 128 10.36%
Total 1236 100.00%