Virus titer 定量測試 ( 找出適合HSC-3 的條件)
6502 個 shRNA 大規模篩選
( 71 個 96 孔盤含 shRNA 序列的慢病毒 載體之感染實驗)
基因分類整理
(找出大於 90%抑制細胞生長率的 shRNA 株及其標靶的基因)
分子路徑分析應用軟體 ( Gene Go )
第二節 實驗材料 ( Material )
細胞株 (cell line)
HSC-3 為一惡性度高的舌癌細胞，從高雄醫學院獲得，以 DMEM/F12 培養 液含 10% FBS (Hycolne) 培養。細胞培養箱的溫度為 37℃，CO2濃度為 5%。
慢病毒載體結構；(圖十三)
(中央研究院 RNAi 核心設施提供)
第三節 病毒力價實驗 ( Virus tittering )
實驗目的
病毒對於每種細胞株有不同的感染力，為了使用最適合的病毒劑量，可 藉由不同濃度的 shLuc 慢病毒感染細胞後，藉由細胞存活率試驗，作出一標 準曲線。以算出病毒相對定量的單位 (R.I.U.)，再經由公式計算，可得知實 驗中病毒感染的最佳劑量。
實驗材料
1. HSC-3 細胞
2. shLuc VSV-G 假型慢病毒(Pseudotype Lentivirus) 3. 細胞培養液 DMEM/F12 培養液含 10% FBS (Hycolne) 4. Polybrene
5. Puromycin 6. CCK-8 試劑
7. P2 級實驗室 (由 14F 中國醫藥大學醫技系 提供)
實驗流程
將3000 顆 HSC-3 細胞種至 96 孔盤中，以 DMEM/F12 培養液含 10%
FBS (Hycolne) 置於恆溫培養箱一天；24 小時後，將 shLuc 慢病毒原液以 培養液兩倍稀釋成不同濃度 ( 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 ；μL / 5 μL)，
如下表所列。
將細胞培養液加入polybrene (陽離子聚合物，增加細胞轉染效率)，濃 度分別用5 μg/mL與10 μg/mL，以得到較佳病毒感染實驗條件。之後，將原 來細胞培養液換成含有 polybrene 的培養液，再依序將剛剛稀釋好的病毒 液加入96 孔盤中。24小時後，換成含有 puromycin 的細胞培養液，濃度 分別用5 μg/mL與10 μg/mL，篩選轉染成功的細胞。(shLuc慢病毒載體序 列帶有 anti-puromycin 的基因，所以加入 puromycin 後仍能繼續生長；未 轉染成功的細胞，在含 puromycin 的培養液中則會死亡)。48小時後，加入 細胞存活率檢測試劑 CCK-8 (10 μL)。 CCK-8為一 tetrazolium salt 與活細 胞內的 dehydrogenase 作用後，產生黃色的 formazan 物質，顏色越深表 示活的細胞數越多。作用3小時後，用 ELISA reader 於波長nm 450條件 下，分析細胞的存活率。用Excel畫出病毒濃度與細胞存活率的標準曲線，
比較不同試劑條件的轉染效率，並計算出HSC-3的病毒相對定量單位 (R.I.U.)。
(詳細步驟流程請參閱 National RNAi core facility, TRC protocol)
實驗步驟
1. 將 3000 顆 HSC-3 種於 96 孔盤(含 100 μL 之 DMEM/F12+10% FBS 培養液)，置於細胞培養箱。
2. 24小時後,將原來的細胞培養液換成45 μL含10 μg/ml polybrene 或含 5 μg/ml polybrene的細胞培養液，置於細胞培養箱。
3. 稀釋病毒原液(shLuc VSV-G 假型慢病毒，1.8 x 104 R.I.U/μl、4 μL/ 5 μL；中央研究院 RNAi 核心設施)；成不同濃度( 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125,
0.0625 μL/ 5 μL)。依序將稀釋好的病毒加 5 μL 於 96 孔盤中，置於細 胞培養箱。
4. 24小時後，取出細胞培養液並用DPBS（100 μL）清洗殘餘的病毒，置 換成含有puromycin的培養液100 μL ( 5 μg/mL或10 μg/mL) ，置於細胞 培養箱。
5. 48小時後，加入CCK-8試劑（10 μL），置放於細胞培養箱3小時後，以 ELISA reader 在波長450 nm 條件下，測量吸光值並分析細胞的存活 率。
6. 用Excel 軟體畫出病毒濃度與細胞存活率的標準曲線，比較不同試劑條 件的轉染效率，並計算出HSC-3的病毒相對定量單位 (R.I.U.) (參考下列 公式)。
病毒相對定量單位(R.I.U.)的計算
從中央研究院RNAi 核心設施所訂購的 71 盤 shRNA 慢病毒的病毒濃度 是已知，乃是以 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值 (relative infection unit)。R.I.U 是計算病毒感染細胞的相對定量單位。但是因為同一種病毒感 染不同的細胞株，所需的單位劑量皆有所不同，所以我們利用下面的公式，
將 71 盤 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值，轉換成 HSC-3 細胞株的 R.I.U 值，使病毒感染實驗的劑量使用更加準確。先從 HSC-3 的病毒力價實驗中 所測得的標準曲線中，在線性的範圍中選擇病毒體積為 1 μL 時，所對應的 細胞存活率(例如:為 46.51%)，算出 HSC-3 control virus (shLuc) R.I.U，再 利用 71 盤 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值，轉換成 HSC-3 細胞株的 R.I.U 值，詳細步驟如下：
病毒相對定量單位 (R.I.U.) 的計算公式:
1. 計算 HSC-3的 control virus (shLuc) R.I.U
(46.51% 細胞存活率x 3000細胞數) / 1μL(病毒體積)
= 1395.3 R.I.U./ μL
2. 轉換 A549的R.I.U值成HSC-3的R.I.U.值