利用敏感性核醣核酸技術篩選人類口腔癌細胞特異性生物標記; Sensitized RNAi screening for human oral cancer to identify novel biomarkers
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(2) 中文摘要 口腔癌已成為全球重視的衛生課題，世界衛生組織預估，罹患口腔 癌的病人將逐年攀升。在台灣，口腔癌已成為國人癌症死因的第六位， 成為台灣目前所極需解決的問題之ㄧ。 在本篇的研究中，我們與中央研究院 RNAi 核心設施中心合作， 利用大規模 RNAi 篩選技術，來觀察調控生物體生長的蛋白質、蛋白 質激酶與蛋白質磷酸水解酶。共有 6502 個針對 1236 個基因(其中 737 個是蛋白質激酶、209 個蛋白質磷酸水解酶、30 個雙重功能的基因)所 設計的 shRNA 序列。以慢病毒 (Lentivirus) 載體將各個 shRNA 轉染 至人類口腔癌細胞 HSC-3 細胞株，再以細胞存活試劑 (CCK-8 kit) 測 試細胞存活率。 篩選結果，有 51 個 shRNA 標地基因處理的細胞存活抑制率大於 90%，我們稱之為促進癌細胞生長基因。再將篩選出的 51 個促進癌細 胞生長基因，利用 GeneGo 分析軟體，推導四條可能促進口腔癌生長 細胞的訊息傳導路徑，分別為 IPP-1、TGF beta receptor II、EGFR、 FLT-3，其中以 TGF beta receptor II 為主要可能參與口腔癌細胞增生的 路徑。之後，需要進一步由分生或細胞生物實驗證實。本研究提供了系 統化的方式篩選口腔癌化之分子訊息傳導路徑，這些推測的訊息傳導路 徑及相關基因在口腔癌化的角色，及發現未來臨床藥物治療的新標靶。. I.
(3) Abstract Oral cancer is an important worldwide health problem. WHO predicts a continuing worldwide increase in the number of patients with oral cancer. In Taiwan, oral cavity cancer is also a critical health issue because it is the sixth leading cause of cancer death. In this study, through collaborating with the RNAi Core of Academia Sinica, we used a large-scale RNAi approach to identify kinases and phosphatases that regulate cell survival in the human oral cancer HSC-3 cell line. A total of 6502 shRNA clones targeting to human kinases and phosphatases, covering 1236 genes with 737 kinases, 209 phosphatases and 30 dual function genes, were screened in this project.. Lentivirus-shRNA constructs of these. genes were used to infect HSC-3 cells and cell viabilities were assessed using CCK-8 Assay kit. Amongst the 1236 genes, silencing of 51 genes were found to inhibit cell growth rate greater than 90%. genes as tumor growth promotion genes.. We designated those Later, these growth. promotion genes were analyzed by GeneGo software for their molecular pathway.. We have obtained four putative pathways. (IPP-1, TGF-beta receptor II, EGFR, and FLT-3) resulting from the GeneGo analysis, and TGF-beta receptor II may be the main pathway involved in cancer proliferation.. Further studies are. required to verify these candidate pathways and genes involved during oral oncogenesis. This study provides a systematic way to unravel the molecular mechanism leading to oral cancer and further finding for new targets for clinical oral cancer therapy.. II.
(4) 目錄 中文摘要…………………………………………………………….I 英文摘要…………………………………………………………….II 目錄…………………………………………………..................III~IV 圖片索引………………………………………………………...V~VI 表格索引……………………………………………………..…....VII 附錄索引………………………………………………………….VIII 序言..........................................................................................IX. 第一章 緒論 ( Introduction ). 第一節 癌症及口腔癌 ( Cancer & Oral cancer )………..1~17 第二節 癌症基因治療 ( Cancer Gene Therapy)...........18~19 第三節 慢病毒載體之基因轉移 ( Lentivirus mediated gene transfer )…………………………………………20~22 第四節 核醣核酸干擾現象 ( RNA interference; RNAi ) ……………………………………………………23~33 第五節 實驗目的 ( Experimented Aim )……………….34~35. III.
(5) 第二章 實驗材料及方法 ( Materials & Methods ). 第一節 實驗流程 （Experimented flow chart ）………….36 第二節 實驗材料（Materials）…………………..………….37 第三節 病毒力價實驗 ( Virus tittering )………………..38~42 第四節 shRNA 大規模轉染實驗 ( Lentivirus-based shRNA screening)………………….…………..43~44 第五節 生物資訊軟體 GeneGo 分析 ( Bioinformatics analysis-GeneGo )...…………………………..45. 第三章 實驗結果 ( Results )…………………………46~59. 第四章 討論 ( Discussion ). 第一節 RNAi 大規模篩選平台討論……….………….60~62 第二節 實驗結果討論……….……………………...63~66 第三節 口腔癌特異性生物標記評估……….…………...67 第四節 未來研究方向……….…………………………68. 第五章 圖表 ( Figures & Tables )..…………………….69~98 第六章 引用文獻 ( References )…………………...99~102 第七章 附錄……………………………………..103~119. IV.
(6) 圖片索引 圖一、癌細胞增生擴散過程............................................................3 圖二、細胞週期 G1/S 管制點調控..................................................4 圖三、國人口腔癌歷年死亡率………………………………………...8 圖四、九十六年國人癌症粗死亡率…………………..……………….8 圖五、口腔癌之診斷方式,病理組織切片……………………………..9 圖六、慢病毒感染細胞過程………………………………………….22 圖七、RNA interference 運作機轉….…..…………………………..24 圖八、RNAi 的放大及傳遞作用………….…………………………..25 圖九、RNAi 作用於染色體上………..……………………………….27 圖十、RNAi 載體使用分類…..……………...………………………28 圖十一、RNAi collection 的策略聯盟..……………………...............29 圖十二、TRC 設計的 shRNA 載體及序列.………………………….30 圖十三、慢病毒載體結構…..………………………………………..37 圖十四、NF-κB 分子傳遞路徑………..……………………………..66 圖十五、shLuc VSV-G 假型慢病毒感染細胞時所用之體積和細胞存活率的 關係…….......................................................................69. 圖十六、病毒力價及細胞存活率線性分析………………..….……..70 圖十七、1236 個 shRNA 基因篩選結果( 51 個促進癌細胞生長基因)73 圖十八、GeneGo分析51個促進細胞生長基因的分子路徑………….74 圖十九、GeneGo統計分析51個促進癌細胞生長基因的分子路徑…..76. V.
(7) 圖二十、 GeneGo評估 51個基因的細胞生理功能…………………..77 圖二十一、51 個基因調控組織修復的分子路徑……………………..77 圖二十二、TGF-beta 藉由 MAPK 引起 EMT 的路徑圖………………78 圖二十三、TGF-beta 訊息傳遞路徑圖………………………………79 圖二十四、TGF-beta 調控細胞增生機轉(正常或病態條件)………….80 圖二十五、TGF-beta receptor ll 之 shRNA 作用後的細胞存活率…..82 圖二十六、TGF-beta receptor ll 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制 率………………………………………………………….82 圖二十七、SMAD 4 之 shRNA 作用後的細胞存活率……….............84 圖二十八、SMAD 4 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率…….........84 圖二十九、MAPK9 之 shRNA 作用後的細胞存活率………...………86 圖三十、 MAPK9 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率……….......86 圖三十一、MAPK14 之 shRNA 作用後的細胞存活率………...........88 圖三十二、MAPK14 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率…............88 圖三十三、MAP2K1lP1 之 shRNA 作用後的細胞存活率…..............90 圖三十四、MAP2K1lP1 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率...........90 圖三十五、MAP3K13 之 shRNA 作用後的細胞存活率.....................92 圖三十六、MAP3K13 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率..............92 圖三十七、MARK4 之 shRNA 作用後的細胞存活率........................94 圖三十八、MARK4 之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率.................94 圖三十九、IKBKB (IKK-beta)之 shRNA 作用後的細胞存活..............96 圖四十、 IKBKB (IKK-beta)之 shRNA 作用後的細胞生長抑制率....96 圖四十一、1236 個 shRNA 基因篩選結果(11 個功能未明的基因)….98. VI.
(8) 表格索引 表一、 細胞週期表………...…………………………………………5 表二、 國人歷年口腔癌死亡人數、死亡率……..……….……………7 表三、 化療藥物分類……………………………..…………………16 表四、 標靶藥物分類…………………………..……………………17 表五、 基因載體分類………………………..………………………20 表六、 病毒載體分類…………..……………………………………21 表七、 各種 RNAi 的比較……………..…………………..............26 表八、 1236 個 shRNA 基因分類…..……………………………….35 表九、 71 盤病毒使用量………...……….………………...............42 表十、 1236 個 shRNA 基因篩選結果( 51 個促進癌細胞生長基因). ………………………………….………….………… 71~72 表十一、GeneGo統計分析51個GeneGo促進癌細胞生長基因 的分子路徑………………………………..……………….75 表十二、所有 TGF-beta receptor ll 的 shRNA 作用結果比較……...81 表十三、所有 SMAD 4 的 shRNA 作用結果比較…………..............83 表十四、所有 MAPK9 之 shRNA 作用結果比較………...................85 表十五、所有 MAPK14 之 shRNA 作用結果比較…….…................87 表十六、所有 MAP2K1lP1 的 shRNA 作用結果比較……................89 表十七、所有 MAP3K13 的 shRNA 作用結果比較………………….91 表十八、所有 MARK4 的 shRNA 作用結果比較………...................93 表十九、所有 IKBKB 的 shRNA 作用結果比較…………….............95 表二十、1236 個 shRNA 基因篩選結果(11 個功能未明的基因)…………97. VII.
(9) 附錄索引 附錄一、HIV-1 基因組態與轉植載體比較 附錄二、1263 個基因的功能分類表 附錄三、1236 個 shRNA 基因篩選結果表格( 42 個抑制癌細胞生長基 因) 附錄四、GeneGo統計分析42個抑制癌細胞生長基因的分子路徑 附錄五、GeneGo評估42個基因的細胞生理功能表 附錄六、GeneGo評估42個基因的細胞週期調控表 附錄七、1236 個 shRNA 基因篩選結果圖( 42 個抑制癌細胞生長基因) 附錄八、GeneGo 分析 42 個抑制細胞生長基因的分子路徑 附錄九、GeneGo 統計分析 42 個抑制癌細胞生長基因的分子路徑 附錄十、ERBB 家族的分子傳遞路徑圖 附錄十一、HIF 藉由受器調控的分子路徑圖 附錄十二、EIF2調控轉錄層次的分子路徑圖 附錄十三、GeneGo評估42個基因的細胞生理功能圖 附錄十四、GeneGo評估42個基因的細胞週期調控圖 附錄十五、NEK 所參與的細胞週期調控路徑. VIII.
(10) 序言. 很榮幸能夠就讀中國醫大的醫學研究所，在這兩年多的時間內 學習到許多寶貴的知識，特別感謝生化科所有的老師與學長姊， 以及我的指導老師李妙蓉老師，細心的叮嚀與教導。也感謝高銘 欽老師、葉明翰學長以及實驗室所有同仁的幫助，使本人的論文 能夠完成。 研究所的兩年是我人生的轉捩點，在碩一下學期時，我的母親 發現輸卵管癌末期，從治療到結束整個過程，使我對人生有不一 樣的看法。感謝同學們的打氣，如果沒有你們的幫助，我想自己 可能無法完成碩士的學程。感謝我的父親放下工作日夜的照顧， 召會中的弟兄姐妹的禱告與扶持，叫我認識神的愛。盼望將這論 文送給我摯愛的父母，感謝你們的養育之恩，特別感謝母親從小 到大的呵護與照顧，使我能快樂的成長。最後要謝謝主耶穌，認 識主使我得著人生的真諦實意，祂是我們人生的牧人，帶領我走 過死蔭的幽谷，使我重享救恩之樂，感謝神，願一切的榮耀歸給 祂！. ＂只是從前我以為對我是贏得的，這些，我因基督都已看作虧損。... 我因祂已經虧損萬事，看作糞土，為要贏得基督。＂＜腓三 7~8＞ IX.
(11) 第一章 緒論 ( Introduction ) 第一節 癌症及口腔癌 ( Cancer & Oral cancer ) 癌症流病簡介 二十年來，癌症已經成為決定人類生命期望值 (life expectancy) 的主 要 原 因 。 癌 症 是 全 球 主 要 死 亡 原 因 ， 世 界 衛 生 組 織 (World Health Organization, WHO) 預估在 2015 年，大約將有一百二十五萬人口死於癌 症。在台灣每四人就可能有一人得到癌症，根據國民健康局的統計，過去十 年來，三十至五十九歲的罹癌人數已增長 81%；根據行政原衛生署統計，從 民國七十一年起，癌症已經成為國人十大死亡原因的第一位(16,559 人)， 並且死亡人數逐年攀升，至民國九十六年(2007)，死亡人數已達 40,306 人。 研究發現，癌症並非突然間造成的，反而比較類似慢性病，是致病因素經年 累積而成的，除了先天遺傳的問題外，像是抽煙、過度飲酒、不當飲食、環 境污染、不正常的生活作息等，都是促使癌症成為近代可怕殺手的致病因 素。所以對於癌症的預防篩檢與早期治療，便成為這世代一門重要的功課。. 癌症細胞生物學 癌症的發生過程是多重步驟，目前確信是因調控細胞生長的蛋白質失去 9. 原本正常的功能，造成細胞不正常的增生，並且癌細胞大約生成至 10 個(約 1 克)為醫學上可檢測的腫瘤大小 [1]。因著腫瘤快速的增生，必須藉由無氧 糖解來獲得能量來源，之後藉由釋放血管生成因子 (VEGF) 等蛋白質的訊 1.
(12) 號，來進行血管新生作用 (angiogenesis) 以得到血液的養分供應(圖一) 。 研究發現不論在腫瘤的增生、血管新生或轉移 (Metastasis) ，都是藉由細 胞內一連串複雜的訊息傳遞所造成的。. 文獻指出蛋白質激酶 (kinase) 與蛋白質磷酸水解酶 (phosphatases) 是調節細胞傳遞路徑 (cell signaling) 與細胞週期生長 (cell cycle) 的重要 因子，促使癌細胞產生增生、凋亡等現象發生。一般由外來的蛋白質分子與 細胞表面的受體 (Receptor)結合，這樣的受體大概分為三類:離子通道蛋白 (Ion channel receptor) 、G 蛋白 (G protein-linked receptor)、激酶催化性 蛋白 (Tyrosine kinase receptor)，包含: EGF、Insulin、IGF、PDGF、 M-CSF、FGF、VEGF 等磷酸化蛋白受體。在經過細胞受器接受外來分子訊 號後，細胞內會產生訊號傳遞(Transduction)，藉由一連串的磷酸化作用， 如：RAS、MAPK、PKA、IP3、JAK-STAT、NF-kB、SMAD 等，將訊號蛋 白送入細胞核內，而進一步產生細胞週期的調控、細胞移動、存活、死亡等 生理作用。. Cell signal process Receptor. Transduction. Response. 1. Ion channel 2. G protein-linked 3. Enzyme linked receptor(Tyrosine kinase) Amplification of the cell signal by: 1. Protein phosphorylation(or dephosphorylation) 2. Small molecules& ions as “second messengers” 1. Produce or control the cellular activities 2. Turn on or off the “Gene” 3. Resulting in cell growth, cell death, invasion, metastasis… 2.
(13) 圖一、癌細胞增生擴散過程 [2]. 3.
(14) 細胞週期調控. 細胞的生長在人體內是由細胞週期所調控，分為四個時期，G0、 G1、 S、G2、M 期。如果細胞發生問題，在細胞內有管制點 (check point)，停 止細胞週期的運作，亦是由一些蛋白質來調控管制點的運作 (表一)。細胞 週期會受到 Cyclin-CDK 蛋白的調控。研究發現 G1/S 管制點調控是藉由外 來分子的刺激，使細胞內產生訊息傳遞蛋白，如 Ras 等，促進 Cyclin D 與 CDK4 結合並活化，CyclinD- CDK4 使 Rb 蛋白磷酸化。Rb 蛋白與 E2F 結 合時，造成 Histone deacetylation(去乙醯基化)，使 DNA 包裹緊密，不能 產生複製。 一旦 Rb 磷酸化後，會與 E2F 分開，使 DNA histone acetylation， 並使 E2F 蛋白活化。E2F 會促使 CyclinE 與 CDK2 結合並活化，使細胞通 過 G1 期的限制點 (Restriction point)，而促使 DNA 的複製 (圖二)。. 圖二、細胞週期 G1/S 管制點調控 [2]. 4.
(15) 而已知一些蛋白質，如 p53、p21、p27 等，會抑制此細胞生長的訊號， 一但這些蛋白的基因被破壞，會使細胞不受控制的大量生長，而造成癌化的 結果產生。 表一、 細胞週期表 Stage. Major Features Interphase. G0 phase. 正常細胞大多處於此期，預備分裂所需物 質，穩定. G1 phase. 細胞準備期，此時細胞開始生長，形態會 變大 ; G1/S 檢查點. S phase. 此時DNA開始複製，染色體濃縮. G2 phase. 細胞生長，形態會變大; G2/M 檢查點 M phase. Prophase. 染色體濃縮，紡錘體形成；染色體交換. Prometaphase. 細胞核瓦解，紡錘體維繫固定染色體中心 的著絲點. Metaphase. 染色體排列成一直線. Anaphase. 姊妹染色體分開，並且往紡錘體兩軸靠攏. Telophase. 細胞核膜重新合成,並且染色體呈現放鬆 狀態. Cytokinesis. 細胞質平均分配到兩個細胞中，細胞分裂 完成; 植物細胞壁於此時完成. (參考: Genetics -a concepture approach；Benjamin A. Pierce) 5.
(16) 口腔癌簡介 口腔癌已成為世界衛生組織 ( W.H.O.) 所重視的課題，並且罹患者有逐 年增加的趨勢，美國官方預估每年口腔癌上升率 31,000/每年，其引發原因 主要是飲酒、抽煙、病毒感染 [3]。在亞洲地區，口腔癌發生率較西方更為 普遍。台灣地區每年皆有 2400 人死於口腔癌，吃檳榔、抽煙、喝酒是常見 的致癌原因。根據行政院衛生署的統計，口腔癌的死亡率有逐年增加的趨勢 (圖三)；民國七十五年癌症登記報告顯示，國內口腔癌的死亡人數為 423 人，死亡率為每十萬人 2.2，比鼻咽癌高，佔癌症死亡率的第十一位 (表 二) ，及至九十六年，死亡人數已經高達 2312 人，死亡率為每十萬人 10.1， 成為所有癌症死因的第六名 (圖四)。其中男性更高達 2152 人，死亡率達每 十萬人 18.6，並成為男性癌症死亡原因的第四名 (表二) 。. 口腔癌的種類有鱗狀上皮細胞癌 (squamous cell carcinoma)、疣狀癌 (verucous carcinoma)、腺樣囊狀癌 (adenoid cystic carcinoma) 、黏液表 皮樣癌 (muco-epidermoid carcinoma) 等，以鱗狀上皮細胞癌最多，其次 為腺樣囊狀癌，疣狀癌，黏液表皮樣癌。各種口腔癌男女發生機會在鱗狀上 皮細胞癌為男多於女，黏液表皮樣癌男女幾乎相等，腺樣囊狀癌則女多於 男。鱗狀上皮細胞癌在口腔的發生部位以舌部最多，其次為頰粘膜、牙齦、 顎、口底部及口唇，而牙齦癌左右比為 1:2，右側偏高。牙齦癌及頰粘膜癌 比率偏高，可能和嚼檳榔有關 [4]。 6.
(17) 表二、 國人歷年口腔癌死亡人數、死亡率 男性 年別 口腔癌 死亡人數 Year 75 年 1986 349 76 年 1987 379 77 年 1988 408 78 年 1989 457 79 年 1990 386 80 年 1991 494 81 年 1992 547 82 年 1993 631 83 年 1994 689 84 年 1995 830 85 年 1996 941 86 年 1997 1,041 87 年 1998 1,076 88 年 1999 1,186 89 年 2000 1,375 90 年 2001 1,436 91 年 2002 1,501 92 年 2003 1,723 93 年 2004 1,838 94 年 2005 1,874 95 年 2006 2,044 96 年. 2007. 2,152. 不分性別. 順位. 口腔癌 死亡率. 口腔癌 死亡人數. 順位. 口腔癌 死亡率. 8 7 7 7 7 7 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4. 3.5 3.7 4.0 4.4 3.7 4.7 5.1 5.9 6.3 7.6 8.5 9.4 9.6 10.5 12.1 12.6 13.1 15.0 15.9 16.2 17.7. 423 445 464 521 452 549 626 694 779 902 1,042 1,163 1,167 1,298 1,494 1,560 1,613 1,860 1,993 2,041 2,202. 11 11 12 10 12 10 8 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6. 2.2 2.3 2.3 2.6 2.2 2.7 3.0 3.3 3.7 4.2 4.9 5.4 5.3 5.9 6.7 7.0 7.2 8.2 8.8 9.0 9.6. 4. 18.6. 2,312. 6. 10.1. (來源: 行政院 衛生署,2008.10). 7.
(18) 圖三、國人口腔癌歷年死亡率. 國人口腔癌歷年死亡率 (1995-2007) 2007 2006 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 -. 5.0 男性. 10.0. 不分性別. 15.0. 20.0. 死亡率(%). 圖四、九十六年國人癌症粗死亡率 九十六年 國人癌症粗死亡率(%) 5.9 6.3 7.4 8.6 10.1 10.8. 胰臟癌 食道癌 子宮頸癌 攝護腺癌 口腔癌 胃癌 女性乳癌 結腸直腸癌 肝癌 肺癌. 13.7 19.5 34.1 34.9. -. 5.0. 10.0. 15.0. 20.0. 25.0. 30.0. 35.0. 40.0. 粗死亡率(%) (來源: 行政院 衛生署,2008.10). 8.
(19) 根據國家衛生研究院在民國八十七年，發表的“口腔癌臨床治療共識＂ 一文中，提及口腔癌的臨床判定及相關治療原則 [5]。正常口腔黏膜是粉紅 色或紅色柔軟組織，如果變厚、變成突起不透明白色的斑塊，便是口腔白斑 (圖五)；如果有變薄或略為潰爛的紅色斑塊，便是紅斑，兩者可能是癌前病 變，可惡化成口腔癌。口腔癌的臨床表徵是難癒合的潰瘍或突出的潰爛硬 塊，常伴有轉移的頸部淋巴腫塊。早期常不覺疼痛，偶而出現帶血的唾液， 因此不痛的潰瘍或突出硬塊才可怕，常常有人因不痛而忽略早期癌症的存 在，錯失早期診斷、正確治療的良機。. 圖五、口腔癌之診斷方式,病理組織切片 [6] Oral Leukoplakia(白斑). Hyperplasia (增生、肥大). Mild Dysplasia (輕微異生). Oral Cancer. Moderate Dysplasia. Severe Dysplasia. (中度異生). (重度異生). 9. Cancer (癌症).
(20) 口腔癌臨床分期 口腔癌分期的主要目的在確立治療方式的選擇，評估預後及比較不同治 療方式的結果。目前口腔癌的分期是依據原發腫瘤大小 (T)、頸部淋巴結轉 移與否 (N)、是否有遠隔轉移 (M) 的TNM系統 (UICC，AJCC 1988分期) 來 決定。共分五期；零. 期：即原位癌，腫瘤細胞局限在口腔黏膜上皮內。第. 一期：腫瘤的最長徑小於或等於2公分，且無頸部淋巴結 (或遠隔) 轉移。 第二期：腫瘤的最長徑大於2公分但不大於4公分，且無頸部淋巴結 (或遠隔) 轉移。第三期：腫瘤的最長徑大於4公分或已轉移到同側頸部的淋巴結，此 淋巴結之最長徑不超過3公分。第四期：包含以下任何一種情形 (1) 腫瘤侵 犯鄰近的組織 (如：穿過骨外層，深入深層肌肉、上頜竇、皮膚)。(2) 頸 部淋巴結轉移的數目超過一個 (不論是在原發病灶的同側、對側或兩側都 有)、或是淋巴結的最大徑已超過3公分。(3) 已發生遠隔轉移 [5]。. 口腔癌的治療 臨床上常見的有外科治療、放射治療、化學治療，其他像是免疫療法、基因 療法，或其他較新穎的生物療法尚未成熟，仍在研究階段，臨床上較少使用。. 1. 外科治療 手術切除是治療口腔癌最重要的步驟，依期數的不同而有不同程度的切 除： 10.
(21) A. 原位癌：只做病變處切除。 B. 第一期：只做病變處切除，視病情需要，加做頸部淋巴結切除。 C. 第二期：病變處及上頸部淋巴結切除。 D. 第三期：廣泛病變處切除及頸部廓清術。 E. 第四期：大範圍切除病變處及頸部廓清術，可能包括臉部皮膚，或部分 上、下顎骨。. 2. 放射治療 除了少數例外，放射治療可用於不同大小的口腔癌，對於小的局限性腫 瘤，手術切除及放射治療都是一有效的療法，但需要考慮到病人的年齡，對 於手術或放射治療的意願及容忍性。對於第三及第四期的病人，則視情形可 能需要合併手術及放射治療。手術後如有危險因素，如：手術切口邊緣仍有 殘存腫瘤細胞、淋巴結轉移 (二粒以上)、淋巴結膜外侵犯、神經周圍或淋 巴血管侵犯者，需行手術後放射治療。病患在行放射治療前都要會診牙科或 口腔顎面外科醫師，評估牙齒及牙齦的狀況，如果有嚴重的牙齦疾病或蛀 牙，需在放射治療前治療牙科疾病或拔牙，待傷口完全復原後才可開始放射 治療 [5]。. 11.
(22) 3. 化學藥物治療 傳統化學藥物治療目的在於導致細胞性毒害，以阻止癌細胞生長，通常 是直接對抗癌細胞增殖之代謝機制。一般臨床治療癌症會先以外科手術切除 及放射治療，之後再以化學藥物減少並控制殘餘在體內的癌細胞數目。然 而，化療藥物針對所有在進行複製中的細胞，對癌細胞並不具有專一性，所 以正常人體快速合成的細胞也會遭受藥物攻擊，而產生癌症惡病質 (Cachexia)。例如:口腔黏膜、骨髓、腸胃黏膜及毛囊細胞等，造成骨髓造 血系統功能下降、免疫系統失調、口炎、嘔吐、掉髮、對心臟、腎臟產生毒 性等嚴重的副作用。並且長期服用低劑量藥劑會使腫瘤細胞受到篩選，而產 生對藥物的抗藥性 (Drug resistance)。所以在惡性腫瘤的病人身上，化療藥 物只能使病情控制，並延長患者的生命。臨床上常見以合併用藥 (Combinations of drugs) 來減低單一藥物濃度，以減緩化療副作用，並避免 抗藥性發生。 許多種類的化學治療藥物對口腔癌有部份的效果，有效的化學治療藥物 包含了抗代謝類（anti metabolites） （例如：methotrexate，5-Fu， Gemcitabine） ；含鉑類（例如：cisplatin，carboplatin） ；alkylating agents （例如：ifosfamide） ；taxane 類（例如 paclitaxel，docetaxel） ；Bleomycin； Vinblastine；Vinorelbine…等(表三) 。 綜合多個研究系列顯示：手術前或手術後的化學治療可能可以減少部分 遠隔轉移，增加少許病人的存活。但是對於頭頸癌而言，局部控制是最重要 的；目前有研究發現放射合併化學治療對於晚期頭頸癌 (第三、四期)，可. 12.
(23) 增加局部控制率、顯著增加病人的存活率 [5]。單一藥物化學治療的反應率 大約在20～40%之間，其中絕大部份都只有部分反應（partial response） ，而 中位存活期大約6個月。合併數種藥物組合的化學治療可以提高反應率大約 達到50%～70%左右，中位存活期卻沒有多大的改變，但是藥物的副作用與毒 性相對也比較大。常用於口腔癌治療的藥物有 Cisplatin ，5-FU及Bleomycin [7]。. 4. 口腔癌的標靶治療. 傳統化療藥物會對全身快速生長的細胞造成毒殺作用，不僅殺死癌細 胞，更是對身體造成了嚴重的副作用。因此，相對於化療藥物，標靶藥物就 像能瞄準目標的導彈一般，直接對準癌細胞進行作用，一個理想的分子標靶 應有下列特點：（1）大多數癌細胞有此標靶且大量表現，（2）與癌症的致 病機轉相關，（3）與癌細胞的生存功能有關，（4）其功能對正常細胞則非 必要或較少表現，（5）此分子標靶在腫瘤中少有變異性或突變率低，（6） 不易由細胞表面脫落或分泌。 在標靶治療還沒有發展出來前，醫界只能判別腫瘤的期別，並無法依個 人體質、癌症指標給予不同的治療方式。未來透過監測腫瘤標記於血清濃度 高低，以及病理切片，免疫組織化學染色（IHC staining） ，判斷腫瘤抗原表 現，作為腫瘤生物標記；使醫師在選擇傳統化療藥物或標靶藥物時，做為參 考，以便更能對症下藥，並達到＂個人化癌症治療 ＂，首次開啟癌症小分 子 標 靶 藥 物 先 例 ， 是 在 1999 年 針 對 慢 性 病 骨 髓 性 白 血 病 藥 物 基立克 13.
(24) (Glivec) 。之後，各類標靶藥物的研發更加迅速，目前主要的方向有三；第 一，能專一辨識癌細胞表面抗原的單株抗體 (Monoclonal antibody) ，送入 體內對抗癌細胞增生，如 Herceptin 對 Her-2/neu 的結合，能夠阻斷乳癌 細胞的訊息傳遞，造成癌細胞死亡；第二，阻斷癌細胞訊息傳遞路徑的 kinase inhibitor，如 艾瑞莎 (Iressa) 阻斷 EGFR 細胞內側磷酸化；第三，抑制腫 瘤血管新生作 (Angiogenesis) ，對於已經轉移的癌細胞有明顯的抑制，如， 癌思停 (Avastin) 結合至人類血管內皮生長因子 (VEGF) ，而達到抑制腫 瘤血管新生作用 (表四) 。不僅如此，藥物標地設計也由單標靶邁向多標靶， 例如:新藥 Nexavar 能夠同時阻斷細胞分裂與血管新生。其他如中研院院長 翁啟惠團隊開發的醣脂抗癌新藥，以細胞上的醣脂類結構為作用標地；以及 能夠提升體內免疫系統對抗癌細胞，並減低許多副作用和抗藥性的免疫療 法，也是研究人員邁進的方向之ㄧ。在臨床上，合併使用化療藥物加上新型 標靶藥物，是近來癌症治療的新概念 [8]，或者同時使用兩種以上的標靶藥 物治療，以 EGFR/Her-2 inhibitor 治療乳癌病患為例 [9]。 在最近從 2008 年 Head & Neck 期刊發表一篇文章，是關於頭頸部癌 症的標靶藥物使用。標靶藥物對於頭頸部並口腔癌相關的癌症治療上，目前 還是比較少被注意。但在一些研究中已發現針對 EGFR 的 tyrosine kinase 抑制劑 (Iressa)，在細胞實驗能有效抑制口腔癌細胞生長，還能增加放射線 治療的效果 [10]。 Erbitux（又 Cetuximab）是一種標靶治療藥物 (EGFR) ， 而最近研究發現此藥物在臨床上不僅能使用於大腸直腸癌患者，也能延長鱗 狀細胞頭頸癌病患生命，發表的研究報告指出對進行性的鱗狀細胞頭頸癌，. 14.
(25) Erbitux 合併放射線治療比只有進行放射線治療存活期從 29.3 個月延長到 49 個月。近來亦有以 P-glycoprotein 為口腔癌細胞的藥物標地 [11]。另外研 究發現，使用 celecoxic (COX-2；Selective inhibitor) 能夠提升 HSC-2 細 胞對於放射線的敏感性 [10]。. 15.
(26) 表三、 化療藥物分類 分類. 一般化療藥物可分大約可分為六大類 [1]. 常見藥物 1Cytarabine Fludarabine. 抗代謝物藥劑. 5-Fluorouracil. (antimetabolites). 6-Mercaptopurine Methotrexate 6-Thioguanine. 作用機轉 抑制 DNA 或 RNA 合成中所需要 的 Purine 或 Purimidine 之前驅物 的合成，或是與它們互相競爭。 對於細胞週期中的 S 期最具專一 性。. Bleomycin. 抗生素 (antibiotics). Dactinomycin Daunorubicin Doxorubicin Idarubicin. 與 DNA 作用而破壞 DNA 功能。 屬於細胞週期專一性(cell-cycle specific). Palicamycin Carmustine &iomustine. 烷基化劑. Cyclophosphamide & Ifosfamide. (alkylating agents). Mechlorethamine. 將 DNA 烷基化(-CH3)而造成細 胞毒殺作用. Streptozotocin. 微管體抑制劑 (microtubule inhibitors). Navelbine Palitaxel(Taxol) Vinblastine Vincristine. 藉由影響細胞有絲分裂期間之微 小管(microtubule)聚合而 造成細胞死亡。. Aminoglutethimides Estrogens. 激素類 (hormones). Flutamide Goserelin Leuprolide Prednisone. 對 於類 固醇荷 爾蒙 敏感的 癌 細 胞，使用專一性荷爾蒙後會使癌 細胞退化。若是荷爾蒙依賴型， 移除其刺激則引起癌細胞退化. Tamoxifen Ciplatin 進入細胞內與 DNA N7 之 guanine 結合，抑制 DNA 及 RNA. 其他. Cisplatin & Carboplatin. 合成，以 G1 及 S 期的細胞最易. Etoposide(vp-16). 受 到傷 害。Etoposide 與 DNA topoisomeraseII 結合，造成 DNA 不可回復的斷裂，阻斷 S-G2 期。. 16.
(27) 表四、 標靶藥物分類 [12] 藥名. 作用標地. 適用癌症. Erbitux (爾必得舒). EGFR. 大腸直腸癌、鱗狀細胞頭頸癌. Panitumum-ab. EGFR. 大腸直腸癌. Her2/neu. 乳癌、卵巢癌. B 細胞上 CD2 表面抗原. 非何杰金氏淋巴癌. Avastin(癌思停). VEGF(anti-angiogenesis). 轉移型大腸直腸癌. Mylotarg(滅髓瘤). CD33 表面抗原. 急性骨髓性白血病. Tarceva(得舒緩). EGFR(細胞內側磷酸化). 非小細胞肺癌、胰臟癌. EGFR(細胞內側磷酸化). 非小細胞肺癌、肺腺癌. Herceptin(賀癌平) MabThera(莫須癌). Iressa(艾瑞莎) Nexavar(蕾莎瓦). Sutent(紓 癌 特 ). Glivec(基立克). 分類. 單 株 抗 體. 酪 胺 酸 激 酶 抑 制 劑. PDGRF-ß、KIT 和 FLT-3 VEGFR、PDGFR 、KIT, FLT3, colony-stimulating factor 1 (CSF-1), and RET 佔據 Bcr-Abl TK 上 ATP 的結合 位置. 移轉性腎細胞癌、末期肝癌病患、 乳癌、大腸癌、肺癌、黑色素瘤、以及麟狀. 慢性骨隨性白血病 腸胃道基質瘤. 位置. 蛋 白 解 體 抑 制 劑. 腎細胞癌、肝癌. 細胞癌. 佔據 Bcr-Abl TK 上 ATP 的結合. Tasigna(泰息安). Velcade(萬科). RAF、VEGFR-2, VEGRF-3. 慢性骨隨性白血病. 抑制 26S proteasome 的 chymotrypsin site 干擾 NF-kappa B 的活化 （proteasome inhibitor）. 17. 多發性骨髓癌.
(28) 第二節 癌症基因治療 ( Cancer Gene Therapy ) 人體內的去氧核醣核酸 (DNA) 帶著遺傳密碼。某些特定片段的 DNA 決 定了人類的遺傳特徵和身體功能，例如髮色、身高、智力、心臟是否健全等。 這些特定片段的 DNA 稱為基因 (Gene) 。基因攜帶的遺傳訊息控制細胞蛋 白質、激素、受體等的生產和作用。有很多疾病，是因為遺傳到缺陷的基因 或是基因產生突變，致使蛋白質、激素、受體等的生產和調控出差錯。藉由 將完整正常的基因引入病人適當的細胞內，讓正常基因取代缺陷基因的功 能，來治療病人的症狀，稱為基因治療 (Gene therapy) 。不過因為人類基 因表現和調控非常複雜，科學家尚無法完全明白，再加上將基因引入人體內 使之穩定表現的技術還不算完全成熟，因此過去的基因治療成果失敗者眾。. 1980 年代，French 等人用以治療＂嚴重複合性免疫缺陷症＂，這是一 種由於腺苷酸脫月安酶 (ADA) 的失常而造成 T 和 B 細胞死亡，也因而帶領 了一股基因治療的風潮。有的學者希望基因治療能應用在癌症上，但癌症發 生是多基因的失控，因此治療效果不彰。基因治療 (Gene therapy) 主要以 單 一 基 因 變 異 疾 病 為 治 療 對 象 。 然 而 ， 1999 年 賓 州 大 學 以 腺 病 毒 （Adenovirus）載體進行臨床實驗，造成一名少年死亡。基因治療從此蒙上 一層陰影。2008 年，研究人員於<新英格蘭醫學雜誌>發表在臨床上治療 6 名患有（Leber‘s congenital amaurosis）的病人接受了基因療法的試驗治 療，其中 4 人視力有明顯改善。此案例為基因治療 (Gene therapy) 帶來新 的曙光 [13, 14]。然而，在基因載體（Gene vector)的使用與開發上，仍有 許多發展空間 (表五、表六)。. 18.
(29) 美國國家衛生院 (National Institutes of Health) 下屬國家癌症研究中心 (National Cancer Institute)的 Steven Rosenberg 的團隊，於 2006 年在科學 雜誌(Science)上發表利用免疫療法成功抑制黑色素瘤 (melanoma) 癌症。 Rosenberg 團隊主要是利用基因工程方式來修改淋巴細胞。利用反轉錄病毒 當載體 (retrovirus)，將 T 細胞受器 (T cell receptor ; TCR) 的基因轉植至 周邊血液的淋巴細胞，因著 TCR 能夠辨識腫瘤組織表面上的抗原，所以基 因轉植後的淋巴細胞能夠辨識黑色素瘤上抗原，並破壞癌細胞生長。他們已 經能利用相同的技術，製造能辨識其他癌症的 T 細胞，包含半數目前已知 的癌症都能利用這項技術來產生 T 細胞進行基因治療。這是基因治療應用 於免疫療法的例子。不過此方法有其限制，因為並不是每一個癌細胞都會表 現特定的表面抗原，修改過的 T 細胞將無法發覺沒有表現癌細胞表面抗原的 突變癌細胞 [15]。. 目前，核醣核酸干擾現象 (RNA interference, RNAi)是在基因治療中的 另外一項突破，可大規模篩選所有疾病相關的基因，改進以往缺乏對疾病多 種基因調控的認知，所造成的治療失敗 [16]。. 19.
(30) 第三節 慢病毒載體之基因轉移 ( Lentivirus mediated gene transfer ) 在基因治療基因送入活體中主要有三種方式 (表五):純化 DNA 後利 用基因槍 (Gene gun) 將 DNA 送入特定的部位，或是直接注射 DNA，但 效果不彰。後來研發出的病毒載體 (Virus vector) 能有效率的將基因送入目 的地，並長時間產生基因沉默，常見的有 Retrovirus (反轉錄病毒)、 Adenovirus (腺病毒)、還有反轉錄病毒的一種 Lentivirus (慢病毒)。製備 病毒載體時必須將其致病的序列剔除，但仍有其風險存在。反轉錄病毒只能 感染分裂中的細胞(mitotic cell)；腺病毒能感染分裂中的細胞或非分裂中的 細胞 (Non-mitotic cell)如:幹細胞 (stem cell) ，但由於大部分的人都感染過 腺病毒，導致以腺病毒為載體時，體內會有免疫反應的情況發生。並且因著 之前的意外事故發生，現在此病毒載體已較少使用 (表六) 。之後研發出的 微脂質體 (Liposome) 能改善轉染的毒性問題，為目前常見的轉染載體，但 其轉染效率並沒有病毒載體高。 表五、 基因載體分類. Virus vectors. Non-viral vectors. Gene Transfer & Vector ‧ high efficient ‧ toxic risk (ex.Retrovirus,Adenovirus,Lentivirus…) Naked DNA ‧ purified DNA( ex. VEGF) ‧ gene gun Liposome ‧ control toxicity ‧ lower efficient than virus ‧ lower intergretion. 20.
(31) 病毒載體 現今基因治療中的基因轉移工具多採用病毒載體，大約分為三大類: 腺 病毒相關病毒 (Adeno-associated virus) 、腺病毒 (Adenovirus)、反轉錄 病毒 (Retrovirus)。以下是它們作為載體的優缺點比較:. 表六、 病毒載體分類 Adenoassociated virus 分類. AAV. DNA 或 RNA 病毒. ssDNA. 基因容量 (kb). < 4.7. 染色體鑲嵌性. No (Yes?) *. Adenoviral. Retroviral. (腺病毒). (反轉錄病毒). Adeno (1st & 2nd gen.). dsDNA ~ 8.3﹢ No. Adeno (Gutless). (無腸腺病毒) dsDNA 27-29. Lenti. Onco. (慢病毒) RNA. RNA. ~ 7.5 - 9﹢. ~ 7.5﹢. No. Yes. Yes. 是否感染 Yes. Yes. Yes. Yes. No. Long. Short. Long. Long. Long. 非分裂中細胞 作用表現的時間 是否引起身體 免疫反應. No. Yes. Yes. No. No. Yes. Yes. Yes. No‡. No. (毒殺型 T 細胞 反應) 一般人有感染 過? 安全性考量. Insertional mutagenesis?. Inflammation cytotoxicity. 21. Insertional mutagenesis.
(32) 慢病毒載體 不是每一種細胞都以傳統轉染 (Transfection) 進行 DNA 轉植，其在細 胞內與動物體中產生之影響 ( 例如，基因沉默作用)，常常在細胞實驗為有 明顯效果，但在動物中則不然，並且有某些特定的細胞轉染效果不彰。本篇 實驗所用的慢病毒載體，是反轉錄病毒之ㄧ員，有許多良好載體特點；它不 僅能感染分裂中或非分裂的細胞，並且能感染的細胞種類多元，轉染效率 高，適用於動物活體中及分化過程中的細胞，如幹細胞。2003 年，Douglas A.等人利用慢病毒載體的 RNAi 技術觀察哺乳類細胞、幹細胞、與基因轉殖 小鼠的功能性基因 [16]。圖六為其感染細胞的過程 (圖六)。. 圖六、慢病毒感染細胞過程. 22.
(33) 第四節 核醣核酸干擾現象 ( RNA interference, RNAi ) RNAi 簡介 RNA 干擾 (RNA interference，縮寫為 RNAi) 是指一種分子生物學上 由雙股 RNA 誘發的基因沉默現象。當細胞中導入與內源性 mRNA 編碼區 同源的雙股 RNA 時，該 mRNA 發生降解而導致基因表達沉默。RNAi 現象 在生物中普遍存在， RNAi 與轉錄後基因沉默 (post-transcriptional gene silencing and transgene silencing) 在分子層面上證實是同一種現象。 RNA 干擾現象是 1990 年由 R. Jorgensen 研究小組在研對花青素合成 速度的影響時，為得到顏色更深的矮牽牛花而過量表達查爾酮合成酶 (Chalcone synthase)，結果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽牛花，此外， 他們發現轉植了過量查爾酮合成酶基因的矮牽牛花，其查爾酮合成酶的濃度 比正常矮牽牛花中的濃度反而低 50 倍。因而推測外源轉入的編碼查爾酮合 成酶的基因同時抑制了花中內源查爾酮合成酶基因的表達 [17]。1992 年， Romano 和 Macino 也在粗糙鏈孢霉中發現了外源導入基因可以抑制具有同 源序列的內源基因的表達 [18]。1995 年，Guo 和 Kemphues 在線蟲中也發 現 了 RNAi 現 象 [19] 。 1998 年 ， Andrew Z. Fire 等 在 秀 麗 隱 桿 線 蟲 （C.elegans）中進行反股 RNA 抑制實驗時發現，作為對照加入的雙股 RNA 相比正股或反股 RNA 顯示出了更強的抑制效果，並將種現象命名為 RNA 干擾 [20]。2006 年， Andrew Z. Fire 與 Craig C. Mello 由於在 RNAi 機制 研究中的貢獻獲得諾貝爾生理及醫學獎。 而最早研究證明確認 RNAi 的作用機轉是需要經過四個步驟，乃是藉 由果蠅胚胎細胞 (S2 cells) 所得到的生化實驗研究結果。它的反應起始步驟 23.
(34) 是 ATP-dependent ， 經 由 dicer (RNase III family of dsRNA-specific endonucleases) 將 長 片 段 的 dsRNA 剪 成 小 片 段 (21-25 nucleotide) 的 dsRNA 稱為 siRNAs (small interfering RNAs)。而這些 siRNA duplexs 隨後 與一些目前尚未確定與 RNAi 有關的一些 protein complex 結合在一起。接 著這個 siRNA duplex 經由 ATP-dependent 進行 remodeling 解開整個纏繞 結構，形成 active RNA-induced silencing complex (RISC)，最後可能需要 少量的 ATP 幫助下，active RISC 可以辨認及切割 target RNA 將 specific target gene 以”Knockdown”. [20] (圖七)。. 圖七、RNA interference 運作機轉. 24. [21].
(35) 另有研究發現，RNAi 現象在人體中內生性 (endogenous) 的發生，而 調控体內的生理現象者，同樣為 21-25 nt 片段，稱之為微小型 RNA (micro RNA, miRNA)，與外源性 siRNA 不同的是，miRNA 藉由結合 mRNA 的 3`UTR，或者藉由阻止蛋白合成 (Translational repression)，而造成基因沉 默現象；而一般的 siRNA 是與 mRNA 產生完美性結合 (perfect match) 造 成 mRNA 的降解 [22, 23] (見 表七)。在植物與線蟲 (nematoges) 的研究 中發現 RNAi 具有傳遞性。細胞內 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) 會藉由原本的 siRNA 當作引子 (Primer)，合成出新的 siRNA，作用類似 PCR 放大效應；或者可能直接由 RdRP 合成新的 siRNA 片段，造成 mRNA 的降解。並且，這樣的 siRNA 會在 2~5 個細胞之間傳遞，或者有更遠距離 的傳遞效果 (圖八) [22]。此外在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）上實驗時還可 使子一代產生基因突變。. 圖八、RNAi 的放大及傳遞作用 [22]. 25.
(36) 表七、 各種 RNAi 的比較 [22, 23] RNAi 比較. 作用機轉. siRNA (small interfering RNA). Ds-RNA 藉由 (cholesterol、liposome、 antibody) 送入細胞的 Cytosol 中 Æ Dicer 切成 21-23 的片段. 結合位置 轉染效率. Perfect match. Transeint 效率較低. Æ Risc 結合 Æ 降解 mRNA. 外 源 性 Ds-RNA (設計在 plasmid DNA 中). shRNA (short hairpinRNA). 藉由 virus vector 送至細胞的 Nucleus 中 Æ RNA Pol III 進行 transcription Æ 至 Cytosol Æ Dicer 切成 21-23 的片段 Æ Risc 結合. Perfect match 或 3’ UTR. Æ 降解 mRNA. 細胞內自身合成. miRNA (microRNA). 內 在 Nucleus 中 生 Æ RNA Pol II 進行 transcription 性 Æ 至 Cytosol Æ Dicer 切成 21-23 的片段 Æ Risc 結合 Æ 降解 mRNA (或是直接抑制蛋白質合成). 26. 3’ UTR. Stable 效率較高.
(37) 在 2002 年研究發現， RNAi 現象不僅發生在 post-transcriptional 層 次 ， 由 Dicer 切 割 後 的 siRNA 會 與 RNA-induced initiation of gene silencing (RITS) complex 結合，在染色體上進行 RNA transcript 降解作用， 稱之為 Epigenetic silencing (圖九)。此外，還有研究發現，siRNA 參與 DNA 的甲基化作用 (methylation) [24]。. 圖九、RNAi 作用於染色體上 [24]. 27.
(38) RNAi 之載體設計. 根據 RNAi 的作用特性，科學家們可以針對特定標記基因設計 shRNA (見表七)，藉由病毒感染作用 (Virus infection) ，將建構好的 shRNA 載體 直接送入細胞核內，由 RNA polymerase III 合成 shRNA，送至細胞質中。 或者是可以直接合成標地基因的 siRNA ，由轉染作用 (Transfection) 直接 將 ds-RNA 送入細胞的 Cytosol 中，藉 Dicer 切成 21-23 的片段，再與 Risc 結合，至終達到降解 mRNA，產生特定基因的沉默現象。. siRNA 使用載體較多樣化: 有結合在 Cholesterol (膽固醇)上，也有與抗 體結合，較常見的試用 liposome (微脂質體)。而 shRNA 則以病毒載體為 主。而動物實驗中，則以載體結合好的 siRNA 或 shRNA 在定位注射，或 者在小鼠的尾巴靜脈注射之(圖十)。 圖十、RNAi 載體使用分類 [25]. 28.
(39) 在早期的分子生物學家對於研究蛋白的生物功能之最常見的方法，是利 用突變技術將該基因進行突變，再觀察該基因的突變表現型 (mutant phenotype) 對生物個體的影響，此技術稱為 forward genetics. (Silva et. al., 2004)。但是這項技術耗時且不具成本效益，故隨著 1998 年線蟲基因體 計畫 (C. elegans genome project) 的完成後，科學家便積極的開發找尋一 些快速及有效率的方法來進行大規模基因體 (Large-scale genome) 的研 究。在國內，中央研究院於 2004 年代表臺灣加入美國麻省理工學院/哈佛 大學的 Broad 研究所發起的核醣核酸干擾聯盟國際合作計畫 (TRC) (圖十 一)。至 2011 年前台灣可從此聯盟獲得（一）可沉默人類及老鼠各 16,000 基因的 shRNA RNAi 試劑庫 (10 shRNAs/ gene)； （二）獲得全部 shRNA RNAi 試劑庫之 knockdown 資料庫。圖十二為 TRC 設計的 shRNA 載體 (圖 十二)。 圖十一、RNAi collection 的策略聯盟 [26]. 29.
(40) 圖十二、TRC 設計的 shRNA 載體及序列 [27]. 30.
(41) RNAi 的應用 RNAi 可用來作為疾病治療的方式之ㄧ，有越來越多的研究證實 RNAi 作為基因療法的潛力。主要應用在 (1.) 癌症、(2.) 病毒感染性疾病、以及 (3.) 基因突變相關疾病、(4.) 大規模致病基因的篩選 [28, 29]。不過，在許 多研究中發現， RNAi在細胞轉染過程中有偏離標地反應 ( Off-target effect) [30, 31]，可能是內生性 miRNA 所造成的影響，所以在同一種基因的 siRNA 設計上，一般會有2~5個針對同樣基因但序列些許不同的 siRNA ， 從中選擇基因抑制率最高的作為實驗的序列。另外，siRNA 轉染至活體中， 會有誘發干擾素 ( Interferon；IFN) 所產生的免疫反應；設計小於30個核苷 酸長度的 siRNA 序列，可避免誘導此免疫反應的發生 [30]。 已報導的RNAi應用如下:. 1. 設計抑制B型肝炎病毒的shRNA 在2003年，學者 McCaffrey, A.P. 等人設計針對人類B型肝炎病毒 ( Hepatitis B virus；HBV )表面抗原的 shRNA 。細胞實驗中人類B型肝炎 病毒表面抗原 ( HBV surface antigen；HBsAg ) 有94.2%的抑制率；而在 動物實驗中，血清中的 HBsAg 有84.5%的抑制率。之後，從小鼠肝臟組織 切片作組織免疫螢光染色 ( Immunohistochemistry ) ，發現大於99% HBsAg 被抑制 [32]。. 31.
(42) 2. 設計抑制呼吸道感染之病毒的 siRNA 在 2005 年，學者 Bitko, V. 等人設計針對兩種呼吸道感染病毒 (Respiratory syncytial virus；RSV 和 parainfluenza virus；PIV ) 的 siRNA 序列。這兩種病毒於當時並無適當的疫苗或抗病毒藥物，研究發現經 siRNA 處理的細胞比起未加 siRNA 的控制組細胞，其 RSV 與 PIV 有明顯的下 降；動物實驗亦有類似的結果 [33]。. 3. 設計抑制神經性退化疾病 ALS 突變基因 SOD1 的 shRNA Ralph,G.S.等人，於 2005 年發表的研究成果。乃針對神經性退化疾病 ALS 突變基因 SOD1 設計 shRNA 。在 ALS 小鼠模式實驗中，注入能夠 抑制突變基因 SOD1 之 shRNA 的小鼠的存活率大於控制組的小鼠。並且 從小鼠腦幹與脊髓之組織染色切片後發現，注入抑制突變基因 SOD1 之 shRNA 的小鼠，其神經元的正常型態及存活率大於控制組小鼠 [34]。. 4. RNAi 方式大規模篩選致病基因 在 2005 年 Jeffrey 等人用 RNAi 方式大量篩選 Hela cell 中的蛋白質激 酶與蛋白質磷酸水解酶基因，(650 個蛋白質激酶，222 個蛋白質磷酸水解 酶)，得到了一些新的細胞凋亡調控蛋白質；在他們的實驗中發現了具有化 療抗藥性的基因；另外，他們利用篩選出來能夠抑制癌細胞生長基因的序 列，與低劑量化療藥物合併使用後，產生藥物協同作用，可以促使 Hela cell 發生細胞凋亡的現象 [35]。在 2007 年 Susan E.等人，同樣用 RNAi 方式 篩選 3700 個基因於三種不同的癌細胞株: H1299 (肺癌細胞)、MDA-MB-468. 32.
(43) (乳癌細胞)、 DLD (直腸癌細胞)的影響。發現了三個基因 (Ran,TPX2,SCD1) 可以作為癌細胞的生物標記 [36]。 Moffat,J. 團隊於 2006 年發表利用 shRNA 來篩選調控癌細胞的基因的研究成果。他們利用核醣核酸干擾聯盟 國際合作計畫 (TRC)所合成 5000 個慢病毒載體的 shRNA 序列 (針對 1028 個基因)，轉至 HEK293T 細胞株內，篩選出 100 多個調控細胞分裂的基因 [37]。. 33.
(44) 第五節 實驗目的 ( Experimented Aim ). 隨著分子生物研究的進步，越來越多疾病的探討已朝向基因體層次發 展， 以找出真正的致病機轉，癌症也不例外。由於癌症是由許多基因的突 變產生的，且具有高度生長及變異性，為臨床醫學治療上的一大難題，現有 傳統的化學治療已經無法應付。雖說癌症在臨床上的藥物治療，已逐漸進入 標靶藥物的時代，但現今在藥物的開發與使用上，仍處於萌芽階段，只有少 數幾種藥物在臨床上被使用。. 近十年來，藉由分子生物方法，找出各種癌細胞的作用機轉，進而研發 出許多針對癌細胞分子標地的藥物。大部份研究乃是針對乳癌、肝癌、肺癌， 在口腔癌方面系統性的研究尚處於萌芽階段。在 2004 年，學者 Warner,G.C 等人利用 cDNA microarray 方式，找到口腔癌轉移相關蛋白質 CLDN1 [38] 。之後在 2006 年，學者 Lo,W-Y 等人蛋白質體學方法，藉由正常檢體 與癌症檢體的蛋白質二維電泳膠的分析比較後，找到幾個在口腔癌中過度表 現的蛋白質，作為生物標記；再利用 LC-MS/MS 分析其蛋白質的胺基酸序 列。其中 Vimentin、Tropomyosin2、MnSOD、HSP27 等蛋白質被發現有 過度表現的現象 [39]。 2008 年，學者 P Holfman 等人，利用 Tissue microarray 的方式，找到 actin-binding Src substrate - Cortactin 作為頭頸 癌的臨床生物標記 [40]。. 由於目前國人口腔癌的罹患率有節節升高的趨勢，但對於口腔癌的分子 機轉及生物指標並無全面性的研究，因此本研究乃由中央研究院國家基因體. 34.
(45) 中心 RNAi 核心設施 (National RNAi core facility)購入敏感性干擾性核糖核 酸庫 (sensitized RNAi library)，以大規模的 RNAi 技術篩選口腔癌的特異 性基因。本研究總共使用 6502 個 shRNA clone constructs 的部份 shRNA 慢病毒 (Lentivirus) 載體，乃針對有 1236 個基因所設計；包括 737 是蛋白 質激酶、 209 蛋白質磷酸水解酶 和 30 基因有雙重功能 (表八)。偵測各個 shRNA 對癌細胞生長的影響。再藉由生物資訊軟體 GeneGo 分析篩選可能 的致病基因間的相互關係與訊息傳遞路徑。我們認為本研究將有助於早期診 斷口腔癌的檢測試劑的開發，或是發展出更多對抗此標的分子 (Therapeutic targets) 的標靶藥物。. 表八、1236 個 shRNA 基因分類 Gene number. Percentage. Kinase. 737. 59.63%. Phosphatase. 209. 16.91%. Kinase & Phosphatase. 30. 2.43%. 976. 78.96%. Transcription factor. 37. 2.99%. Tumor suppressor. 16. 1.29%. Transcription factor & Tumor suppressor. 15. 1.21%. 68. 5.50%. None. 64. 5.18%. Others. 128. 10.36%. Total. 1236. 100.00%. Gene Category. Subtotal. Subtotal. 35.
(46) 第二章 實驗材料及方法 ( Materials and Methods ) 第一節 實驗流程（Experimented flow chart）. 實驗流程圖. [26]. Virus titer 定量測試 ( 找出適合 HSC-3 的條件). 6502 個 shRNA 大規模篩選 ( 71 個 96 孔盤含 shRNA 序列的慢病毒 載體之感染實驗). 基因分類整理 (找出大於 90%抑制細胞生長率的 shRNA 株及其標靶的基因). 分子路徑分析應用軟體 (. Gene Go 36. ).
(47) 第二節 實驗材料 ( Material ) 細胞株 (cell line) HSC-3 為一惡性度高的舌癌細胞，從高雄醫學院獲得，以 DMEM/F12 培養 液含 10% FBS (Hycolne) 培養。細胞培養箱的溫度為 37℃，CO2 濃度為 5%。 慢病毒載體結構；(圖十三). (中央研究院 RNAi 核心設施提供). 37.
(48) 第三節 病毒力價實驗 ( Virus tittering ) 實驗目的 病毒對於每種細胞株有不同的感染力，為了使用最適合的病毒劑量，可 藉由不同濃度的 shLuc 慢病毒感染細胞後，藉由細胞存活率試驗，作出一標 準曲線。以算出病毒相對定量的單位 (R.I.U.)，再經由公式計算，可得知實 驗中病毒感染的最佳劑量。 實驗材料 1.. HSC-3 細胞. 2.. shLuc VSV-G 假型慢病毒(Pseudotype Lentivirus). 3.. 細胞培養液 DMEM/F12 培養液含 10% FBS (Hycolne). 4.. Polybrene. 5.. Puromycin. 6.. CCK-8 試劑. 7.. P2 級實驗室 (由 14F 中國醫藥大學醫技系 提供). 實驗流程 將 3000 顆 HSC-3 細胞種至 96 孔盤中，以 DMEM/F12 培養液含 10% FBS (Hycolne) 置於恆溫培養箱一天；24 小時後，將 shLuc 慢病毒原液以 培養液兩倍稀釋成不同濃度 ( 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 ；μL / 5 μL)， 如下表所列。. 38.
(49) 將細胞培養液加入polybrene (陽離子聚合物，增加細胞轉染效率)，濃 度分別用5 μg/mL與10 μg/mL，以得到較佳病毒感染實驗條件。之後，將原 來細胞培養液換成含有 polybrene 的培養液，再依序將剛剛稀釋好的病毒 液加入96 孔盤中。24小時後，換成含有 puromycin 的細胞培養液，濃度 分別用5 μg/mL與10 μg/mL，篩選轉染成功的細胞。(shLuc慢病毒載體序 列帶有 anti-puromycin 的基因，所以加入 puromycin 後仍能繼續生長；未 轉染成功的細胞，在含 puromycin 的培養液中則會死亡)。48小時後，加入 細胞存活率檢測試劑 CCK-8 (10 μL)。 CCK-8為一 tetrazolium salt 與活細 胞內的 dehydrogenase 作用後，產生黃色的 formazan 物質，顏色越深表 示活的細胞數越多。作用3小時後，用 ELISA reader 於波長nm 450條件 下，分析細胞的存活率。用Excel畫出病毒濃度與細胞存活率的標準曲線， 比較不同試劑條件的轉染效率，並計算出HSC-3的病毒相對定量單位 (R.I.U.)。 (詳細步驟流程請參閱 National RNAi core facility, TRC protocol). 實驗步驟 1. 將 3000 顆 HSC-3 種於 96 孔盤(含 100 μL 之 DMEM/F12+10% FBS 培養液)，置於細胞培養箱。 2. 24小時後,將原來的細胞培養液換成45 μL含10 μg/ml polybrene 或含 5 μg/ml polybrene的細胞培養液，置於細胞培養箱。 3. 稀釋病毒原液(shLuc VSV-G 假型慢病毒，1.8 x 104 R.I.U/μl、4 μL/ 5 μL；中央研究院 RNAi 核心設施)；成不同濃度( 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125,. 39.
(50) 0.0625 μL/ 5 μL)。依序將稀釋好的病毒加 5 μL 於 96 孔盤中，置於細 胞培養箱。 4. 24小時後，取出細胞培養液並用DPBS（100 μL）清洗殘餘的病毒，置 換成含有puromycin的培養液100 μL ( 5 μg/mL或10 μg/mL) ，置於細胞 培養箱。 5. 48小時後，加入CCK-8試劑（10 μL） ，置放於細胞培養箱3小時後，以 ELISA reader 在波長450 nm 條件下，測量吸光值並分析細胞的存活 率。 6. 用Excel 軟體畫出病毒濃度與細胞存活率的標準曲線，比較不同試劑條 件的轉染效率，並計算出HSC-3的病毒相對定量單位 (R.I.U.) (參考下列 公式)。. 病毒相對定量單位(R.I.U.)的計算 從中央研究院 RNAi 核心設施所訂購的 71 盤 shRNA 慢病毒的病毒濃度 是已知，乃是以 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值 (relative infection unit)。R.I.U 是計算病毒感染細胞的相對定量單位。但是因為同一種病毒感 染不同的細胞株，所需的單位劑量皆有所不同，所以我們利用下面的公式， 將 71 盤 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值，轉換成 HSC-3 細胞株的 R.I.U 值，使病毒感染實驗的劑量使用更加準確。先從 HSC-3 的病毒力價實驗中 所測得的標準曲線中，在線性的範圍中選擇病毒體積為 1 μL 時，所對應的 細胞存活率(例如:為 46.51%)，算出 HSC-3 control virus (shLuc) R.I.U，再 利用 71 盤 A549 細胞株測試的平均的 R.I.U.值，轉換成 HSC-3 細胞株的 R.I.U 值，詳細步驟如下： 40.
(51) 病毒相對定量單位 (R.I.U.) 的計算公式:. 1. 計算 HSC-3的 control virus (shLuc) R.I.U (46.51% 細胞存活率x 3000細胞數) / 1μL(病毒體積) = 1395.3 R.I.U./ μL. 2. 轉換 A549的R.I.U值成HSC-3的R.I.U.值. R.I.UN = R.I.UO × (R.I.Uremeasured / R.I.Ustandard) N = New (實驗細胞的R.I.U.值) O = 中研院用A549測出的平均R.I.U值 remeasured = 利用shLuc病毒力價實驗測得HSC-3的R.I.U. standard = 中研院提供的shLuc病毒標準劑量(1.8x104 R.I.U./ μL) 舉例說明: 中研院提供我們KP001盤的A549平均R.I.U = 5513 R.I.U./ μL R.I.UN= 5513 X (1395.3 / 1.8 X 104) = 427.38 R.I.U/μL 3. M.O.I 的建議使用值為2~3，我們取M.O.I = 3 (M.O.I, the multiplicity of infection；病毒感染劑量，指感染一個細胞所需的病毒量；M.O.I = 3表示感染一 顆細胞需要三個病毒)。 KP001 盤= (3000 cells x 3) / 427.38 = 21.06 μL 所以，我們之後利用此公式，算出每一盤的使用體積，詳見表九。. 41.
(52) 表九、 71 盤病毒使用量 KP no. 平均 RIU. KP1. KP2. KP3. KP4. KP5. KP6. KP7. 5513. 7149. 13085. 6957. 8943. 12882. 10619. RIU. 427.38. 554.17. 1014.32. 539.25. 693.27. 998.60. 823.15. uI(MOI=3). 21.06. 16.24. 8.87. 16.69. 12.98. 9.01. 10.93. KP no.. KP11. KP12. KP13. KP14. KP15. KP16. 平均 RIU. 10988. 18170. 8909. 12718. 9921. 6399. RIU. 851.76. 1408.48. 690.58. 985.87. 769.06. 496.01. uI(MOI=3). 10.57. 6.39. 13.03. 9.13. 11.70. 18.14. KP no.. KP21. KP22. KP23. KP24. 平均 RIU. 10662. 12303. RIU. 826.51. 953.70. uI(MOI=3). 10.89. 9.44. 7.19. 5.84. KP32. KP33. KP34. KP no. 平均 RIU. RIU uI(MOI=3). KP no. 平均 RIU. RIU uI(MOI=3). KP no. 平均 RIU. RIU uI(MOI=3. KP no.. KP31 17904. 1387.82 1513.19. uI(MOI=3). 11.00. KP35. KP44. KP45. 6.86. KP18. KP19. KP20. 13975. KP27. KP28. KP29. KP30. 17581. 18140. 21586. 18832. 6.40. 5.38. 6.17. KP36. KP37. KP38. KP39. KP40. KP46 17771. 16754. 17166. 6.76. 6.56. 7.00. KP47. KP48. KP49. KP50. 1031.05. 15749. 6.07. 7.59. 9.22. 8.73. 7.48. 6.53. 7.37. KP51. KP52. KP53. KP54. KP55. KP56. KP57. 15264. 12727. 17213. 986.59. 1334.32. 7.61. 9.12. 6.74. KP58. KP59. KP60. 1203.30 1377.52 1220.81 1183.23. 1054.32 1462.09. 16652. 7.02. 976.15. 18862. 17692. 1281.75 1330.62 1371.40 1285.94. 1185.88. 13601. 13024. 8.91. 1481.82. 14606. 13725. 8.46. 13301. 1348.47 1464.23 1374.58 1132.18. 6.78. 8.31. 12593. 17733. 8.93. 8.65. 15298. 18889. 1008.02 1328.33 1312.61. 1040.94 1083.26 1063.94 1009.59. 19116. 17396. 15523. 16933. 6.60. 15.66. KP43. 17136. KP10. 6.59. 574.84. KP42. 13429. 13004. KP9. 1365.82 1362.79 1406.17 1673.25 1459.82. 933.28. KP41. 11848. 15154. 14151. 12847. 918.38. 1174.71. 1096.93. 995.82. 6.67. 6.15. 6.55. 7.95. 8.54. 6.16. 9.80. 7.66. 8.20. 9.04. KP61. KP62. KP63. KP64. KP65. KP66. KP67. KP68. KP69. KP70. 907.82. RIU. 818.51. 17620. 7580. 9.64. RIU. 平均 RIU. 10559. KP26. 12040. 5.95. 23877. KP no.. 19878. 1252.11 1540.85. 6.48. 平均 RIU. uI(MOI=3). 19521. 16153. KP25. KP17. KP8. 19947. 18416. 1538.26 1419.99 1538.57. 9.91. 5.85. 6.34. KP71. KP72. KP73. 19017. 12716. 1462.34 1002.90 6.15. 19983. 8.97. 13908. 19553. 20334. 18477. 18435. 21457. 1091.94 1515.35 1578.06 1423.59 1422.76 1647.94. 5.85. 8.24. 18781 983.78 9.15 42. 5.94. 5.70. 6.32. 6.33. 5.46.
(53) 第四節 shRNA 的大規模轉染實驗 ( Lentivirus-based shRNA screening ) 實驗目的 以慢病毒 (lentivirus) 為載體的 RNAi 篩選平台，進行全面性分析調控 人類口腔癌細胞的生長與凋亡的特異性蛋白質基因，總共使用 6502 個 shRNA 序列個標靶 1236 個基因，其中 737 個是蛋白質激酶、209 個蛋白質 磷酸水解酶、30 個雙重功能的基因。 實驗材料 1. HSC-3 細胞 2. KP001~073 (共 71 盤 shRNA 慢病毒，於-80℃冰箱保存) 3. 含 10% FBS (Hycolne)之 DMEM/F12 細胞培養液 4. Polybrene（10 μg/ml ） 5. Puromycin（5 μg/ml） 6. CCK-8 試劑 7. P2 級實驗室 (14F 中國醫藥大學醫技系 提供). 實驗流程 根據前述之 shLuc 病毒力價實驗，我們得知 shLuc 病毒劑量，並計算求 得各盤之病毒 RIU 值。以及最佳病毒感染實驗條件為（3000 顆 HSC-3 細 胞、polybrene 10 μg/ml 、puromycin 5 μg/ml）。類似於前述之病毒力價實 驗步驟，將 3000 顆 HSC-3 細胞種入含 100 μL DMEM /F12 /10% FBS 培養 液之 96 孔盤中，置於恆溫培養箱一天；24 小時後，換掉原來的培養液，加 43.
(54) 入 100 μL 含 polybrene（10 μg/ml ）的培養液後，加入剛解凍的 shRNA 慢病毒載體（MOI=3，參考表九所計算出每盤應加的病毒體積） ，每次約處 理 5 盤病毒二重覆實驗。24 小時後，去除細胞培養液並用 DPBS（100 μL） 清洗殘餘的病毒，置換成含有 puromycin（濃度 5 μg/mL）的培養液 100 μL 以篩選轉染成功的細胞。48 小時後，加入細胞存活率檢測試劑 CCK-8 (10 μL)。反應 3 小時後，用 ELISA reader 測量 OD450，分析細胞的存活率。實 驗結果以 Excel 檔分析整理。. 實驗步驟 1. 將 3000 顆 HSC-3 種於 96 孔盤(培養液 DMEM/F12+10% FBS 100 μL)， 置於細胞培養箱。 2. 24小時後,將原來的細胞培養液換成100 μL含10 μg/ml polybrene 的細胞培養液，置於細胞培養箱。 3. 解凍 96 孔盤中的 shRNA 慢病毒載體；每次約處理 5 盤(二重覆)， （每盤 取量之病毒體積請參考表九），以 pipette 混合均勻，置於細胞培養箱。 4. 24小時後，取出細胞培養液並用DPBS（100 μL）清洗殘餘的病毒，置 換成含有濃度puromycin（5 μg/mL）的培養液100 μL，置於細胞培養箱。 5. 48小時後，加入CCK-8試劑（10 μL） ，以pipette混合均勻後，置放於細 胞培養箱3小時。以ELISA reader 在波長450nm條件下，測量吸光值並， 分析細胞的存活率。 6. 用Excel整理細胞存活率資料。. 44.
(55) 第五節 生物資訊軟體 GeneGo 分析（Bioinformatics Analysis-GeneGO） GeneGO 簡介（網址：portal.genego.com） 隨著基因體學及蛋白質體學的發展，有越來越多龐大的數據需要分析， 生物資訊分析軟體如雨後春筍不斷推陳出新。GeneGo 是付費線上軟體，其 分析資料方便又快速，將相關的資料及基因名稱輸入 Excel 檔，上傳後，軟 體可推測可能的分子機轉，並統計分析最有可能的分子作用路徑，還可以比 較不同實驗數據的相關性，這對於分析大規模篩選工作的研究人員，無疑是 一大福音。 實驗流程 1. 以 Shortest Path 分析可能的分子傳遞路徑。軟體將上傳的資料自動延伸 2~3 個推估的相關基因，經過人為的判斷後，保留與癌症關聯性較高的 連結基因，作為初步的分子路徑推測。 2. 以 GeneGo Pathway Maps 評估上傳的資料，出現在那一種已知的分子 路徑中，我們可以從圖中了解基因在分子路徑中扮演的角色。軟體能分 析數據中的基因大部分參與那些分子路徑，並加以統計分析並列出順 位，我們可以藉此進一步判斷篩選的 51 個基因在 HSC-3 細胞中的分子 傳遞路徑。 3. 以 GeneGo Pathway Map Folders 分析基因的功能性。軟體將先前分析 所有基因參與的分子傳遞路徑，以統計分析預測大部分的路徑所參與的 生理功能並列出順位。藉此進一步判斷所篩選的基因影響細胞那些功能。. 45.
(56) 第三章 實驗結果 (Results) 1.. 病毒力價實驗 ( Virus tittering ). 由於 shLuc lentivirus 含有篩選用的 puromycin resistance gene (附 錄一)，可使成功感染病毒的細胞在 puromycin 篩選後存活。由初步的 control virus (shLuc VSV-G pseudovirus )之感染實驗得知較佳實驗條件為 3000 顆 HSC-3 細胞、polybrene 10 μg/ml 、puromycin 5 μg/ml。根據此 條件，進行病毒力價實驗，分析結果數據，得到口腔癌細胞株 HSC-3 細胞 存活率以及 shLuc lentivirus 之 virus titer 的關係圖 (圖十五) ，由此可求 得感染HSC-3 的病毒使用劑量及感染成功率之間的比例。將 450 nm 所測 得的 O.D. 值和加入的 virus 體積以線性回歸分析 R2 = 0.998 (圖十六)。 Virus stock (μl). O.D.450. Viability. 4. 0.458. 100.00%. 2. 0.43566667. 95.12%. 1. 0.213. 46.51%. 0.5. 0.10033333. 21.91%. 0.25. 0.06566667. 14.34%. 0.125. 0.019. 4.15%. 0.0625. 0.016. 3.49%. 0. 0.003. 0.66%. 取線性部分的病毒濃度為1 μL / 5 μL時，對應於Y軸的細胞存活率為 46.51%。由此可求得KP001~KP073中每盤要加的病毒體積，計算公式如下:. 1. (46.51% 細胞存活率x 3000細胞數) / 1 μL (病毒體積) = 1395.3 R.I.U./ μL 2. KP001 之 R.I.UN = 5513 X (1395.3 / 1.8 X 104) = 427.38 R.I.U / μL ( 說明: 5513是 RNAi core 提供之KP001盤的相對病毒(力價)濃度) 46.
(57) 3. 當細胞之 MOI = 3 時，用KP001盤病毒感染細胞所需要的病毒溶液體積為: (3000 cells x 3) / 427.38 = 21.06 μL (M.O.I=3). 此乃以 KP001 盤作為說明，其餘各盤欲使用病毒體積，以相同方式計算可 得知。所得到各盤之 VSV-G pseudotyped lentivirus 感染 HSC-3 的最適 當體積（詳見表九）。. 2. 1236個shRNA基因篩選流程 篩選數據整理過程如下，以KP-001盤說明:. 依照 MOI = 3 時，各盤病毒應使用的體積量來感染HSC-3細胞 1 天，經 puromycin處理 2 天後，分析細胞之存活率，下表乃是以ELISA reader (450 nm) 讀取細胞存活率試驗結果(二重覆實驗). KP-001-1. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. A. 0.153. 0.15. 1.024. 0.152. 0.153. 0.666. 0.84. 0.665. 1.131. 0.827. 0.496. 0.178. B. 0.689. 0.759. 0.164. 0.69. 1.131. 0.97. 0.829. 0.944. 0.929. 0.173. 0.526. 0.374. C. 0.837. 0.161. 0.756. 0.745. 0.833. 0.859. 0.89. 1.276. 1.133. 0.154. 0.462. 0.361. D. 1.025. 0.836. 0.177. 0.691. 0.554. 0.456. 0.574. 0.74. 0.755. 1.21. 0.9. 0.518. E. 0.568. 0.9. 0.79. 1.077. 0.931. 0.71. 0.834. 0.574. 1.386. 0.975. 0.664. 0.756. F. 0.451. 0.483. 0.895. 0.986. 0.62. 0.943. 0.582. 0.713. 0.679. 0.754. 0.548. 0.564. G. 0.495. 0.343. 0.303. 0.479. 0.867. 0.397. 0.327. 0.541. 0.741. 0.953. 0.565. 0.148. H. 0.156. 0.585. 0.692. 0.265. 0.648. 0.656. 1.394. 1.246. 0.759. 0.916. 0.148. 0.148. 47.
(58) KP-001-2. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. A. 0.141. 0.152. 0.981. 0.152. 0.16. 0.398. 0.782. 0.675. 0.964. 0.923. 0.276. 0.181. B. 0.598. 1.496. 0.698. 0.901. 0.75. 0.79. 0.777. 0.903. 1.388. 0.176. 0.437. 0.578. C. 0.642. 0.165. 1.745. 1.12. 0.804. 0.612. 0.768. 0.57. 0.796. 0.154. 0.375. 0.515. D. 0.802. 0.898. 0.181. 0.839. 0.534. 0.498. 0.731. 0.776. 0.719. 0.7. 0.744. 0.657. E. 0.588. 0.855. 0.841. 0.946. 0.868. 0.622. 0.94. 0.839. 0.587. 0.764. 0.577. 0.865. F. 0.372. 0.451. 0.814. 1.02. 0.73. 0.98. 1.034. 0.832. 0.806. 0.816. 0.596. 0.56. G. 0.309. 0.366. 0.35. 0.498. 0.742. 0.46. 0.422. 0.593. 0.574. 0.807. 0.672. 0.151. H. 0.142. 1.339. 0.968. 0.318. 0.596. 0.756. 1.505. 1.415. 0.828. 0.774. 0.152. 0.15. 求二重覆實驗結果平均值，如下表: mean. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. A. 0.15. 0.15. 1.00. 0.15. 0.16. 0.53. 0.81. 0.67. 1.05. 0.88. 0.39. 0.18. B. 0.64. 1.13. 0.43. 0.80. 0.94. 0.88. 0.80. 0.92. 1.16. 0.17. 0.48. 0.48. C. 0.74. 0.16. 1.25. 0.93. 0.82. 0.74. 0.83. 0.92. 0.96. 0.15. 0.42. 0.44. D. 0.91. 0.87. 0.18. 0.77. 0.54. 0.48. 0.65. 0.76. 0.74. 0.96. 0.82. 0.59. E. 0.58. 0.88. 0.82. 1.01. 0.90. 0.67. 0.89. 0.71. 0.99. 0.87. 0.62. 0.81. F. 0.41. 0.47. 0.85. 1.00. 0.68. 0.96. 0.81. 0.77. 0.74. 0.79. 0.57. 0.56. G. 0.40. 0.35. 0.33. 0.49. 0.80. 0.43. 0.37. 0.57. 0.66. 0.88. 0.62. 0.15. H. 0.15. 0.96. 0.83. 0.29. 0.62. 0.71. 1.45. 1.33. 0.79. 0.85. 0.15. 0.15. 0.82. 0.15. 黃色部份: 控制組病毒 shLuc，所帶的 shRNA 不影響細胞 mRNA 的運作。將 兩個數據平均後，得到O.D = 0.82。 橘色部份: Blank 值(不含細胞，只有細胞培養液)，平均值為0.15. 48.
(59) 將平均結果換算成細胞存活率及生長抑制百分比 細胞存活率% = (平均吸光值 - Blank 值) / (控制組病毒shLuc吸光值 - Blank 值) 生長抑制率% = 1 - 細胞存活率%. Viability. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. A. 0%. 0%. 127%. 0%. 1%. 57%. 98%. 77%. 134%. 108%. 35%. 4%. B. 73%. 146%. 42%. 96%. 118%. 109%. 97%. 115%. 150%. 3%. 49%. 48%. C. 88%. 2%. 164%. 116%. 99%. 87%. 101%. 115%. 121%. 0%. 40%. 43%. D. 114%. 107%. 4%. 91%. 58%. 48%. 75%. 90%. 87%. 120%. 100%. 65%. E. 63%. 108%. 99%. 128%. 111%. 77%. 110%. 83%. 124%. 107%. 70%. 98%. F. 39%. 47%. 105%. 127%. 78%. 121%. 98%. 93%. 88%. 94%. 63%. 61%. G. 37%. 30%. 26%. 50%. 97%. 41%. 33%. 62%. 75%. 109%. 70%. 0%. H. 0%. 121%. 101%. 21%. 70%. 83%. 194%. 176%. 96%. 103%. 0%. 0%. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Growth inhibition. 1. A. 100% 99%. -27%. 99%. 98%. 42%. 1%. 22%. -34%. -8%. 64%. 95%. B. 26%. -46%. 57%. 3%. -18%. -9%. 2%. -15%. -50%. 96%. 50%. 51%. C. 11%. 97%. -64%. -16%. 0%. 12%. -1%. -15%. -21%. 99%. 59%. 56%. D. -14%. -7%. 95%. 8%. 41%. 51%. 24%. 9%. 12%. -20%. -0%. 34%. E. 36%. -8%. 0%. -28%. -11%. 22%. -10%. 16%. -24%. -7%. 29%. 1%. F. 60%. 52%. -5%. -27%. 21%. -21%. 1%. 6%. 11%. 5%. 36%. 38%. G. 62%. 69%. 73%. 49%. 2%. 58%. 66%. 37%. 24%. -9%. 29%. 100%. H. 100% -21%. -1%. 78%. 29%. 16%. -94%. -76%. 3%. -3%. 99%. 100%. 49.
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