新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）之流程設立

初次實驗設計流程如下，將微粒子與bio-DNA、蛋白質、一級抗體、二 級抗體依序作接合

其結果如圖四，顯示不論在bio-DNA 是否存在的情況下，只要在加入 細胞核蛋白的實驗組中，其relative total mean 均會躍升，表示蛋白質或抗 體均會與微粒子形成非專一性的鍵結

2. 流程設立-2

於前次實驗結果顯示，微粒子與蛋白質間的非專一性鍵結會導致假陽 性的結果，因此在此階段作兩個部分的流程修飾，

（1）先加入 PEG 與 BSA buffer 與微粒子混合作為微粒子之前處理

（blocking）

（2）改變實驗流程如下：

分析結果如圖五，散點圖於圖七表示，相較於沒有PEG blocking 的組別，

在PEG blocking 的實驗組別中，其實驗組與負向控制組（只有加入蛋白質 而無bio-DNA）之間的差別度明顯，顯示 PEG 可有效達到 blocking 的效果，

降低蛋白質與微粒子間的非專一性鍵結。

3. 流程設立-3

經由流程設立-2，雖可明顯降低非專一性鍵結導致的假陽性結果，然而，

經過幾次獨立的實驗後，卻發現這樣的系統相當的不穩定，因此參考ELISA 的步驟，作兩步驟的修正

（1） 在每一次鍵結完成後，加入 wash buffer（0.02% Tween-20/PBS）混勻，

離心後棄置上清液。

（2） 更動實驗流程如下：

實驗結果圖六顯示，雖然lane I（microsphere alone）、lane II

（microsphere+bio-DNA）和 lane III（實驗組別）的差別度縮小，但加入特 異性競爭核酸片段的組別，其值明顯降低，而加入沒有結合序列的競爭核 酸片段其值沒有差異，顯示實驗組別的螢光程度上升是因為目標轉錄因子 的特異結合導致。

圖四、流程設立-1

將微粒子依序加入 bio-DNA（HBS）、細胞核蛋白（A431 cell nuclear

extract）、一級抗體（mouse anti human HIF-1α antibody）、二級抗體

（goat anti mouse IgG conjugate FITC antibody），每段間隔時間為 1 小時，最後以轉速 10,000rpm 離心 30 分鐘，丟棄上清液後，以 500μl BSA buffer 重新懸浮後，以流式細胞儀分析。

圖五、流程設立-2

先將bio-DNA（HBS）與細胞核蛋白（A431 cell nuclear extract）混和，依 序加入一級抗體、二級抗體，再與已blocking 完成的微粒子混和 15 分鐘，

接著以轉速10,000rpm 離心 30 分鐘後，棄置上清液，以 BSA buffer 重新懸 浮，以流式細胞儀分析。實驗分為兩組，一為微粒子與PEG 作 blocking，

另一為單獨只與BSA buffer 作 blocking 的比較組。

圖六、流程設立-3

將bio-DNA（*HBS）與細胞核蛋白（A431 nuclear extract）作用之後（相對 於bio-DNA 100 倍之競爭核酸片段亦於此步驟同時加入），與 blocking 完成 的微粒子作接合，再依序加入一級抗體、二級抗體，在每一次的接合反應 之後，先加入wash buffer 將微粒子懸浮並以轉速 10,000rpm 離心 5 分鐘，

丟棄上清液後，再加入後續的抗體溶液，最後以500μl BSA buffer 懸浮後，

以流式細胞儀分析。

★：具p<0.05 之顯著性差異