MIA-TF 於流式細胞儀之散點圖

圖七為微粒子經處理之後的散點圖，第一行之散點圖表示微粒子之大 小及顆粒性（SSC vs FSC），第二行散點圖表示 R1 區塊內之微粒子所帶綠 色螢光亮度（FSC vs FL1）。作分析圖則比較 R2 區塊內的相對 total mean

（events×mean）。由（a）和（b）的比較可得知，blocking 的程序會改變微 粒子的大小及顆粒性，若再加入bio-DNA 和抗體（d），會在第一行的圖中 的右上方多出一群顆粒，隨著加入蛋白量的增加，飄移的顆粒數會增加

（e），加入核蛋白之後會在偏右上方在出現微弱的一群顆粒（f），作圖分析 時將R1 縮小至往右上方散出去的顆粒，且不包含最左下方的顆粒群（g）

（h），於 FSC vs FL1 圈選 R2，計算 relative total mean 為分析數值。

（a）

（b）

（c）

（d）

（e）

（f）

（g）

（h）

圖七、MIA-TF 於流式細胞儀之散點圖

（a）微粒子經 PBS 靜置 30 分鐘、（b）微粒子先經 PEG 反應 30 分鐘，

再加入 BSA buffer 靜置 30 分鐘、(c)為（b）接續與抗體反應、（d）為

（b）加入 bio-DNA 之後與抗體反應、（e）為（b）加入 bio-DNA 和純 蛋白之後，與抗體反應、（f）為（b）加入 bio-DNA 和細胞核蛋白之後，

與抗體反應、（g）為（d）分析數據時圈選表示圖、（h）為（f）分析數 據時圈選表示圖,流式細胞儀之電壓條件（detector/Voltage/Amp

Gain/Mode）：FSC/E01/7.00/Lin、SSC/545/1.00/Lin、FL1/999/9.99/Lin

第二節 新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）檢測細胞內轉 錄因子之變化

6.2.1 MIA-TF 應用於 NF-κB 核蛋白之檢測

為了檢測 MIA-TF 是否有其普遍通用性，因此使用含 NF-κB 結合序列 的bio-DNA 做為材料（NBS），抗體也改變為對應該轉錄因子之抗體。其結 果如圖八，加入蛋白質的lane III 與未加蛋白質的 lane II 有顯著差異，並在 加入競爭核酸片段後，將其值明顯的降低（lane IV），然而加入非特異性競 爭核酸片段（lane V）並沒有造成影響，顯示螢光程度的改變來自於 NF-κB 特異性的結合上核酸片段。本實驗顯示在更換不同的bio-DNA 後，配合上 相對應的抗體，也能夠確切的偵測到目標轉錄因子，確立了MIA-TF 之普 遍通用性。

6.2.2 MIA-TF 測量 NF-κB p50 純蛋白之靈敏度

確立了 MIA-TF 可應用於轉錄因子偵測之後，我們利用 recombinant human NF-κB p50（R&D systems）測試此方法之靈敏度。

結果顯示此系統可偵測純轉錄因子蛋白之靈敏度最低可至0.5ng 而具有顯 著差異性（圖九）。

6.2.3 MIA-TF 測量細胞核蛋白內特定轉錄因子之靈敏度

得知 MIA-TF 測量純轉錄因子蛋白量之靈敏度後，因為檢測時是利用 細胞核蛋白作為材料，我們進一步測量此方法應用於細胞核蛋白檢測量時 的靈敏度。此部分實驗分別以HIF-1 與 NF-κB 作為目標轉錄因子，檢測其 靈敏度（圖十、圖十一）。由數據可知，此方法能檢測最低細胞核蛋白量為 50ng，最高可至 2000ng，但 1000ng~2000ng 之間的差距不大，顯示如此量 的微粒子適合檢測細胞核蛋白的濃度範圍為50ng~1000ng。

圖八、MIA-TF 應用於 NF-κB 核蛋白之檢測

於MIA-TF 實驗中，使用 NBS 來抓取細胞核蛋白（HeLa cell nuclear extract）

中NF-κB 轉錄因子，並在競爭組別分別加入 cNBS 和沒有特異結合序列的 VP16 為控制組，一級抗體為 rabbit anti human NF-κB p50 monoclonal antibody，二級抗體為 mouse anti rabbit IgG conjugate FITC antibody。

★：具p<0.05 之顯著性差異

圖九、MIA-TF 測量 NF-κB p50 純蛋白之靈敏度

於MIA-TF 實驗中，使用 NBS 抓取 recombinant human NFκB p50 轉錄因子，

於實驗組別內分別加入0.1ng~40ng 不等的 NF-κB p50 純蛋白

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十、MIA-TF 測量核蛋白內 HIF-1 之靈敏度

在MIA-TF 實驗中，使用 HBS 作為 bio-DNA 來測量正常培養之 HeLa cell 內含HIF-1 之活化量，以 extraction buffer 將細胞核蛋白調整至

50ng~2000ng/reaction

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十一、MIA-TF 測量核蛋白內 NF-κB 之靈敏度

在MIA-TF 實驗中，使用 NBS 作為 bio-DNA 測量正常培養之 HeLa cell 內 含NF-κB 之活化量，以 extraction buffer 將細胞核蛋白調整至 50ng~2000ng

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

6.2.4 活體外細胞毒殺測試

為了測量細胞所能承受最高藥物濃度，我們採用 MTT 細胞增殖及毒性 檢測實驗來得出細胞對藥物濃度的存活曲線。檢測DFO 或 HQ 對 HeLa cell 的存活影響（圖十二、圖十三）。由圖十二發現，DFO 對 HeLa cell 並無顯 著毒殺效應，因此我們取濃度100μM 作為後續實驗參考之用；由圖十三可 看出HeLa cell 對 HQ 所能承受最高濃度而不傷害細胞為 50μM，因此在後 續實驗中我們使用25μM 濃度之 HQ 刺激細胞。

0.00%

0.00%

0.0090 0.0647 0.0290 0.0342 0.0621 0.0324 0.0040 0.0072

Hydroquinone(uM)

survival

圖十三、HeLa cell 於 HQ 刺激下之細胞存活曲線

Seeding 2*10⁴個細胞於96 孔盤中後 8 小時，以 DMEM 培養液對

hydroquinone 做 1.56μM-100μM 之序列稀釋，將含有藥物之新鮮培養液換掉 舊有培養液，再培養16 小時後，以內含 500μg/ml MTT 之培養液更換原培 養液，靜置2 小時後，以針頭小心將上清液吸掉，加入 100μl DMSO 溶解 結晶，再觀察595nm 下的吸光值

6.2.5 檢測細胞於特效藥刺激下致使核內轉錄因子濃度變化

MIA-TF 的開發目的是為了可以直接測量細胞於各種環境下之轉錄因 子變化，因此我們於培養細胞時，加入目標轉錄因子的作用藥物，再用 MIA-TF 加以偵測目標轉錄因子的濃度變化。 圖十四為 HeLa cell 對 HIF-1 的活化劑DFO 所呈現的細胞核內活化量變化，可見 HIF-1 的活化量隨著 DFO 的刺激而上升。圖十五為 HeLa cell 對 NF-κB 的抑制藥物 HQ，也可確 實的偵測到NF-κB 的活化量隨著 HQ 的增加而相對被抑制

圖十四、MIA-TF 偵測 HeLa cell 於 DFO 刺激下之 HIF-1 活性變化

於24 孔盤每孔 seeding HeLa cell 10⁵個，待八小時後加入 DFO，培養 16 小 時後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量蛋白濃度後，以extraction buffer 將核蛋白調整至每個反應加入200ng，以 MIA-TF 配合 HBS 檢測

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane III）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十五、MIA-TF 偵測 HeLa cell 於 HQ 刺激下之 NF-κB 活性變化

於24 孔盤每孔 seeding HeLa cell 10⁵個，待八小時後加入HQ，培養 16 小時 後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量蛋白濃度後，以extraction buffer 將 核蛋白調整至每個反應加入800ng，以 MIA-TF 配合 NBS 檢測

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane III）具 p<0.05 之顯著性差異

第三節 HIF-1α ELISA

為了與 MIA-TF 互相比較，我們採用市售 HIF-1α ELISA 套組測量 HeLa cell 於 DFO 刺激下之轉錄因子活性變化。圖十六顯示：隨著 DFO 的濃度上 升，HeLa cell 內的 HIF-1 活化量顯著性上升，然而在競爭反應中，卻沒有 明顯的競爭效果。

圖十六、ELISA 檢測 HeLa cell 於 DFO 刺激下之 HIF-1 活性變化

於6 孔盤每孔 seeding HeLa cell 5*10⁵個，待八小時後加入DFO，培養 16 小時後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量濃度後，以ELISA 套組所附標 準流程偵測，每個反應加入的核蛋白量為30μg，競爭組為 DFO 濃度為 0μM 組別的控制組

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane I）比較具 p<0.05 之顯著性差異

第四節 報導基因活性分析

偵測轉錄因子之另一常用方法為報導基因活性分析，為了可與MIA-TF 互相比較，我們構築出一可反應HIF-1 活性表現的報導基因活性分析系統，

將得到的質體轉染入細胞後，使用DFO 作用轉染細胞，接下來使用流式細 胞儀分析，將細胞螢光量數值化，再加以比較HIF-1 之活性。

6.4.1 HBS（HIF-binding site）報導基因質體之構築 1. 基因選殖

XbaI (16) XbaI (825)

在pCRII-C2-9 之 7XHBS 片段後產生切位 約800bp 的位置（圖十八），約等於 hrGFP 的片段長度（831bp），因此 大致可確定片段確實有接入質體內。

3. 以限制脢 BamHI 確定接入片段為順向或反相

因為使用同一切位將hrGFP 片段接入 pCRII-C2-9 內，因此接入的 片段可能為順向或反相接入，此時利用限制脢BamHI 做切割，則可依 出現片段大小判斷接入片段的正反，如圖十九表示：若接入片段為順 向，則切割出片段大小應為4676bp + 367bp（圖十九、a），若為反相，

則切割出片段大小應為3901bp+1142bp（圖十九、b）。我們選擇菌液PCR 實驗中編號3、6、9 之組別做限制脢切割，其結果顯示所選取組別的切 割片段皆出現在大約300bp 和 400bp 的位置（圖二十一），因此可判斷 這三組所接入片段皆為順向，選擇編號第9 作為後續實驗之用。

4. 以細胞轉染方式確知 hrGFP 是否具有功能

因為接入片段hrGFP 為 PCR 增幅複製出之產物，有可能會有突變 造成報導基因失去功能，因此我們利用細胞轉染來直接測知該hrGFP 片段接入質體後是否仍具有報導基因的功能。其結果顯示：當於細胞內 轉染入pCRII-C2-9-hrGFP 之後，於螢光顯微鏡下可見細胞發出綠色螢 光（圖二十一、a），證實 hrGFP 報導基因於接入質體後仍具有功能。

（a） （b） （c）

I II I II

圖十七、基因選殖之插入片段及質體準備之電泳圖

（a）hrGFP 之 PCR 產物。使用引子 hr-GFP-5’、hr-GFP-3’自模版 pNFκB-hrGFP 增幅複製出；（b）hrGFP 片段經限制脢 XbaI 切割，

lane I 為未切割，lane II 為切割後產物；（c）pCRII-C2-9 經限制脢 XbaI 切割後之產物，lane I 為未切割，lane II 為切割後產物

I II III IV

圖十八、菌液PCR 之電泳圖

由黏合反應的產物，經過質體轉型至DH5α competent cell 後，培養 12-16 小時後，選取其中12 個菌落，加入 3ml 含 kanamycin 的 LB 培養液中培養 17-20 小時，接著選擇 0.1μl 菌液作為模版，使用引子 hr-GFP-5’和 hr-GFP-3’

作PCR 反應，每三組合為一管後，以洋菜膠電泳分析片段。

（a）

（b）

圖二十、pCRII-C2-9-hrGFP 之順接及反接可能質體圖示

因為接入hrGFP 使用兩端皆是 Xbal 切接位，因此接入時可能為正向或反 向，使用限制脢BamHI 切割後可判斷（a）順向接入、（b）反相接入

I II III IV V

VI

VII VIII

圖二十、pCRII-C2-9-hrGFP 經 BamHI 切割後之電泳圖

選擇菌液PCR 之 3,6,9 組，以小量分離法純化出質體後，分別以限制脢 BamHI 作切割，切割後產物以洋菜膠電泳分析片段

（a）

（b）

圖二十二、以細胞轉染方式測試pCRII-C2-9-hrGFP 的功能

選擇第九組產物作質體大量純化後，以lipofectamine 進行細胞轉染實驗，

使用細胞為Balb/3T3，seeding 5*10⁵個細胞於 6 孔盤中，待細胞長至七成滿 後（約12~16 小時）開始進行轉染。轉染進行後培養 24 小時照相（a）轉 染入pCRII-C2-9-hrGFP、（b）未加入質體，但仍有操作轉染程序

6.4.2 細胞於缺氧環境下之報導基因活性分析

將所選殖出之質體轉染入HeLa 細胞，使用不同濃度之 DFO 活化 HIF-1α，接下來以流式細胞儀分析細胞螢光量，並同時操作一組 ARE-hrGFP

將所選殖出之質體轉染入HeLa 細胞，使用不同濃度之 DFO 活化 HIF-1α，接下來以流式細胞儀分析細胞螢光量，並同時操作一組 ARE-hrGFP

在文檔中 建立新型微粒子免疫分析法以測定轉錄因子活性 (頁 63-0)