蛋白質濃度測定

第五章、材料與方法

5.1 新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）之材料取得與方法敘

5.1.4 蛋白質濃度測定

取一 96 孔盤，利用 PBS 將 BSA 由 2000ng/μl 做序列稀釋至 31.25ng/μl，

作為標準濃度曲線之用，每一孔加入10μl 樣品和 290μl coomassie Plus^TM protein assay reagent（PIERCE）（每一個樣品皆須做二重複實驗），等待作用時間20 分鐘後，以 ELISA reader 測定 595 nm 下之吸光值。取 BSA 各濃度 polyethylene glycol （PEG）（混合後最終 PEG 濃度為 25mM），於室溫下靜置30 分鐘，此時加入 BSA buffer（1% BSA / PBS）至體積增為 100nμl，

段），利用 extraction buffer 將最終體積調整為 30μl，於室溫下放置 30 分鐘，

便可加入10μl 處理完畢的微粒子，利用微量吸管混合後，室溫下緩和搖晃 15 分鐘，反應時間完畢後，每一個反應加入 500μl wash buffer（0.02%

Tween20/PBS）混合，放置轉速 10,000rpm 離心 5 分鐘，小心將上清液吸出丟棄（在吸取過程中動作過大可能會導致微粒子的pellet 漂起），之後加入以BSA buffer 稀釋至 2.5μg/ml（一般由原液稀釋 400 倍）的一級抗體溶液 40μl 將 pellet 重新懸浮，室溫下緩和搖晃 1 小時後，每一個反應加入 500μl wash buffer 混合，放置轉速 10,000rpm 離心 5 分鐘，小心將上清液吸出丟棄，

再加入400 倍稀釋的二級抗體溶液 40μl 將 pellet 懸浮，室溫下緩和搖晃 1 小時後，再以同樣步驟加入wash buffer 混合，放置轉速 10,000rpm 離心 5 分鐘，丟棄上清液後，以500μl BSA buffer 將 pellet 懸浮，即可上流式細胞儀分析。

*註：於 MIA-TF 實驗中，除了一開始需將微粒子原液震盪混勻，其餘步驟皆使用微量

吸管操作混合步驟

5.1.5 流式細胞儀操作分析

2. Detectors/Amps

Amp Gain

Param Detector Voltage Mode

P1 FSC E01 7.00 Lin

events*mean 為 total mean。數據分析圖如下頁所示。

4. 數據刪除原則

若計算出之 total mean 低於負向控制組，則判斷為接合動作失敗，

放棄此組實驗數值。

relative total mean =

04 . 190

* 178

06 . 151

*

931 第二節活體外細胞毒殺測試

我們利用MTT 的方法得出細胞對藥物濃度的存活曲線，取細胞所能承受藥物的最高濃度作為其他細胞實驗之用。

5.2.1. MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測（MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay ）

Seeding 細胞於 96 孔盤，每一孔加入 2*10⁴個細胞，八個小時之後換置內含序列稀釋藥劑的培養液，再培養16 小時之後，將細胞培養液吸出，重新加入100μl，內含濃度 500μg/ml MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo

(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide）的細胞培養液，置於室溫下 2 小時後，此時孔內底部會出現紫色結晶（formazan），將殘餘液體以針筒小心吸出，再加入100μl 的 DMSO（dimethyl sulfoxide）溶解紫色結晶，最後以 ELISA reader 觀測 595 nm 下的吸光值

5.2.2 數據分析

全部組別扣除盤子的背景值後，取培養液不含藥劑的樣品組為存活率 100%（positive control, PC ），其餘組數各除以 PC 的吸光值後，做出細胞毒殺曲線圖。

第三節報導基因活性分析（reporter gene activity assay）

此部分實驗主要在質體內HBS（HIF-binding site）序列後，構築一報導基因，將該質體經轉染入細胞後，觀察報導基因表現量即可反應HBS 的表現程度

5.3.1 HBS（HIF-binding site）報導基因質體之構築

於實驗室質體資料庫中，選擇pCRII 作為骨幹，並在其內接有七倍 HBS 片段的質體（見附錄三,pCRII-C2-9），需再將報導基因（選擇 hrGFP）自 pNFkB-hrGFP 質體（見附錄三,pNF-kB-hrGFP）上以 PCR 的方式增幅製造，

經限制脢於兩端製造切位後，接入pCRII 質體中的 HBS 後端，並以細胞轉染的方式測試接入的hrGFP 片段是否具有功能。

1. 嵌入序列（hrGFP）準備

使用順向引子（hrGFP-5'(XbaI)）、反向引子（hrGFP-3'(XbaI)），以PCR 的方式將hrGFP 自模版（pNFkB-hrGFP）中複製出來，其反應循環順序為 94℃ 30 秒，55℃ 30 秒（見表二），72℃增幅 2 分鐘，進行 34 個循環增幅，

最後以72℃ 5 分鐘將未完成之序列完成，將 PCR 產物以洋菜膠電泳確認片段並進行純化。

引子名稱序列

（℃）

hrGFP-3'(XbaI) aatct agagc gtccc gctca gaaga act 60 hrGFP-5'(XbaI) ctttc cgcgg agact ctaga 56

2. 限制脢切割

前述已準備好之質體（pCRII-C2-9）及嵌入片段（hrGFP）皆使用 Xbal 限制脢切割出相同切位，以便之後的ligation 進行，取一 0.5ml 微量離心管，

各加入1μg 之 DNA，50 mg/ml 之 BSA 0.2μl，2μl 之 10X buffer，再加入 1μl

（5U）之限制脢 Xbal，以二次水將反應總體積補足為 20μl，短暫離心後置於37℃水浴加熱器中放置隔夜，反應產物以洋菜膠體電泳進行分析。

3. hrGFP 片段黏合（ligation）

取一 0.6ml 的微量離心管，加入 10mM 的 ATP 1μl、10X T4 ligase buffer 1μl、T4 DNA ligase 1μl、及前述已準備好之質體及嵌入片段以 1：3 之比例置入，以二次水將總體積調整至10μl， 16℃放置隔夜進行 DNA 黏合反應。

5.3.2 質體轉形（transformation）

取出DNA 黏合後的產物約 3-5μl，加入預先置於冰上退冰的 competent cell 中（DH5α），用手指輕彈管壁使質體與細菌混合均勻，靜置於冰上 30 分鐘，而後將混合物置於42℃水浴加熱器中進行 Heat shock 30 秒，再置於冰上2 分鐘，然後加入質體與 250μl 之 LB 於 37℃震盪 1 小時，培養完畢之後。取出100μl 菌液均勻塗於含 Kanamycin 之 LB 培養基，於 37℃保溫器中培養17-20 小時。

5.3.3 菌液 PCR

挑單一菌落於3 ml 含 Kanamycin（30μg/ml）之 LB medium 中，置 37℃

震盪保溫器中進行震盪（200rpm），培養17-20 小時後收取菌液。取一 0.2ml 的微量離心管加入0.1μl 菌液做為模板，40.4μl 的二次蒸餾水，5ul 之 Taq buffer，1μl dNTP（10nmole），1μl 順向引子（hr GFP-5'(XbaI) 10μM），1μl 之反向引子（hrGFP-3'(XbaI) 10μM）及 0.5μl 之 Taq DNA polymerase，混和均勻後短暫離心，進行聚合脢連鎖反應，其反應循環為：94℃ 10 分鐘（用以打破細菌之細胞壁，使其基因外露），94℃ 1 分鐘，52℃ 30 秒，72℃增幅1.5 分鐘，進行 34 個循環增幅，最後以 72℃5 分鐘將未完成之序列完成。

完成之產物進行洋菜膠體電泳，在此進行聚合脢連鎖反應可幫助我們確認目標基因是否成功插入載體中。

5.3.4. 質體 DNA 之小量分離法

使用 Gene-spin^TM Miniprep purification kit

（Protech, Taiwan, ROC）

。取 2.5ml 培養 16 小時之菌液於 1.5ml 之微量離心管中，以轉速 13,000rpm 離心 1.5 分鐘，移除上清液後，以 200μl Solution I 懸浮沈澱之菌塊，再加入 200 μl Solution II ，翻轉微量離心管 6-8 次，而後置於室溫 5 分鐘，再加入 200μl Solution III，翻轉微量離心管 6-8 次，而後置於冰上作用 5 分鐘。以轉速 13,000rpm 離心 5 分鐘，將套組中所附的交體管柱安插入 1.5ml 之收集管中，

將離心所得之上清液小心加入管柱中，以轉速13,000rpm 離心 1 分鐘，將收集管中之廢液丟棄，再重新和膠體管柱組合。加入700μl 之 Wash solution，

以轉速13,000rpm 離心 1 分鐘，移除廢液後再將此膠體管柱與收集管之組合體，以轉速13,000rpm 離心 3 分鐘，將管柱中多餘水分一併移除。將膠體管柱移至一新的1.5ml 微量離心管中，加入 30μl 已事先預熱至 65℃之二次水，

以轉速13,000rpm 離心 1 分鐘，以溶解出質體 DNA，利用分光光度計測量 OD260 之吸光值，以推知其 DNA 濃度。此小量分離之質體 DNA 用以供後續限制脢切割確認及定序之用。

5.3.5 質體 DNA 之大量分離法（High-copy Plasmid Purification (PC 100)）

1. buffer 配製 a. Buffer S1

50mM Tris-CL, 10mM EDTA, 100μg/ml RNase A, pH8.0 b. Buffer S2

200mM NaOH, 1% SDS c. Buffer S3

2.8M KAc, pH5.1 d. Buffer N2

100M Tris, 15% ethanol, 900mM KCl, 0.15% Triton X-100, adjusted to pH6.3 with H₃PO₄

e. buffer N3

100mM Tris, 15% ethanol, 1.15M KCl, adjusted to pH6.3 with H₃PO₄ f. buffer N5

100mM Tris, 15% ethanol, 1M KCl, adjusted to pH8.5 with H₃PO₄

2. 操作

在LB 培養液中加入適當量細菌培養 12-16 小時，將菌液收至已滅過菌的離心瓶中，以轉速8,000 轉離心 15 分鐘，丟棄上清液，加入 4ml buffer S1

（已含RNase A），將 pellet 震盪打散，加入 4ml buffer S2，緩慢上下倒轉混

isopropanol，混合均勻後，以 15,000rpm 轉速離心 30 分鐘，丟棄上清液後，

加入1ml 70%的酒精，放置-20℃冰箱存放。使用前，先以 14,000rpm 轉速離心5 分鐘，將上清液充分去除後，加入適量二次水，以分光光度計測量

使用基因傳遞試劑為lipofectamin 2000（Invitrogen, California, United states），先將 3μg DNA 和 250μl opti-MEM 混合於玻璃管 A，另將 10μl

lipofectamin 和 250μl opti-MEM 混合於玻璃管 B，待五分鐘之後，將 A 管內混合液加入B 管內，靜置 20 分鐘；於 20 分鐘結束前，先將細胞的培養液丟棄，以PBS 潤洗細胞，先加入 200μl opti-MEM 於細胞上，再均勻滴入 B 管的混合液，隨即補入300μl opti-MEM，每孔最終總體積為 1ml，置於 37℃

培養箱中培養六小時後，加入2ml 培養液，再培養 18 小時後，使用 versine 將細胞懸浮，離心後重新seeding 至 24 孔盤（此步驟為消除各孔內細胞轉染的效率不同之疑慮），六小時之後，再加入不同濃度的藥劑，培養十六小時後，以EDTA-trypsin 收取細胞並離心，以 PBS 重新懸浮後，加入 5ng/ml 的PI，即可以流式細胞儀分析。

2. 數據分析

於 SSC vs.FSC 的散點圖中圈取細胞群落為 R1，再由R1 作另一FL3 vs FSC 的散點圖，圈取 FL3 吸光值較低的一群細胞視為活細胞為 R2，由 R2 作另一counts vs. FL1 的直方圖，取該圖的 total mean 值作為分析數據，Gate M1 則表示該實驗組轉染之效率。圖例如下頁所示，該實驗組之 mean 值則為108.3，所有實驗組數據除以負向控制組後作圖比較。

第四節酵素免疫吸附分析法（ELISA）

使用 DuoSet IC intracellular Human/mouse Active HIF-1α Activity Assay 套組（R&D systems, Minneapolis, United States）

5.4.1 96 孔盤之前處理

將Capture Antibody 以 PBS 稀釋至 4.0μg/ml 後，在 96 孔盤中每孔放入 100μl，在室溫下放置隔夜。倒掉液體之後，使用瓶子迅速將每孔倒滿 PBST

（0.05% Tween-20/PBS），再將盤孔朝下甩棄液體，重複三次之後，將液體甩乾，在乾淨的紙巾上用力拍打，直到孔內無殘留液體。每孔加入300μl reagent diluent（5% BSA/PBS），在室溫下放置 1-2 小時，重複 wash 的動作之後可準備加入樣品。

5.4.2 實驗流程

加入3μl biotin labeled ds Oligonucleaotide 至 10-100μg 的細胞核蛋白中

（於1.5ml 微量離心管中操作），以 extraction buffer 調整至最終體積為 30μl，於室溫下放置 30 分鐘（若為競爭試驗也於此步驟加入 3μl Unlabeled ds Oligonucleotide）。加入 200μl reagent diluent 於每一個樣品中，小心混勻，

分裝100μl 至準備好的 96 孔盤中（每個樣品為二重複），於室溫下放置 2 小時，重複前述wash 方法三次，於每孔加入 100μl 60 倍稀釋的

Streptavidin-HRP，於室溫下靜置 20 分鐘，再 wash 五次，加入 Substrate

Solution（實驗中使用 3,3',5,5'-.tetramethyl benzidine, TMB）100μl 呈色後，

加入50μl Stop solution（使用 1N HCl），以 ELISA reader 測量其於 450nm 下之吸光值。

第五節新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）應用於 96 孔盤

此部分實驗為直接將細胞 seeding 於 96 孔盤，可在盤內直接萃取細胞全蛋白，並同樣於96 孔盤內操作 MIA-TF

5.5.1 seeding cells

於 96 孔盤內 seeding 每孔 3500 個細胞，培養 24 小時

5.5.2 細胞全蛋白萃取

1. 細胞全蛋白萃取溶液（whole cell extraction buffer）配製

20mM HEPES (pH7.9)、20% (v/v) glycerol、1% (v/v) Nonidet P-40、1mM MgCl₂、0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM Phenylmethylsulfonyl Fluoride（PMSF）、1mM DTT、10% (v/v) Protease Inhibitor Cocktail、

2 細胞全蛋白萃取法

以100μl PBS 潤洗細胞，1,200 rpm 轉速離心 5 分鐘之後，去除上清液，

以EDTA trypsin 懸浮細胞後，再以 1,200 rpm 轉速離心 5 分鐘，去除上清液後，加入50μl whole cell extraction buffer，以微量吸管上下沖洗之後，靜置於冰上20 分鐘，再以 3700 rpm 轉速離心 5 分鐘，取上清液則為細胞全蛋白萃取。

5.5.3. 新型微粒子免疫分析法之修飾（modified-MIA-TF）

Tween-20/PBS）混合，放置離心機（轉子 Swing-bucket rotor A-2-DWP, eppendorf, Hamburg, Germany）轉速 3,500rpm 離心 5 分鐘，小心將上清液吸出丟棄，之後加入以BSA buffer（1% BSA/PBS）稀釋至 2.5μg/ml（一般由原液稀釋400 倍）的一級抗體溶液 40μl 將 pellet 重新懸浮，室溫下緩和搖晃1 小時後，每一個反應加入 200μl wash buffer 混合，放置轉速 3,500rpm 離心5 分鐘，小心將上清液吸出丟棄，再加入 400 倍稀釋的二級抗體溶液

在文檔中建立新型微粒子免疫分析法以測定轉錄因子活性 (頁 36-0)

第五章、 材料與方法