細胞全蛋白萃取 39

1. 細胞全蛋白萃取溶液（whole cell extraction buffer）配製

20mM HEPES (pH7.9)、20% (v/v) glycerol、1% (v/v) Nonidet P-40、1mM MgCl₂、0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM Phenylmethylsulfonyl Fluoride（PMSF）、1mM DTT、10% (v/v) Protease Inhibitor Cocktail、

2 細胞全蛋白萃取法

以100μl PBS 潤洗細胞，1,200 rpm 轉速離心 5 分鐘之後，去除上清液，

以EDTA trypsin 懸浮細胞後，再以 1,200 rpm 轉速離心 5 分鐘，去除上清液 後，加入50μl whole cell extraction buffer，以微量吸管上下沖洗之後，靜置 於冰上20 分鐘，再以 3700 rpm 轉速離心 5 分鐘，取上清液則為細胞全蛋 白萃取。

5.5.3. 新型微粒子免疫分析法之修飾（modified-MIA-TF）

Tween-20/PBS） 混合，放置離心機（轉子 Swing-bucket rotor A-2-DWP, eppendorf, Hamburg, Germany）轉速 3,500rpm 離心 5 分鐘，小心將上清液吸 出丟棄，之後加入以BSA buffer（1% BSA/PBS）稀釋至 2.5μg/ml（一般由 原液稀釋400 倍）的一級抗體溶液 40μl 將 pellet 重新懸浮，室溫下緩和搖 晃1 小時後，每一個反應加入 200μl wash buffer 混合，放置轉速 3,500rpm 離心5 分鐘，小心將上清液吸出丟棄，再加入 400 倍稀釋的二級抗體溶液 40μl 將 pellet 懸浮，室溫下緩和搖晃 1 小時後，再以同樣步驟加入 wash buffer

混合，放置轉速3500rpm 離心 5 分鐘，丟棄上清液後，以 500μl staining buffer 將pellet 懸浮，即可以流式細胞儀分析（若用於 FACS array，則僅加入 200μl buffer）。流式細胞儀分析方法同於未修飾之方法。

第六章 結果

第一節 新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）

6.1.1 微粒子與 bio-DNA 的結合

為證明微粒子是否可藉由 NeutrAvidin 與 bio-DNA 的 biotin 產生非共價 性鍵結，我們使用洋菜膠電泳來分析（圖三），與微粒子混和十五分鐘的 bio-DNA，洋菜膠電泳結果 (lane III) 顯示 bio-DNA 與微粒子接合之後，整 體大小增加，若使用高溫95℃加熱混和物，並待其緩慢降至室溫，則於 lane IV 看到 band 在 DNA 的原始大小位置出現，此表示 NeutrAvidin 經過高溫 變性後，失去其構形而喪失與biotin 的非共價性鍵結能力，DNA 返回原本 雙螺旋結構後則出現在原始位置。

6.1.2 HeLa cell 於不同大小生長環境內所能抽出核蛋白量

表三為HeLa cell 於各種大小不同環境中培養所能萃取出之核蛋白量，

於75T Flask 培養至九成滿所能萃出之核蛋白量為 450μg，seeding 5*10⁵細 胞於六孔盤中培養24 小時後，每孔能萃出 75μg 核蛋白，seeding 10⁵細胞於 二十四孔盤中培養24 小時後，每孔能萃出 12μg 核蛋白；該數值將作為調 整細胞核蛋白濃度至微粒子免疫分析法適用量之參考。

I II III IV

Ⅰ : microsphere

II : bio-DNA ( 411bp )

III : microsphere + bio-DNA IV : microsphere + bio-DNA

( denatured )

圖三、微粒子與 bio-DNA 的結合

先將微粒子與 bio-DNA（411bp）混合 15 分鐘後，再以 95℃高溫持續加熱 15 分鐘，接著使混合物緩慢降至室溫，將各樣品跑洋菜膠電泳

表三、HeLa 細胞於不同大小生長環境內所能抽出核蛋白量

培養盤規格 生長狀況

每單位可萃核 蛋白量（μg）

75T flask 細胞長至九成滿 450 6 孔盤 5*10⁵細胞培養 24 小時 75 24 孔盤 10⁵細胞培養 24 小時 12

將細胞自培養盤上取下後，以PBS 潤洗，轉速 500g 離心 5 分鐘，去除上清 液後，以5 倍原 pellet 體積 lysis buffer 懸浮後，以轉速 16,000g 離心 5 分鐘，

去除上清液後加入適量體積extraction buffer 充分震盪 10 秒後，靜置於冰上 20 分鐘，以轉速 16,000g 離心 5 分鐘，取上清液則為細胞核蛋白萃取。以 coomassie Plus^TM protein assay reagent 測定濃度。

6.1.3 新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）之流程設立 1. 流程設立-1

初次實驗設計流程如下，將微粒子與bio-DNA、蛋白質、一級抗體、二 級抗體依序作接合

其結果如圖四，顯示不論在bio-DNA 是否存在的情況下，只要在加入 細胞核蛋白的實驗組中，其relative total mean 均會躍升，表示蛋白質或抗 體均會與微粒子形成非專一性的鍵結

2. 流程設立-2

於前次實驗結果顯示，微粒子與蛋白質間的非專一性鍵結會導致假陽 性的結果，因此在此階段作兩個部分的流程修飾，

（1）先加入 PEG 與 BSA buffer 與微粒子混合作為微粒子之前處理

（blocking）

（2）改變實驗流程如下：

分析結果如圖五，散點圖於圖七表示，相較於沒有PEG blocking 的組別，

在PEG blocking 的實驗組別中，其實驗組與負向控制組（只有加入蛋白質 而無bio-DNA）之間的差別度明顯，顯示 PEG 可有效達到 blocking 的效果，

降低蛋白質與微粒子間的非專一性鍵結。

3. 流程設立-3

經由流程設立-2，雖可明顯降低非專一性鍵結導致的假陽性結果，然而，

經過幾次獨立的實驗後，卻發現這樣的系統相當的不穩定，因此參考ELISA 的步驟，作兩步驟的修正

（1） 在每一次鍵結完成後，加入 wash buffer（0.02% Tween-20/PBS）混勻，

離心後棄置上清液。

（2） 更動實驗流程如下：

實驗結果圖六顯示，雖然lane I（microsphere alone）、lane II

（microsphere+bio-DNA）和 lane III（實驗組別）的差別度縮小，但加入特 異性競爭核酸片段的組別，其值明顯降低，而加入沒有結合序列的競爭核 酸片段其值沒有差異，顯示實驗組別的螢光程度上升是因為目標轉錄因子 的特異結合導致。

圖四、流程設立-1

將微粒子依序加入 bio-DNA（HBS）、細胞核蛋白（A431 cell nuclear

extract）、一級抗體（mouse anti human HIF-1α antibody）、二級抗體

（goat anti mouse IgG conjugate FITC antibody），每段間隔時間為 1 小時，最後以轉速 10,000rpm 離心 30 分鐘，丟棄上清液後，以 500μl BSA buffer 重新懸浮後，以流式細胞儀分析。

圖五、流程設立-2

先將bio-DNA（HBS）與細胞核蛋白（A431 cell nuclear extract）混和，依 序加入一級抗體、二級抗體，再與已blocking 完成的微粒子混和 15 分鐘，

接著以轉速10,000rpm 離心 30 分鐘後，棄置上清液，以 BSA buffer 重新懸 浮，以流式細胞儀分析。實驗分為兩組，一為微粒子與PEG 作 blocking，

另一為單獨只與BSA buffer 作 blocking 的比較組。

圖六、流程設立-3

將bio-DNA（*HBS）與細胞核蛋白（A431 nuclear extract）作用之後（相對 於bio-DNA 100 倍之競爭核酸片段亦於此步驟同時加入），與 blocking 完成 的微粒子作接合，再依序加入一級抗體、二級抗體，在每一次的接合反應 之後，先加入wash buffer 將微粒子懸浮並以轉速 10,000rpm 離心 5 分鐘，

丟棄上清液後，再加入後續的抗體溶液，最後以500μl BSA buffer 懸浮後，

以流式細胞儀分析。

★：具p<0.05 之顯著性差異

6.1.4 MIA-TF 於流式細胞儀之散點圖

圖七為微粒子經處理之後的散點圖，第一行之散點圖表示微粒子之大 小及顆粒性（SSC vs FSC），第二行散點圖表示 R1 區塊內之微粒子所帶綠 色螢光亮度（FSC vs FL1）。作分析圖則比較 R2 區塊內的相對 total mean

（events×mean）。由（a）和（b）的比較可得知，blocking 的程序會改變微 粒子的大小及顆粒性，若再加入bio-DNA 和抗體（d），會在第一行的圖中 的右上方多出一群顆粒，隨著加入蛋白量的增加，飄移的顆粒數會增加

（e），加入核蛋白之後會在偏右上方在出現微弱的一群顆粒（f），作圖分析 時將R1 縮小至往右上方散出去的顆粒，且不包含最左下方的顆粒群（g）

（h），於 FSC vs FL1 圈選 R2，計算 relative total mean 為分析數值。

（a）

（b）

（c）

（d）

（e）

（f）

（g）

（h）

圖七、MIA-TF 於流式細胞儀之散點圖

（a）微粒子經 PBS 靜置 30 分鐘、（b）微粒子先經 PEG 反應 30 分鐘，

再加入 BSA buffer 靜置 30 分鐘、(c)為（b）接續與抗體反應、（d）為

（b）加入 bio-DNA 之後與抗體反應、（e）為（b）加入 bio-DNA 和純 蛋白之後，與抗體反應、（f）為（b）加入 bio-DNA 和細胞核蛋白之後，

與抗體反應、（g）為（d）分析數據時圈選表示圖、（h）為（f）分析數 據時圈選表示圖,流式細胞儀之電壓條件（detector/Voltage/Amp

Gain/Mode）：FSC/E01/7.00/Lin、SSC/545/1.00/Lin、FL1/999/9.99/Lin

第二節 新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）檢測細胞內轉 錄因子之變化

6.2.1 MIA-TF 應用於 NF-κB 核蛋白之檢測

為了檢測 MIA-TF 是否有其普遍通用性，因此使用含 NF-κB 結合序列 的bio-DNA 做為材料（NBS），抗體也改變為對應該轉錄因子之抗體。其結 果如圖八，加入蛋白質的lane III 與未加蛋白質的 lane II 有顯著差異，並在 加入競爭核酸片段後，將其值明顯的降低（lane IV），然而加入非特異性競 爭核酸片段（lane V）並沒有造成影響，顯示螢光程度的改變來自於 NF-κB 特異性的結合上核酸片段。本實驗顯示在更換不同的bio-DNA 後，配合上 相對應的抗體，也能夠確切的偵測到目標轉錄因子，確立了MIA-TF 之普 遍通用性。

6.2.2 MIA-TF 測量 NF-κB p50 純蛋白之靈敏度

確立了 MIA-TF 可應用於轉錄因子偵測之後，我們利用 recombinant human NF-κB p50（R&D systems）測試此方法之靈敏度。

結果顯示此系統可偵測純轉錄因子蛋白之靈敏度最低可至0.5ng 而具有顯 著差異性（圖九）。

6.2.3 MIA-TF 測量細胞核蛋白內特定轉錄因子之靈敏度

得知 MIA-TF 測量純轉錄因子蛋白量之靈敏度後，因為檢測時是利用 細胞核蛋白作為材料，我們進一步測量此方法應用於細胞核蛋白檢測量時 的靈敏度。此部分實驗分別以HIF-1 與 NF-κB 作為目標轉錄因子，檢測其 靈敏度（圖十、圖十一）。由數據可知，此方法能檢測最低細胞核蛋白量為 50ng，最高可至 2000ng，但 1000ng~2000ng 之間的差距不大，顯示如此量 的微粒子適合檢測細胞核蛋白的濃度範圍為50ng~1000ng。

圖八、MIA-TF 應用於 NF-κB 核蛋白之檢測

於MIA-TF 實驗中，使用 NBS 來抓取細胞核蛋白（HeLa cell nuclear extract）

中NF-κB 轉錄因子，並在競爭組別分別加入 cNBS 和沒有特異結合序列的 VP16 為控制組，一級抗體為 rabbit anti human NF-κB p50 monoclonal antibody，二級抗體為 mouse anti rabbit IgG conjugate FITC antibody。

★：具p<0.05 之顯著性差異

圖九、MIA-TF 測量 NF-κB p50 純蛋白之靈敏度

於MIA-TF 實驗中，使用 NBS 抓取 recombinant human NFκB p50 轉錄因子，

於實驗組別內分別加入0.1ng~40ng 不等的 NF-κB p50 純蛋白

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十、MIA-TF 測量核蛋白內 HIF-1 之靈敏度

在MIA-TF 實驗中，使用 HBS 作為 bio-DNA 來測量正常培養之 HeLa cell 內含HIF-1 之活化量，以 extraction buffer 將細胞核蛋白調整至

50ng~2000ng/reaction

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十一、MIA-TF 測量核蛋白內 NF-κB 之靈敏度

在MIA-TF 實驗中，使用 NBS 作為 bio-DNA 測量正常培養之 HeLa cell 內 含NF-κB 之活化量，以 extraction buffer 將細胞核蛋白調整至 50ng~2000ng

★：與負向控制組（lane II）具 p<0.05 之顯著性差異

6.2.4 活體外細胞毒殺測試

為了測量細胞所能承受最高藥物濃度，我們採用 MTT 細胞增殖及毒性 檢測實驗來得出細胞對藥物濃度的存活曲線。檢測DFO 或 HQ 對 HeLa cell 的存活影響（圖十二、圖十三）。由圖十二發現，DFO 對 HeLa cell 並無顯 著毒殺效應，因此我們取濃度100μM 作為後續實驗參考之用；由圖十三可

為了測量細胞所能承受最高藥物濃度，我們採用 MTT 細胞增殖及毒性 檢測實驗來得出細胞對藥物濃度的存活曲線。檢測DFO 或 HQ 對 HeLa cell 的存活影響（圖十二、圖十三）。由圖十二發現，DFO 對 HeLa cell 並無顯 著毒殺效應，因此我們取濃度100μM 作為後續實驗參考之用；由圖十三可

在文檔中 建立新型微粒子免疫分析法以測定轉錄因子活性 (頁 51-0)