轉錄因子與癌症相關

第二章、文獻探討

2.1 轉錄因子

2.1.2 轉錄因子與癌症相關

轉錄因子既然在細胞生理調控方面如此的重要，故轉錄因子的不正常便會造成疾病的產生，已有研究指出，在許多人類及動物的癌症個體中，

觀察到致癌基因會產生構形特異或過多量的某種轉錄因子[20]，而在其中最常見的便是產生與調控細胞複製及存活有關的Myc；例如: 在患白血病的公 雞體內有著一種反轉錄病毒稱為 avian leucosis virus，該病毒會將突變的片 段插入體內細胞鄰近表現Myc 基因的位置，進而造成 Myc 被不正常的大量表現[21]；而 Burkitt’s lymphoma 則為另一與人類疾病與 Myc 基因有關的例子[22]。近年來也因而興起了另一類型的癌症療法稱為「transcription

therapy」，主張直接阻斷致癌基因使轉錄因子不正常表現的路徑。Pandolfi 等人於2001 年便發表了相關的文獻[4]，作者於該文章內討論了 M3 型的急性骨髓白血病（APL,M3 subtype of acute myeloid leukemia）的各種以轉錄因子為主的治療機制，因該疾病病因現象複雜，因此便成為如此療法的範例。

由此看來，轉錄因子與癌症治療間的關係是越來越被重視。

2.1.3 HIF-1（Hypoxia-inducible factor-1）

HIF-1 的主要功能為調控氧氣平衡[23]，其結構為由 HIF-1α 和 HIF-1β 兩種單體所組成的異源雙聚體；在正常氧氣供應環境中，α 單體經由 VHL ubiquitin ligase 被迅速降解，而當細胞承受缺氧壓力時，α 單體會被大量釋放並和β 單體結合，進入細胞核且坐落在 HIF binding site（HBS）[24]，其目標下游基因涵蓋相當多範圍，例如血管新生成、紅血球生成、糖解、鐵離子的輸送和細胞複製及生存[23]。而癌細胞因為生長快速，常會承受缺氧的壓力，因此在癌細胞內HIF-1 會被大量表現[25]，在本實驗中我們採取此轉錄因子作為新系統設立的範例。

2.1.4 NF-κB（nuclear factor-kappa B）

NF-κB 於 1986 年被 Sen 和 Baltimore 發現於 B 細胞中和免疫球蛋白輕鏈的增強子結合[26]，因而命名。NF-κB 主要調控與發炎、免疫、抗凋亡、

細胞生長、癌化及病毒感染有關的基因表現[27-29]，常以二聚體的形式存在，其組成單體成員有p50、p52、p75（c-Rel）、p65（ReA）、p68（RelB），

每個單體均保留N 端區域稱為 Rel Homology Domain（RHD），RHD 的 C 端為聚合作用所需，而RHD 的 N 端則包含有和 DNA 做結合的區域，因此 NF-κB 為一個相當典型的轉錄因子結構。未活化的 NF-κB 存在於細胞質中，此時和抑制蛋白IκB 結合[30]，當受到發炎反應因子（例如 TNF-α、IL-1）

刺激後[31, 32]，IκB 會被迅速降解，導致 NF-κB 的自由並進入細胞核中結合至目標序列[33]，開啟下游基因例如抗凋亡因子的表現，進而刺激細胞分裂或令細胞不凋亡，這些影響使細胞無限度的複製，而細胞的無限度生長便是癌化的一項重要特徵[34]。因此 NF-κB 的過量和癌症的發生有密切相關[27]，也被作為藥物開發的重要標的[35]。我們在本實驗中便採取此轉錄因子作為範例之一。

2.2 各式轉錄因子偵測方法論述

2.2.1 西方墨點法（ western blot ）

西方墨點法乃是結合膠體電泳的解析和免疫化學專一性所發展出來的

偵測生物特性的方法，源自Stanford ,George Stark 的實驗室，而該方法的命名則是來自於W. Neal Burnette [36]，其基本原理為先利用 SDS-PAGE（ SDS polyacrylamide gel electrophoresis ）將蛋白質變性，並根據分子量與電荷的差異而分離出來，接著將蛋白質自電泳膠中轉印到另一層膜上（通常為 nitrocellulose 或 PVDF），後續利用專一性抗體辨識特定的蛋白質分子，再經各種反應如呈色、螢光或放射線等變化來檢測樣品中特定蛋白質的含量。利用西方墨點法，不僅可以偵測到蛋白質的分子量，更可以有效的分離目標抗原蛋白質及判斷其濃度變化。將西方墨點法應用於轉錄因子的偵測，可確實的反映出細胞內該轉錄因子的存在濃度。

2.2.2 電泳速度變動分析法 ( Electrophoretic mobility shift analysis;

EMSA )

EMSA 為一種研究 DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術[7]，可用於定性和定量，通常用純化的蛋白或細胞核萃取液與標記的DNA 探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離複合物和非結合的探針，DNA 複合物移動速度比非結合的探針慢，因此可以分離出來。

EMSA 常用的 DNA 探針標記方法有同位素 32P 法和非同位素法（化學發光法），同位素法是最傳統的一種實驗方法，但因實驗需涉及輻射，有無法避免的危險性及需要耗資甚高的防護措施，因此後來發展出化學發光法，利用DIG 或 biotin 標記核酸片段，後續再經化學呈色觀察[37]。若配合上特定的抗體，則可進行超遷移實驗（supershift）[21]，因為 DNA 複合物在接上抗體後，其在電泳膠上的遷移會延遲，觀察混合物是否延遲，可加強判斷目標蛋白的特異性，一般所能使用的純化蛋白量約在20-2000ng 之間，若為細胞核萃取液，則需提高濃度至1-20μg 方可被偵測。

2.2.3 酵素免疫吸附分析法 (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay;

ELISA)

的方法[8]，先將會辨識目標轉錄因子的一級抗體接合在盤子上，加入細胞萃取蛋白後，再加入標定有biotin 並含目標結合序列的核酸片段，接著使用化學法呈色。後來以ELISA 原理作為基本平台，亦發展出許多他種形式可偵測轉錄因子的方式，例如在盤子上先接合streptavidin，再加入蛋白質與 biotin-labeled dsDNA probe 的混合物，接著依序加入一級抗體、二級抗體之後呈色 [39]；另一方式為先在核酸片段的第一級胺基團的氮原子上作修飾，將核酸片段以共價性鍵結直接接在盤子上，接下來再加入蛋白質、一級抗體、二級抗體呈色 [40]；同年 Wang 等人利用核酸外切酵素

（exonuclease）發展出不需特異性抗體的方法 [41]，先將標定有 DIG 的核酸片段共價鍵結上盤子，加入細胞萃取之後，目標轉錄因子會結合上核酸片段，之後再加入核酸外切酵素，此時未被蛋白保護的核酸片段會被切除而失去DIG，再加入可辨識 DIG 的抗體，便可因此間接的對轉錄因子定量。

2.2.4 報導基因活性分析 (Reporter gene activity assay)

在分子生物研究上，因為不易直接觀察到細胞內基因表現程度，所以選擇容易被觀察及測量的報導基因作為間接證明；將報導基因連接上有興趣的含轉錄因子結合位之核酸片段後，利用轉染的方式將基因送入細胞株，直接觀察報導基因的螢光表現而間接推得該核酸序列的表現程度[9, 42]。可作為報導基因的種類非常多種，例如來自螢火蟲的 luceferase 可催化

luceferin 產生冷光、來自水母的 Green fluorescent proteins(GFP)可於 UV 燈下產生綠色螢光。此種偵測法因敏感度高、可定量、且可一再被分析，被普遍使用在細胞株的基因表現研究中，研究者可利用報導基因定出操縱子與增強子的強度 [9]、定出轉錄因子的角色 [43]、轉染的效率 [44]或偵測分子轉殖是否成功。

2.3 流式細胞儀之粒子分析

（particle-based flow cytometric assay）

流式細胞儀可針對流體內的單一粒子提供一多性狀的光學分析，因其的微粒子測定neutrophils 和 macrophages 的吞噬作用 [48]；1982 年以 ELISA 原理做為平台，使用微粒子作為固相載體，於其表面固定特定抗體後，用來定量樣品中之IgG，並使用流式細胞儀分析 [49]，其優點為操作過程中不需經過wash，可節省下許多時間，改變相對抗體後，更應用於探測 Helicobacter pylori [50]、hepatitis C virus [51]、immune complex [52]……等

許多蛋白分子；除此之外，reverse transcriptase、polymerase chain reaction

（PCR）等方式可用於製造具標定記號的核酸序列，將此核酸序列接上微粒子之後，可使用雜交（hybridization）的方式抓住樣品中互補的核酸片段，

藉以定量DNA 或 mRNA，應用於基因表現研究上 [53, 54]。微粒子應用於

流式細胞儀的一大進展便是multiplexed flow cytometric assay[55]，同時使用多種微粒子作偵測，其訴求在於可在一個樣品中同時偵測多種目標分析物，目前已有許多廠商將帶不同螢光的微粒子作為套組（multiplexed bead system）上市，例如 Luminex FlowMetrix^TM套組中便帶有64 種紅、橙螢光比例不同、並帶有不同抗體的微粒子，在流式細胞儀上可用FL2/FL3 去加以分別，因目標分析物上帶綠色螢光染劑 [56]，因此分析數據時先以

FL2/FL3 將不同微粒子先分別開來，再分別去看區塊內綠色螢光量（FL1），

便能代表特定目標分析物的含量多寡，因此使用如此套組可在同一個實驗樣品中同時分析64 種不同的目標分析物。使用流式細胞儀分析微粒子的方式日趨熱門，目前也仍有相當大的進展空間，日後必可成為學術研究及醫療診斷的一重要技術

第三章實驗策略

此新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）採用市售已接合 NeutrAvidin 的微粒子作為固相載體，NeutrAvidin 為去除了醣的 Avidin，可與 biotin 形成極強的非共價性鍵結，相較於其他種類Avidin，其優點為 pI 值為中性，與目標物所形成的非專一性結合最低，且此微粒子的直徑為1.0μm，可於流式細胞儀中被偵測。

首先使用bio-DNA 作為探針抓取細胞核蛋白萃取物中的特定轉錄因子，

再將微粒子加入混合物，微粒子與bio-DNA 會經由 NeutrAvidin 與 biotin 間的非共價性鍵結而結合，接續加入對應的一級抗體與二級抗體，便完成接合反應，接著可以流式細胞儀分析（圖一）。

流式細胞儀分析中，先於散點圖中選取微粒子大小的群落，再觀察該群落內的綠光螢光發亮程度，若是微粒子混合物上所接的轉錄因子越多，則相對應的二級抗體上的螢光（FITC）mean 值會越高，分析數據時選取區塊內的events*mean 作為 total mean，再將得到的數值除以微粒子僅和 bio-DNA 作接合、而不含核蛋白的負向控制組，以最後所得倍率數字作圖比較

（relative total mean）。

圖一、新型微粒子免疫分析法（MIA-TF）概念圖 bio-DNA：biotin-labeled dsDNA；

TF：transcription factor

第四章實驗流程

本實驗流程圖如（圖二）所示：一開始先將蛋白質萃取與bio-DNA 混和，

等待適當時間後，再加入已blocking 完成的微粒子，之後再接上針對目標轉錄因子的一級抗體，及尾端接上螢光的二級抗體，在每一次接合步驟完成後，都需加入wash buffer 混合並離心，去除上清液，以洗去非專一性的

在文檔中建立新型微粒子免疫分析法以測定轉錄因子活性 (頁 16-0)

第二章、 文獻探討