檢測細胞於特效藥刺激下致使核內轉錄因子濃度變化… 64

MIA-TF 的開發目的是為了可以直接測量細胞於各種環境下之轉錄因 子變化，因此我們於培養細胞時，加入目標轉錄因子的作用藥物，再用 MIA-TF 加以偵測目標轉錄因子的濃度變化。 圖十四為 HeLa cell 對 HIF-1 的活化劑DFO 所呈現的細胞核內活化量變化，可見 HIF-1 的活化量隨著 DFO 的刺激而上升。圖十五為 HeLa cell 對 NF-κB 的抑制藥物 HQ，也可確 實的偵測到NF-κB 的活化量隨著 HQ 的增加而相對被抑制

圖十四、MIA-TF 偵測 HeLa cell 於 DFO 刺激下之 HIF-1 活性變化

於24 孔盤每孔 seeding HeLa cell 10⁵個，待八小時後加入 DFO，培養 16 小 時後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量蛋白濃度後，以extraction buffer 將核蛋白調整至每個反應加入200ng，以 MIA-TF 配合 HBS 檢測

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane III）具 p<0.05 之顯著性差異

圖十五、MIA-TF 偵測 HeLa cell 於 HQ 刺激下之 NF-κB 活性變化

於24 孔盤每孔 seeding HeLa cell 10⁵個，待八小時後加入HQ，培養 16 小時 後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量蛋白濃度後，以extraction buffer 將 核蛋白調整至每個反應加入800ng，以 MIA-TF 配合 NBS 檢測

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane III）具 p<0.05 之顯著性差異

第三節 HIF-1α ELISA

為了與 MIA-TF 互相比較，我們採用市售 HIF-1α ELISA 套組測量 HeLa cell 於 DFO 刺激下之轉錄因子活性變化。圖十六顯示：隨著 DFO 的濃度上 升，HeLa cell 內的 HIF-1 活化量顯著性上升，然而在競爭反應中，卻沒有 明顯的競爭效果。

圖十六、ELISA 檢測 HeLa cell 於 DFO 刺激下之 HIF-1 活性變化

於6 孔盤每孔 seeding HeLa cell 5*10⁵個，待八小時後加入DFO，培養 16 小時後，收取細胞並抽取細胞核蛋白，測量濃度後，以ELISA 套組所附標 準流程偵測，每個反應加入的核蛋白量為30μg，競爭組為 DFO 濃度為 0μM 組別的控制組

★：與檢測正常培養細胞之實驗組（lane I）比較具 p<0.05 之顯著性差異

第四節 報導基因活性分析

偵測轉錄因子之另一常用方法為報導基因活性分析，為了可與MIA-TF 互相比較，我們構築出一可反應HIF-1 活性表現的報導基因活性分析系統，

將得到的質體轉染入細胞後，使用DFO 作用轉染細胞，接下來使用流式細 胞儀分析，將細胞螢光量數值化，再加以比較HIF-1 之活性。

6.4.1 HBS（HIF-binding site）報導基因質體之構築 1. 基因選殖

XbaI (16) XbaI (825)

在pCRII-C2-9 之 7XHBS 片段後產生切位 約800bp 的位置（圖十八），約等於 hrGFP 的片段長度（831bp），因此 大致可確定片段確實有接入質體內。

3. 以限制脢 BamHI 確定接入片段為順向或反相

因為使用同一切位將hrGFP 片段接入 pCRII-C2-9 內，因此接入的 片段可能為順向或反相接入，此時利用限制脢BamHI 做切割，則可依 出現片段大小判斷接入片段的正反，如圖十九表示：若接入片段為順 向，則切割出片段大小應為4676bp + 367bp（圖十九、a），若為反相，

則切割出片段大小應為3901bp+1142bp（圖十九、b）。我們選擇菌液PCR 實驗中編號3、6、9 之組別做限制脢切割，其結果顯示所選取組別的切 割片段皆出現在大約300bp 和 400bp 的位置（圖二十一），因此可判斷 這三組所接入片段皆為順向，選擇編號第9 作為後續實驗之用。

4. 以細胞轉染方式確知 hrGFP 是否具有功能

因為接入片段hrGFP 為 PCR 增幅複製出之產物，有可能會有突變 造成報導基因失去功能，因此我們利用細胞轉染來直接測知該hrGFP 片段接入質體後是否仍具有報導基因的功能。其結果顯示：當於細胞內 轉染入pCRII-C2-9-hrGFP 之後，於螢光顯微鏡下可見細胞發出綠色螢 光（圖二十一、a），證實 hrGFP 報導基因於接入質體後仍具有功能。

（a） （b） （c）

I II I II

圖十七、基因選殖之插入片段及質體準備之電泳圖

（a）hrGFP 之 PCR 產物。使用引子 hr-GFP-5’、hr-GFP-3’自模版 pNFκB-hrGFP 增幅複製出；（b）hrGFP 片段經限制脢 XbaI 切割，

lane I 為未切割，lane II 為切割後產物；（c）pCRII-C2-9 經限制脢 XbaI 切割後之產物，lane I 為未切割，lane II 為切割後產物

I II III IV

圖十八、菌液PCR 之電泳圖

由黏合反應的產物，經過質體轉型至DH5α competent cell 後，培養 12-16 小時後，選取其中12 個菌落，加入 3ml 含 kanamycin 的 LB 培養液中培養 17-20 小時，接著選擇 0.1μl 菌液作為模版，使用引子 hr-GFP-5’和 hr-GFP-3’

作PCR 反應，每三組合為一管後，以洋菜膠電泳分析片段。

（a）

（b）

圖二十、pCRII-C2-9-hrGFP 之順接及反接可能質體圖示

因為接入hrGFP 使用兩端皆是 Xbal 切接位，因此接入時可能為正向或反 向，使用限制脢BamHI 切割後可判斷（a）順向接入、（b）反相接入

I II III IV V

VI

VII VIII

圖二十、pCRII-C2-9-hrGFP 經 BamHI 切割後之電泳圖

選擇菌液PCR 之 3,6,9 組，以小量分離法純化出質體後，分別以限制脢 BamHI 作切割，切割後產物以洋菜膠電泳分析片段

（a）

（b）

圖二十二、以細胞轉染方式測試pCRII-C2-9-hrGFP 的功能

選擇第九組產物作質體大量純化後，以lipofectamine 進行細胞轉染實驗，

使用細胞為Balb/3T3，seeding 5*10⁵個細胞於 6 孔盤中，待細胞長至七成滿 後（約12~16 小時）開始進行轉染。轉染進行後培養 24 小時照相（a）轉 染入pCRII-C2-9-hrGFP、（b）未加入質體，但仍有操作轉染程序