養16 小時），約需三天才能完成，實在耗時甚長，且轉染的動作會對細胞 biotin-labeled dsDNA probe 混合，再加入盤子內，接著再加入一級抗體及可 呈色的二級抗體[39]；其二為將核酸片段的第一級胺基團的氮原子上作修
量在DFO 存在下有顯著性增加（圖十六，p<0.05），然而其整體於 450nm 下之吸光值均偏低（小於0.4），接近於背景值，可能因差別度均太小導致 競爭控制組的失敗，顯示該方法的靈敏度並不高；而2006 年 Wang 等人所 發表的方法合適偵測核蛋白量為0.625μg~10μg，純蛋白則為 3-60ng，其靈 敏度約為ELISA 的十倍[40]，是近期所發表靈敏度最好的方式之一，而我 multiplex immunoassay, MIA）於細胞激素檢測上的不同 [58]，該份文獻指 出，MIA 於檢測細胞激素時其靈敏度優於 ELISA，因 ELISA 屬於平面結構，
因此當加入capture antibody 時，抗體以隨機的位置接於盤子上，因此可能 只有部分的抗體可接上目標蛋白，也因為反應於平面進行，因此抗體間可 能會產生立體障礙而導致最終靈敏度下降；Li 於 2007 年所發表的文獻中也 探討了使用streptavidin-biotin 系統於傳統 ELISA 的疑慮 [57]，biotin 與 streptavidin 於液體中的結合常數（Ka）為 1015M-1，當其中任一個分子被固 著在固體表面產生立體障礙，結合常數便會下降，造成使用此系統的ELISA
靈敏度降低，因此當我們將平面固相載體改為立體表面，便減少其立體障
（0.05%），此試劑為介面活性劑，可有效降低 polystyrene 固相載體的非專
Tween-20 的 PBS，並上下混勻，考量 Tween-20 濃度過高可能造成蛋白質的 變性，因此將濃度由一般常用的0.05%降為 0.02%，也藉由加入大量體積 wash buffer 將溶液稀釋，降低非專一性鍵結的機率，並利用離心的方式去 除液體，留下鍵結完成的微粒子，再接下一步的接合反應。
確立了系統的可行性之後，我們試著將MIA-TF 應用於 96 孔盤，希望 能夠藉由直接操作於96 孔盤達到高生產力之用，但因懸浮式承盤的離心速 度最多只能到達3,700rpm，因此首先我們要能知道 MIA-TF 是否可在降低 轉速之後仍能實行，如圖二十三所示，隨著加入不同濃度的核蛋白量，也
由計算上得需於96 孔盤上每孔 seeding 約 3500 個細胞，已有文獻指出細胞 全蛋白與細胞核蛋白在ELISA 的偵測上趨勢相同[39]，因此我們在 96 孔盤 中直接抽取細胞全蛋白作檢測，如圖二十四及圖二十五，結果顯示
modified-MIA-TF 可以達到實際的應用，然而在檢測 HIF-1 的數據顯示卻較 不明顯，不具有顯著差異，推測可能因HIF-1 在細胞內含量本身就較低， 需注意的細節在於緩衝液的部分，BSA buffer 和 wash buffer 皆需在當天新 鮮配製，且需經過孔隙0.22μm 之濾器過濾後使用，放置過久的緩衝液容易 導致背景值過高，也可能會因受污染而影響物質間的鍵結狀況。
此外在選擇每一個反應所需加入之核蛋白量時，需先考量所預期的實 驗結果是轉錄因子活化量增加或降低，因所能偵測之核蛋白範圍極限在 50ng~1000ng（圖十、圖十一），若預期活化量增加，則每個反應選擇加入 200ng 較合適，若預期活化量下降，則選擇 800ng，若為未知狀況，建議每 一個反應選擇加入500ng 核蛋白量，倘若加入核蛋白量太過或不及，可能
當具有潛力的檢測方式，未來可成為學術上研究轉錄因子之一有力的工具。