方法

（一）鼠尾草酸、熊果酸配製方法

分別秤取鼠尾草酸 (CA) 及熊果酸 (UA) 粉末並溶於 DMSO 中，

配製成 100 mmol/L 備用。

（二）細胞培養

來自大鼠胸主動脈之血管平滑肌細胞株 (購自財團法人食品工業發 展研究所生物資源保存與研究中心，生資中心編號 : 60127，細胞株名稱 : A 10 )。將其培養在 10 % Dulbecco’s Modified Eagified Eagle’s Medium (DMEM) 中，含有 high glucose 、L-glutamien、 pyridoxine hydrochloride、

10 mg/L sodium pyruvate， 並再加入 soudium bicarbante 3.7 g、10 % fetal bovine serum (FBS)、1% Hepes Buffer Solution、1% Strpotomycin/penicilline，

於 37℃，5% CO²下。當細胞長滿約 9 分時，進行分盤。

（三）總抗氧化能力 (TEAC)

依 Miller 等 (1993) 方法 ，將 peroxidase 、 ABTS (2,2–azino-bis

〔3-ethylbenzthizazoline-6-sulfonic acid〕)、H²O²混合均勻，放於 6 分鐘後，

待其產生藍綠色之 ABTS ·⁺ 陽離子自由基，再加入 Trolox 分別與鼠尾 草酸、熊果酸反應 6 分鐘，混合均勻取出至 96 孔盤中，用 ELISA (Quant，

Bio-Tek，USA) 測量 734 nm 下的吸光值。利用 Trolox 清除 ABTS·⁺ 陽 離子自由基的能力，來表示樣品的總抗氧化能力。全程需避光。

（四）清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基能力測定

鼠尾草酸、熊果酸分別加入 DPPH 之甲醇溶液，混合 30 分鐘後，

取出至 96 孔盤，用 ELISA (Quant, Bio-Tek, USA) 測量 517 nm 下的吸光 值。吸光值低表示清除 DPPH 自由基能力愈強，以未添加 carnosic acid、ursolic acid 之吸光值為 100% 來作比較，結果以 IC 50 表示，以 代表清除 50%的 DPPH 自由基所需的濃度。

DPPH‧+ AH DPPH² + A‧ Violet decolorized

DPPH 自由基清除能力 % = [（控制組在 517 nm 下吸光值－試樣在 517 nm 下吸光值）/ 控制組在 517 nm 下吸光值 ] x 100 (105)。

（五）細胞計數試驗

大鼠血管平滑肌細胞用 PBS 清洗後，加入 1X trypin-EDTA，待貼 附於培養皿上的細胞懸浮後，與含血清培養基中和並移至離心管，離

心 12,000g、10 分鐘後，倒掉上清液並加入含血清培養基混勻，取出 100 μl 細胞懸浮液於 96 孔盤中，和 10μl typan-blue 混合，在血球計數盤上 各打入 10μl 混合液，顯微鏡下計數 9 大格中之 5 大格 (十字) 所含細 胞數目。

（六）測量細胞內的 ROS

大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預 處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時。然後以 10 μmol/l 2,7-dichlorofluorescein ( DCF ) diacetate ( DCF-DA ) 與細胞一起 放 37℃ 培養箱中 30 分鐘。藉由細胞內的酯解酵素作用將其變化為 DCF

(Kim

et al.

光偵側儀 FLX800 TBI 在發光波長 485 nm 和發散光波長 528 nm 下測得 吸 光 值 (Bio-tek, VT, USA) 。 以 倒 立 式 螢 光 顯 微 鏡 OLYMPUS IX71 (Olympus America, Melville, NY) 和 自 冷 式 螢 光 數 位 SPOT RT Color (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI) 拍照其螢光表現 (100)。

計數室 蓋玻片

放大

（七）蛋白質定量

利用 Bradford 染劑與標準品蛋白質 (0、5、10、15、20、25 μg BSA) 混合 5 分鐘後，測其 590 nm 下之吸光值，將值帶入 Excel 畫出檢量線，

並求得趨勢線方程式 Ｒ²值，Ｒ²值要＞0.99 以上的準確度。

樣品蛋白質濃度測定: 取 5 µl 的樣品和 495 µl 的二次水混合後，加 入 100 µl Bradford 染劑，作用 5 分鐘後測其 590 nm 下之吸光值，再將 測得的吸光值 (y) 帶入求得的趨勢線方程式，而計算得到蛋白質濃度 (138)。

（八）ERK1/2、NF-κB、MMP-2 之測定-西方點墨法

利用大鼠血管平滑肌細胞蛋白質，測試 ERK1/2、NF-κB、MMP-2 活性的表現。將大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草 酸及熊果酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時。利用 lysis buffer (包含 10 mmoll Tris/HCL (pH8.0)、0.32 MOL/L sucrose、5 mmol/l Ethyienediamine Teraacetate Disodium Salt (EDTA)、1%

Triton X-100、2 mmol/l 1,4-Dithio-D、L-thereitol (DTT)、1 mmol/l PMSF) 將 細胞取下來，並把收下的細胞進行蛋白質定量後，配置 loading sample，

並加熱 (95℃，5 分鐘)，隨即放於冰上 30 秒，則 loading 到 SDS-PAGE

(9%) 中，在 100V 跑膠約 2.5 小時，待取出膠片後，把蛋白質轉漬於 PVDF 膜上，把轉漬後的 PVDF 膜放入含 5%的脫脂牛奶中，於室溫 blocking 約 1 小時，取出，以 0.1% PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，即可 將膜放入含一級抗體 (Mouse monoclonal to MMP2、Rabbit polyclonal to NF-κB p105 / p50、Rabbit polyclonal to NF-κB p65、Mouse monoclonal to ERK1 + ERK2、Anti-phospho-MAP kinase 1/2、Mouse Anti-Actin Monoclonal Antibody 或 Mouse Anti-Human Nuclei & Chromosomes Monoclonal Antibody) 封口袋內，置於 4℃ 冰箱至隔天。接著再將膜以 0.1% PBST 清洗 3 次，

每次 5 分鐘後，放入含二級抗體 (Goat polyclonal to Rabbit IgG 或 Sheep polyclonal to Mouse IgG) 封口袋內，在室溫下搖盪 1 小時，取出膜以 0.1%

PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，於暗房將 PVDF 膜浸泡於化學發光試劑 (enhanced chemiluminescence reagent; ECL) 中約 1 分鐘後取出，與底片一 起放至在壓片夾中約 5 分鐘，取出底片與顯影劑作用至影像顯現，再浸 於定影劑中定影，最後利用掃瞄密度測定儀和影像分析軟體來定量結果 (138)。

（九）核蛋白的萃取

將大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果 酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時後，

使用 TransAM nuclear extract kit，萃取大鼠血管平滑肌細胞之核蛋白。分 別將取下的細胞加入 10X PBS 和 phosphatase inhibitors 混合溶液中，離 心 3000 x g、5 分鐘，取沉澱物與 hypotonic buffer 作用 15 分鐘後，加入 Detergent，離心 14000 x g、30 秒，去上清液，加入含有 10 mmol/L DTT、

lysis buffer AM2、protease inhibitor cocktail 的混合液，於冰上搖 30 分鐘 後，離心 14000 x g、10 分鐘、4℃，取上清液進行實驗或儲存在-80℃ 備 用 (54)。

（十）MMP-2 之測定-明膠蛋白酵素電泳法 (Gelatin zymography for MMP-2)

大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸 預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時後，收 取上清液，透過明膠蛋白酵素電泳法 (zymography) 使用 SDS-PAGE (7.5%) 包含 1 mg/mL 明膠 (gelatin)，測量 MMP-2 的活性表現 (147)。將 上清液與 2x sample buffer (1.5M Tris-HCl (pH 6.8)、20% glycerol、30%

SDS、0.3% bromophenol blue) 混合，loading 至電泳膠片中，以 100 伏特 進行電泳跑膠約 3 小時，待膠取出後在室溫下與 Renaturing buffer (2.5%

Triton X-100) 反應 30 分鐘，再與 Develiping buffer (50 mmol/l Tris-HCl、pH 8.0、5 mmol/l CaCl²、0.2 mmol/l NaCl、0.02% Brij 35) 在 37℃ 下培養 48 小時。反應後的膠片以 Staining buffer (0.1% Coomassie Brillant Blue R-250) 染色 30 分鐘，再以退色液 (50% methanol、10% acetic acid) 退染後，觀 察透明 band 的表現，以表示 MMP-2 的活性 (48)。

（十一） NF-κB 之測定-免疫螢光染色法 (Immunocytochemistry, ICC) 大鼠血管平滑肌細胞分別加入10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預 處理1小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用24小時。加入100%

丙酮溶液，作用15分鐘後用 PBS 清洗，再加入0.1 % Triton X-100，5分 鐘後以 PBS 清洗。加入10 % normal goat serum 作用1小時，PBS 清洗 後，加入一級抗體 (Rabbit anti-NFκB p50) (1：50) 於4℃ 下作用至隔夜，

再以 PBS 清洗，加入二級抗體 Alexa-488 (Goat anti-rabbit IgG (H+L) ; 1：

200) 作用1小時 (需要避光)，再用 PBS 清洗，之後加入0.5%碘化物 (propidium iodide ; PI) 於室溫下作用15分鐘，用 PBS 清洗後，取出載玻 片並封片，再以雷射掃描共軛焦掃描系統，含共軛焦專用正立顯微鏡觀

察、數位影像量測分析系統 (Leica TCS SP2)，觀察並拍照 (150)。

（十二） 統計分析

細胞計數試驗以及西方墨點轉漬法觀察瘦體素對血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響是利用 One way ANOVA-Dunnett’s test 來比較其結果，其他實驗則利用 One way ANOVA- Duncan’s Multiple Range Test 來進行分析。值以 mean ± SD 的表示當 p＜0.05 表示具有統計上的差異。