馬鬱蘭天然抗氧化成分 (鼠尾草酸和熊果酸) 預防肥胖導致之心血管疾病: 抑制瘦體素誘發血管平滑肌細胞增生; Carnosic acid & Ursolic acid (Origanum majorana L.) Prevent Cardiovascular Disease Caused by Obesity: Suppression of Leptin-induced Proliferation in Vascular Smooth Muscle Cells

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(1)中國醫藥大學營養學系碩士班碩士論文馬鬱蘭天然抗氧化成分 (鼠尾草酸和熊果酸) 預防肥胖導致之心血管疾病: 抑制瘦體素誘發血管平滑肌細胞增生 Carnosic acid & Ursolic acid (Origanum majorana L.) Prevent Cardiovascular Disease Caused by Obesity: Suppression of Leptin-induced Proliferation in Vascular Smooth Muscle Cells 研究生：曾瑜妏撰 (Yu-Wen,Tzeng) 指導教授：余雅美博士 (Ya-Mei,Yu) 共同指導教授：曾政鴻博士 (Jen-Horng,Tseng) 江素瑛博士 (Su-Yin,Chiang). 中華民國九十七年六月二十七日.

(2) 總目錄圖目錄……………………………………………………………………Ⅳ 表目錄……………………………………………………………………Ⅵ 謝辭………………………………………………………………………Ⅶ 中文摘要…………………………………………………………………Ⅷ 芵文摘要…………………………………………………………………Ⅹ 英文縮寫…………………………………………………………………XII 第一章前言………………………………………………………………1 第二章文獻回顧一、動脈血管壁基本構造………………………………………………4 二、動脈粥狀硬化形成的原因…………………………………………5 三、自由基與動脈粥狀硬化……………………………………………8 四、發炎、Nuclear factor-kappa B (NF-κB) 與動脈粥狀硬化…… 10 五、肥胖、瘦體素與代謝症候群…………………………………… 13 六、瘦體素與血管平滑肌細胞……………………………………… 18 七、細胞外信號調節激酶 (ERK 1/2) 與動脈粥狀硬化……………19 八、基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases, MMPs) ……………21 九、簡介馬鬱蘭……………………………………………………… 24 第三章實驗設計………………………………………………………… 35 第四章材料與方法一、材料………………………………………………………………37 二、方法（一）鼠尾草酸、熊果酸配製方法…………………………………42 （二）細胞培養………………………………………………………42. I.

(3) （三）總抗氧化能力 (TEAC) ………………………………………42 （四）清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基能力測定 …………………………………………………………… 43 （五）細胞計數試驗…………………………………………………43 （六）測量細胞內的 ROS……………………………………………44 （七）蛋白質定量……………………………………………………45 （八） ERK1/2、NF-κB、MMP-2 之測定-西方點墨法………………45 （九）核蛋白的萃取…………………………………………………47 （十）MMP-2 之測定-明膠蛋白酵素電泳法 (Gelatin zymography For MMP-2)……………………………………………………47 （十一）NF-κB 之測定-免疫螢光染色法 (Immunocytochemistry, ICC)………………………………………………………… 48 第五章結果一、鼠尾草酸與熊果酸抗氧化能力及清除 DPPH 自由基能力………50 二、鼠尾草酸和熊果酸對血管平滑肌細胞之影響 (-細胞毒性傷害) 50 三、評估不同濃度瘦體素對血管平滑肌細胞增生之影響………… 51 四、評估瘦體素誘導血管平滑肌細胞增生在不同時間下之影響… 51 五、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞增生之影響………………………………………………………………… 52 六、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞自由基生成之影響…………………………………………………………53 七、以西方點墨轉漬法觀察瘦體素對血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響………………………53 八、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 ERK 1/2 II.

(4) 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響…………………54 九、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞血管平滑肌細胞 NF-κB p50 及 p65 蛋白之影響…………………………55 十、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞核轉錄因子 NF-κB 之影響…………………………………………………55 十一、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 MMP-2 蛋白之影響……………………………………………………… 57 十二、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 MMP-2 之影響…………………………………………………………… 58 第六章討論一、瘦體素誘發大鼠血管平滑肌細胞增生之影響…………………59 二、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發大鼠血管平滑肌細胞增生之影響……………………………………………………………… 61 三、鼠尾草酸與熊果酸之抗氧化作用………………………………62 四、基質金屬蛋白酶與血管平滑肌細胞增生之探討………………63 五、活性氧化物族群與血管平滑肌細胞增生之探討………………64 六、訊息調控與血管平滑肌細胞增生之探討………………………65 第七章結論………………………………………………………………69 第八章參考文獻…………………………………………………………86. III.

(5) 圖目錄圖 1. 動脈血管壁的結構…………………………………………………27 圖 2. 發炎與脂肪分泌之細胞激素………………………………………28 圖 3. 動脈粥狀硬化形成假說……………………………………………29 圖 4. 鼠尾草酸化學結構式………………………………………………30 圖 5. 熊果酸化學結構式…………………………………………………30 圖 6. 纖維斑塊誘發訊息調控之路徑……………………………………31 圖 7. NFkB 調控路徑……………………………………………………32 圖 8. 體外實驗流程簡圖…………………………………………………35 圖 9. 細胞實驗流程簡圖…………………………………………………36 圖 10. 鼠尾草酸對血管平滑肌細胞之影響-細胞毒性傷害……………71 圖 11. 熊果酸對血管平滑肌細胞之影響-細胞毒性傷害………………72 圖 12. 評估不同濃度瘦體素對血管平滑肌細胞增生之影響…………73 圖 13. 評估瘦體素誘導血管平滑肌細胞增生在不同時間下之影響…74 圖 14. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞增生之影響………………………………………………………………75 圖 15. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞自由基生成之影響-螢光拍照圖……………………………………………76 圖 16. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞自由基生成之影響…………………………………………………………77 圖 17. 以西方點墨轉漬法觀察瘦體素對血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和即立性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響………………………78 圖 18. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響……………………79 IV.

(6) 圖 19. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 NF-κB p50 蛋白之影響…………………………………………………80 圖 20. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 NF-κB p65 蛋白之影響……………………………………………………81 圖 21. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞核轉錄因子 NFκB 之影響 (ICC)……………………………………………82 圖 22. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 MMP-2 蛋白之影響 (西方點墨法) …………………………………………83 圖 23. 鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞 MMP-2 之影響 (明膠蛋白酵素電泳法) ……………………………………84 圖 24. 鼠尾草酸與熊果酸對動脈粥狀硬化形成機制之影響………… 85. V.

(7) 表目錄表 1. 脂肪激素對血管凝血與代謝系統上的影響………………………33 表 2. 基質金屬蛋白酶分類………………………………………………34 表 3. 鼠尾草酸與熊果酸的抗氧化能力…………………………………70. VI.

(8) 謝辭首先感謝指導教授余雅美老師，台南、台中兩地奔波的指導、江素瑛老師在實驗技術上用心的傳授、曾政鴻老師在專題討論課程上的指導。因為有您們悉心的指導和期勉、生活上的關懷和正確的實驗觀念導引下，才能讓我能順利的完成這兩年不眠不休的研究實驗路程與學業、論文的撰寫，在此獻上我由衷最大的敬意謝忱。文稿之初，承蒙中國醫藥大學曾政鴻副教授、江素瑛助理教授，以及長榮大學余雅美副教授等口試委員，百忙之中撥冗審閱，詳加斧正，並給與我多方寶貴的建言，使論文得以更加完善，謹此致上萬分謝意。研究所的這兩年，感謝張毓芬老師平時對我的關心，學姊杏純、芩卉、心婷在實驗上的指導，同期研究所同學于婷、智聖、宜儒、孟儀、姤君、依儒、文婷和實驗室助理紫旋、政力、琬諭，在研究上的切磋與幫助，大學部學妹郁婷、珮琪、榆茜的栛助與鼓勵，貴重儀器室戴如淳老師在實驗上的大力幫忙，以及其他在我背後默默支持、幫助我的人，還有我最親愛的家人 (老爸、老媽、阿弟)，這一路走來，因為有您們，才有今天的我，在此獻上我最深的謝意。感謝您們。. VII.

(9) 中文摘要血管平滑肌細胞的增生在血管重組與動脈粥狀硬化形成上具重要的相關性。瘦體素是從脂肪組織所分泌的一種循環性胜肽，它可藉由對食物攝取及代謝上的影響而調節體重。先前研究顯示在肥胖和糖尿病人身上若觀察到有高濃度的瘦體素，可能對心血管疾病有不利的影響。在體外試驗顯示，瘦體素會影響前動脈粥狀硬化的形成，包括: 內皮細胞的活化，平滑肌細胞的增生和遷移; 在體內試驗顯示，瘦體素的接受器被表現在血管細胞上。馬鬱蘭又稱為薄荷花，傳統上作為香料使用，最近在台灣市場上亦有開發成茶或醋等產品。馬鬱蘭中的熊果酸與鼠尾草酸為天然的抗氧化劑，在多種的植物與蔬菜食物中亦含有。先前研究証實二者具有抗癌性和抗發炎之特性。因此本研究主要探討熊果酸與鼠尾草酸，對瘦體素所誘發之大鼠血管平滑肌細胞增生的影響。我們的結果顯示，在體外試驗上熊果酸與鼠尾草酸皆具有抗氧化的能力，而鼠尾草酸另有清除 DPPH 自由基的能力。在細胞試驗上，熊果酸和鼠尾草酸能有效地抑制瘦體素所誘發之大鼠血管平滑肌細胞的增生，而由明膠蛋白酵素電泳法和西方點墨法，証實熊果酸和鼠尾草酸能降低由瘦體素所誘發之基質金屬蛋白酶-2 的分泌和表現，並且也能降低瘦體素所誘發之 ERK 1/2、轉錄因子 NF-κB p50、p65 的表現和活性氧化物族群 (ROS) 的. VIII.

(10) 產生。由這些結果証實馬鬱蘭中的熊果酸和鼠尾草酸可預防瘦體素所誘發動脈粥狀硬化所導致的血管細胞增生，因此在未來，馬鬱蘭在預防心血管疾病上扮演著重要的角色。. IX.

(11) 英文摘要 The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is critical in vascular remodeling associated with atherosclerosis. Leptin, a circulating peptide hormone produced by adipocytes, regulates body weight by effects on food intake and metabolism. Accumulating evidence suggests that high concentrations of leptin observed in obesity and diabetes may contribute to their adverse effects on cardiovascular health. In vitro proatherogenic effects of leptin include endothelial cell activation, smooth muscle cell proliferation and migration. In vivo, leptin receptors are expressed in vascular cells.. Origanum majorana L. herb also called mint flower, a traditional spice for cooking, is produced as tea or vinegar on market in Taiwan. Carnosic acid (CA) and ursolic acid (UA) are two natural antioxidants from Origanum. majorana L. They can also be found in a large variety of plants and vegetarian foods and have been reported to exhibit anticancer and anti-inflammatory properties. In this study, we investigated the effect of UA and CA on proliferation of rat VSMCs induced by leptin.The results indicated that both of these two compounds have antioxidant activities by trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) in vitro. CA could scavenge DPPH free radicals. X.

(12) capacities. The proliferation assay showed the UA and CA effectively inhibited the leptin-induced proliferation of Rat VSMCs. UA and CA lowered the leptin-induced secretion and expression of MMP-2 by gelatin zymography and western blot assays, respectively. Moreover, both of them also decreased the expression of ERK1/2 and nuclear translocation of nuclear factor- kappa B (NF-κB ) p50, p65, and ROS production. These results indicated that UA and CA may prevent proliferation of VSMCs, therefore, they might prevent the development of atherosclerosis. The Origanum majorana L. has a potential role on the prevention of cardiovascular disease in the future.. XI.

(13) 英文縮寫 CA : Carnosic acid UA : Ursolic acid VSMCs : Vascular smooth muscle cells DMEM : Dulbecco’s Modified Eagified Eagle’s Medium FBS : Fetal bovine serum PBS : Phosphate buffered saline TEAC : Trolox equivalent antioxidant capacity ABTS : (2,2–azino-bis〔3-ethylbenzthizazoline-6-sulfonic acid〕) Trolox : 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid DPPH : α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl MMP : Matrix Metalloproteinase ROS : Reactive oxygen species MAPK : Mitogen activated protein kinase ErK 1/2 : Extracellular signal-regulated kinase 1/2 NF-κB : Nuclear factor kappa B β-actin : beta-Actin. XII.

(14) 第一章前言. 代謝症候群 (Metabolic syndrome) 又稱做 X 症候群 (Syndrome X)，在臨床上發現肥胖症、高血壓、血脂異常、胰島素拮抗 (Insulin resistance)、高尿酸血症等代謝異常，會直接或間接的提高罹患心血管疾病的發生 (151)。動脈粥狀硬化是一種慢性發炎的結果，是造成心血管疾病 (包括: 中風、冠心病) 的主因，當低密度脂蛋白受氧化後，誘發細胞激素 (例如: Leptin、TNF-α)、黏附分子 (Adhesion molecules)﹝例如: ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1)﹞、趨化因子 (Chemokine)﹝例如: MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1)﹞等基因的表現，導致泡沫細胞的形成，造成平滑肌細胞的增生與遷移，進而誘發動脈粥狀硬化 (16, 62, 69)。而肥胖是導致動脈粥狀硬化的重要危險因子之一，當飲食攝取的熱量超過身體消耗的熱量時，經生理代謝後轉變成脂肪的型式儲存並堆積在皮下、內臟器官和腹部等，造成肥胖 (170)，且脂肪組織會釋放多種胜肽 (peptides) 、補體因子 (complement factors) 及細胞激素 (cytokines) 進入循環，瘦體素就是脂肪組織分泌的細胞激素之一，會經由下視丘來調控食物的攝取、能量的消耗以及體內的代謝 (34)，最近的研究也有指出瘦體素與冠狀動脈心臟病的相關性，若體脂肪愈多，瘦體. 1.

(15) 素分泌也越多，且由於肥胖的人下視丘會對瘦體素有阻抗的現象，因此肥胖的人血清瘦體素的含量較一般正常人高 (34, 110)。另外瘦體素被認為是導致肥胖和動脈粥狀硬化的重要因子，並促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的增生和遷移 (100, 115)。自由基在正常的情況下，能保護身體免於細菌、微生物等有害物質的侵害，但若是自由基過量時，會去攻擊細胞，促使核苷酸、蛋白質、脂肪的代謝異常，導致細胞產生突變而引發疾病 (74)，而且氧化壓力 (oxidative stress) 可能是促成動脈硬化形成的原因之一 (67, 167)。因此在許多文獻上顯示出多酚類化合物具有抗氧化、抗發炎、抗腫瘤等特性(5, 20, 81, 129, 192)，因此若能透過一般飲食攝取這些有效的多酚類物質，也許能調節生理機能、降低自由基的發生，進而預防疾病的發生。在許多心血管疾病形成的過程中，造成血管內層增厚的主要原因包含平滑肌細胞從血管內層遷移至外膜和增生 (101)，因此在各種不同的細胞 (如: 巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞)，ROS 也可被視為是訊息傳遞的調節者，調節下游增生相關的基因表現，例如: ERK1/2、NFκB，進而調控基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinases-2, MMP-2 ) 蛋白質的分泌與表現，導致動脈粥狀硬化的形成 (100)。因此本研究的目的，利用瘦體素來誘發大鼠血管平滑肌細胞增生的. 2.

(16) 模式，探討在給予馬鬱蘭植物中的兩種主要酚類物質，鼠尾草酸 (carnosic acid, CA) 和熊果酸 (ursolic acid, UA) 是否能有效降低由瘦體素誘發大鼠血管平滑肌細胞的增生以及抑制活性氧化物族群 (Reactive oxygen species, ROS) 的生成和增生相關的訊息調控基因 (ERK1/2、NFκB、MMP-2) 蛋白質的表現。. 3.

(17) 第二章文獻回顧. 一、動脈血管壁基本構造. (一) 內膜 (intima): 靠近管腔的一層，富含膠原纖維，表面為內皮細胞，下方有薄層結締組織 (connective tissue) 及少量彈性纖維 (elastan fibers)。而內膜非常光滑，因此主要功能在於調控血液的流動，但當內膜損傷時，在局部就會引發凝血的狀態，而形成血栓。動脈粥狀硬化時的病變主要多發生於此層 (109)。. (二) 中膜 (media): 由平滑肌細胞 (smooth muscle cells, SMC)、internal elastic lamina 和膠原纖維組成，血管的彈性與收縮取決於此層結構，是血管壁中所佔體積比例最大的一層 (109)。. (三) 外膜 (adventitia): 為管壁的最外面一層，由 connective tissue 所組成。. 4.

(18) 二、動脈粥狀硬化形成的原因. 動脈粥狀硬化的形成主要包刮四個階段。分別為(1)內皮功能不良 (endothelial dysfunction)、(2)脂肪條形成 (fatty-streak formation)、(3)複雜的動脈粥狀硬化損傷的形成 (formation of an advanced, complicated lesion of atherosclerosis)、(4)不穩定的纖維斑塊形成 (unstable fibrous plaques in atherosclerosis)。. (一) 內皮功能不良 (endothelial dysfunction) 動脈粥狀硬化的發生是一個複雜且漸進式的致病過程。當血管內皮細胞 (endothelial cell) 受到損害時，血管腔 (vascular lumen) 間隙增加，使得低密度脂蛋白容易進入內皮細胞下間隙 (subendothelial space) 和內膜層，之後受到內膜中內生性的氧化因子如：骨髓過氧化酶 (myeloperoxidase)、一氧化氮合成酶 (nitric oxidesynthase) 以及血管壁所分泌的活性氧化物族群 (reactive oxygen species, ROS) 氧化後形成氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) (76, 77, 91)，而 ox-LDL 的組成包括: oxidized phospholipids、phosphatidyl choline、modified apoB proteins、oxidized lipids 等，由於其具有細胞毒性，因此會促使血管內皮細胞（endothelium cell）. 5.

(19) 損傷，使內皮功能失調 (80)。當 cx-LDL 形成後會使白血球粘附分子 (1eukocyte adhesion mo1ecules) 及內皮細胞黏附分子 (endothelial adhesion molecules) (如: ICAM－1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin) 分泌增加 (30, 36, 43)，並吸引單核球細胞黏附於血管腔表面，接著血管內皮細胞或 ox-LDL 所誘發的趨化分子 (chemotactic molecules) 如：MCP-1，MCP-1 接受器 CCR-2 (CC chemokine receptor) 的作用，而將單核球細胞轉移進入血管內膜 (16, 62, 69)。. (二) 脂肪條形成 (fatty-streak formation) 遷移入內膜的單核球，會變成活化的巨噬細胞 (marcophage)，並在單核球群落刺激因子 (monocyte colony stimulating factor, M-CSF) 的刺激下而加速分化成為巨噬細胞，並增加清道夫受體 (scavenger receptor) 的表現 (例如: SRA，CD36)，與 ox-LDL 結合而增加巨噬細胞的吞噬，形成泡沫細胞(foam-cells)，在動脈粥瘤 (atheroma) 中的巨噬細胞還會分泌許多生長因子 (growth factor) 和細胞激素 (cytokine)，促進巨噬細胞的增生，使得傷害繼續進行並複雜化，而 granulocyte-macrophagec colony-stimulating factor (GM-CSF)，會刺激平滑肌細胞的增生與促使動脈粥瘤的發炎反應加劇 (82, 101, 162)。接著血管壁中層的平滑肌細胞，受. 6.

(20) foam cells 釋放的物質如: 纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)、血小板源生長因子 (platelet-derived growth factor, PDGF)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) (14)、介白素-2 (interleukin-2, IL-2)、介白素-15 (interleukin-15, IL-15) 等因子刺激後，會往血管內層遷移 (migration) 並增生 (proliferation)，以及造成血小板的黏附、聚集、T 細胞的活化，並伴隨著發炎反應的發生，而這些堆積的泡沫細胞、單核球細胞與大量的平滑肌細胞，共同形成所謂的脂肪條 (fatty streak) (101)。. (三) 複雜的動脈粥狀硬化損傷的形成 (formation of an advanced, complicated lesion of atherosclerosis) 巨噬細胞會與 intima 中 T cell 作用，使得 Th1、Th2 細胞造成一連串的免疫反應 (immunologic responses) (73)，受到細胞激素 TNF (tumor necrosis factor)、介白素-1 (interleukin-1, IL-1) 等因子的影響，使得血管平滑肌細胞增生並轉移至 intima 。並且也開始合成細胞外基質蛋白 (extracellularmatrix proteins) 促使在血管腔形成纖維帽 (fibrous cap)，並覆蓋著白血球、脂質、巨噬細胞及細胞壞死 (necrosis) 殘骸，漸漸的形成壞死的區域 (necrotic core)，發展成動脈粥狀硬化斑塊 (plaque) (59)。. 7.

(21) (四) 不穩定的纖維斑塊形成 (unstable fibrous plaques in atherosclerosis) 壞死核心區產生鈣化 (calcification) ，而形成所謂的硬化斑塊 (plaque)，持續的緩慢生長、增大突出於動脈管腔 (lumen)，導致破裂並引起血小板 (platelets) 的吸附聚集。接著受到活化的巨噬細胞會分泌 MMPs 來分解細胞外的基質，並促使纖維帽變薄，硬化斑塊結構改變、破裂 (rupture)，如此反覆的 rupture、凝血 (coagulation)，使得血塊增大而阻塞動脈管徑，造成血流量減少、血流變慢，最後形成血管栓塞 (thrombosis) (43)。. 三、自由基與動脈粥狀硬化. 自由基是指在電子軌域中具有一個或多個不對稱的分子、原子或離子。當分子有不對稱的電子圍繞在外層軌域上時，則會迅速的攻擊周圍的分子，引發一連鎖反應鏈 (free-radical chain reaction) (72)，並引起化學變化對細胞造成傷害。不過當在正常的情況下，自由基是能保護身體免於細菌、微生物等有害物質的侵害，但若是自由基過量時，便會去攻擊細胞，促使核苷酸、蛋白質、脂肪的代謝異常，導致細胞產生突變而引發疾病 (74)。. 8.

(22) 在生物體內可產生許多種類的自由基，最簡單的為氫原子 (H‧) ，其他可分為四類：（1）以碳為中心之自由基，例如: CCl3‧；（2）以氧為 -. 中心之自由基，例如: 超氧自由基 (O2 ‧)、氫氧自由基 (OH‧) 或單氧自由基 (RO‧)；（3）以氮為中心之自由基，例如: 一氧化氮自由基 (NO‧)；（4）以硫為中心之自由基，例如: RS‧(71)。許多的研究顯示，氧化壓力 (oxidative stress) 可能促成動脈硬化的形成，而氧化壓力的調節者 (modulators) 包含有: 高膽固醇血症、高血壓、高血糖、老化、病原的免疫反應 (immune responses to pathogens) 、自體免疫疾病 (autoimmune disease)、抗氧化劑等 (139)。而體內會產生 ROS，包括含氧 -. 自由基 (O2 ‧、OH‧或 RO2‧、RO‧) 與含氧之非自由基 (HOCl、 H2O2)。在各種不同的細胞 (如: 巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞)， ROS 也可作為訊息傳遞的調節者 (66)，而 ROS 的生成來自各種氧化酶的作用，例如 (NADPH oxidase 、 cyclooxygenase、 lipoxygenase) (7)。其中以 NADPH oxidase 在誘發血管細胞 ROS 的產生上扮演重要的關鍵，因為 NADPH oxidase 會使得 O2 轉換成 O2‧，進而再產生 H2O2。當 ROS 生成增加和抗氧化酵素（Cu/Zn SOD，GSHPx）的活性下降時，則會使細胞內的氧化壓力增加，而氧化壓力與動脈硬化之形成具有顯著的相關性 (67, 167)。. 9.

(23) 在平滑肌細胞方面，氧化的訊息傳遞 (oxidant signaling) 是細胞生長、死亡所必須的 (83)，因此不論是動脈硬化或是血管再狹窄，ROS 在血管平滑肌細胞的增生與遷移均具重要的影響力 (154, 173)。. 四、發炎、Nuclear factor-kappa B (NF-κB) 與動脈粥狀硬化. (一) 發炎反應當血管組織受到外來的攻擊、損傷時，血管內的白血球會聚集到受威脅的組織內，並分泌化學物質以進行防禦的作用，而造成組織的發炎反應。動脈粥狀硬化的形成是一種慢性發炎的結果，是修飾後的脂蛋白、單核球衍生的巨噬細胞、T細胞、黏附分子與血管正常的細胞，相互的影響所導致。CRP (C-Reactive Protein）是屬於一種急性反應產物，在許多發炎相關的疾病病患血液中發現有高濃度的 CRP (44)。最近研究亦顯示，CRP 可能與早期發炎反應具相關性。而 CRP 亦會刺激單核球細胞釋放前發炎因子-細胞激素，如: IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α (9, 87)。並且刺激內皮細胞表現黏附因子: VCAM-1、ICAM-1 (142)。近年來的研究也發現在血管組織存在著 CRP，同時亦影響白血球的堆積 (180)，因此認為 CRP 在動脈斑塊上形成上可能為一種內生性活化物。而此種發. 10.

(24) 炎的過程可能最終會發展成複雜的損傷，或是生成突出於動脈的斑塊，阻礙血流 (131, 154, 168)。在流行病學的調查發現，造成動脈粥狀硬化的原因是與環境中的危險因子﹝例如: 一氧化氮 (NO)﹞有著重要的相關性 (101)。氧化態的 LDL 具發炎性，會造成慢性的血管發炎，並刺激血管內皮細胞產生黏附分子，使血液中之單核球和白血球附著到血管壁，此時血管壁之內皮細胞和平滑肌細胞也會釋放出趨化因子，吸引免疫細胞移至免疫反應的部位，參與免疫調節及生理反應，並同時附著到血管壁之 T 淋巴球進一步再釋放細胞激素，使血管之發炎更趨嚴重 (101)。而高血清膽固醇可能是造成人類和實驗動物動脈粥狀硬化的原因之一，可能還有其他未知的危險因子也會導致動脈粥狀硬化。而斑塊破裂的區域中含有大量的發炎細胞，且亦發現巨噬細胞會分泌 MMPs， MMPs 會造成內皮細胞基底膜分解，內皮細胞間質結構退化不完整，使得斑塊上的纖維帽變脆弱，斑塊分裂造成血栓，因而認為降低基質金屬蛋白酶的活性是可以影響到斑塊的穩定性 (22, 57) 。因此發炎 (inflammation)、感染反應 (infection respond)、免疫系統 (immune system) 在整個動脈粥狀硬化形成過程上可能扮演極重要的相關聯性。. 11.

(25) (二) NF-κB (nuclear factor-kappa B) 轉錄因子會調節膽固醇的平衡、發炎反應和動脈粥狀硬化在血管內皮細胞、平滑肌細胞上的影響，並說明了一個可能的治療方向。而轉錄因子可能影響新陳代謝的酵素並且調節大多數的基因。例如: NF-κB (nuclear transcription factor-kappa B) 可調節基因、控制發炎、免疫反應且與動脈粥狀硬化的發展有著重要的相關性 (68, 89, 122, 178)。 NF-κB 是一種蛋白質分子，由 p50 kDa (p50)、 p65 kDa (p65; Rel A) 兩個次單元體所組成，為一種體內的生物誘導分子 (biological trigger)，平時與 IκB 相互結合，此結合會使 NF-κB 失去活性，亦有文獻指出，IκB 在血管平滑肌細胞增生上，可能扮演一個調節活化 NF-κB 關鍵性的角色 (79)，因此一旦受啟動訊號刺激後，IkB kinase (IKK) 會磷酸化 IκB，而 IκB 會脫離 NF-κB，使得 NF-κB 恢復活性，則 p65、 p50 進入細胞核與 promote 結合，釋出 mRNA 來合成蛋白質 (86, 132)。在氧化敏感性過程 (oxidation sensitive pathways) 中 NF-κB 扮演一個重要的角色，因其可調節白血球黏附因子，ICAM-1、VCAM-1、PCAM-1 (platelet endothelial cell adhesion)、P-selectin 與 E-selectin (109)，和趨化因子、生長促進因子、促發炎因子 (proinflammatory) 和促血栓形成因子 (prothrombotic factor) (31) 等，而這些因子都與動脈粥狀硬化的形成有. 12.

(26) 關。因此抗氧化劑的補充可抑制 NF-κB 在巨噬細胞與內皮細胞 (endothelial cell) 的活性 (49)，同時由抑制 LDL 氧化或降低 ROS 的生成，以預防動脈粥狀硬化早期的發生(31)。. 五、肥胖、瘦體素與代謝症候群. (一) 代謝症候群代謝症候群 (Metabolic syndrome) 又稱做 X 症候群 (Syndrome X)，在臨床上發現肥胖症、高血壓、血脂異常、胰島素拮抗 (Insulin resistance）、高尿酸血症等代謝異常，亦即在同一個人身上存在二個以上的生理代謝異常的現象，並且會直接或間接的提高罹患心血管疾病發生 (151)，至今此症狀也被稱為胰島素阻抗症候群 (Insulin resistance syndrome)、代謝異常症候症 (Dysmetabolic syndrome)、多項代謝症候 (plurimetabolic syndrome) 或致死性四重奏 (Deadly quartet) 等 (70, 85)。. (二) 肥胖行政院及國際肥胖專案小組 (IOTF) 對肥胖的定義是: (1)過重：24 2. 2. ≦BMI＜27kg/m ；(2)輕度肥胖：27≦BMI＜30 kg/m ；(3)中度肥胖：30 13.

(27) 2. 2. ≦BMI＜35 kg/m ；(4)重度肥胖：BMI≧35 kg/m 。腰圍則男性大於90公分與女性大於80公分定義為肥胖 (19)。肥胖的形成原因是相當複雜的，在飲食攝取的熱量超過身體消耗的熱量，經生理代謝後轉變成脂肪的型式儲存並堆積在皮下、內臟器官和腹部等，其中又以內臟器官和腹部的脂肪組織對健康影響較嚴重 (170)。而影響熱量不平衡的三大因素為食物的攝取、體內代謝速率以及身體活動量，而肥胖是罹患心血管疾病、高血壓、糖尿病、痛風、大腸癌、乳癌等疾病的危險因子 (95)，Framingham (2002) 研究發現過重的人產生心血管疾病之相對危險性，在男性為1.21倍，在女性為1.20倍；肥胖者產生心血管疾病之相對危險性，在男性為1.46倍，在女性為1.64倍，而當男性體重增加20%時，罹患冠狀動脈心臟病的危險性增加86%，肥胖婦女得冠狀動脈心臟病的機率則是正常體重婦女的3.6倍 (88)。另外脂肪組織還會釋放多種胜肽 (peptides)、補體因子 (complement factors) 及細胞激素 (cytokines) 進入循環 (2)，而這些因子就是肥胖造成糖尿病與心血管疾病等的主要因素 (60)，因此都再次的顯示出肥胖對心血管疾病的影響性。. 14.

(28) (三) 瘦體素 (Leptin) 瘦體素這個荷爾蒙是由167個胺基酸所組成的 (113)，是脂肪細胞上分泌的荷爾蒙 (97)，最先是在 ob/ob 老鼠身上所發現的 (193)。ob/ob 老鼠是一種先天肥胖的老鼠，他們在 ob/ob 老鼠身上發現一種由 ob 基因控制合成的蛋白質，他們把這種蛋白質稱之為瘦體素。ob/ob 老鼠與體重正常的老鼠比較明顯地缺乏瘦體素。另一種肥胖老鼠 (db/db) 老鼠體內瘦體素的量卻是過高的。又有研究發現人類肥胖者血液中瘦體素濃度比較高，且瘦體素的量與體脂肪量成正相關，因此人類的肥胖症與 db/db 老鼠類似，而 db/db 老鼠是因為體內缺乏瘦體素接受器 (Leptin receptor)，因此瘦體素濃度增高 (1, 34)。一般相信瘦體素是傳遞身體中的脂肪量，到下視丘的訊息荷爾蒙，當身體脂肪過多時，體內白色脂肪組織分泌的瘦體素濃度增加，表示血清瘦體素濃度和體脂肪含量之間有高度的相關性 (2)，不過在胃的上皮細胞和胎盤也會分泌少量的瘦體素 (118)，正常血清瘦體素值: 成人男為 0.66 ～ 5.63 ng/ml ，成人女為 2.67 ～ 13.66 ng/ml; 兒童男為 0.78 ～ 7.42 ng/ml，兒童女為1.64～10.91 ng/ml，另外也有研究發現女性血清瘦體素濃度比男性高出3到4倍 (102)，因此例如: 正腎上腺素、胰島素以及類固醇荷爾蒙、生長荷爾蒙、雌激素等因子會刺激脂肪組織中瘦體素的合成. 15.

(29) 與分泌 (32, 33)。瘦體素經由下視丘來調控食物的攝取、能量的消耗以及體內的代謝，並且也是代謝速率上的神經傳導物質 (190)。正常狀態下，當瘦體素濃度增加，瘦體素會提高與下視丘 Leptin receptor 的作用，並促使神經肽 Y (Neuropeptide Y, NPY) 的分泌減少，而提高交感神經系統的活性，於是棕色脂肪組織的產熱作用增加，另一方面瘦體素會抑制食慾中樞，故食物攝取減少之後，胰島素分泌則減少，脂肪的合成也會減少 (34)。最近的研究也有指出瘦體素與冠狀動脈心臟病的相關性，若體脂肪愈多，瘦體素分泌越多，因而抑制進食，達到飲食與體脂肪的平衡，但當整個內分泌系統平衡失調，則在循環中便會出現負性回饋作用，導致熱量攝取過量、引起脂肪堆積，造成不同程度的生理影響，例如: 肥胖 (97)。先前的研究中發現到，肥胖者體內尚存有著瘦體素，因此人類 ob 基因突變的機率很少 (21)。但是因 Leptin receptor 突變所引起的肥胖者，卻有高的瘦體素濃度，而這 Leptin receptor 是可以與瘦體素結合在一起的，只是不具有訊號傳遞的功能 (29)，不過血清瘦體素濃度與體脂肪、體脂肪百分比以及脂肪含量呈正相關 (110, 153)，因此人類的肥胖與瘦體素的不敏感性有關。另外瘦體素就像是 CRP 控制 ET-1 (endothelin-1) 和內皮細胞 NO 合成酶的生成以及導致 ROS 的累積 (94)。它會促進內皮細胞 (141) 和血管平滑肌細胞 (4) 的增生和遷移。. 16.

(30) 而 MCP-1在動脈內皮細胞上的表現是由於受到了瘦體素的刺激 (189)。因此瘦體素經由瘦體素接受器的依賴路徑 (Leptin receptor-dependent pathway) 會增強斑塊的聚集和動脈血栓的形成 (94)，也會透過 M-CSF 的釋放而直接作用於巨噬細胞上 (107) 以及在高葡萄糖情況下提高巨噬細胞中膽固醇的堆積 (136) 和促進血管新生作用 (164)。. (四) 瘦體素與肥胖估計全世界有十憶的人口有過重的現象，而有三百萬的人口有肥胖的現象。肥胖是現在唯一認為會造成許多代謝症候群的主因。對大部分造成代謝症候群而言，動脈粥狀硬化是個獨立的危險因子。然而，在肥胖人身上常會伴隨有冠心病的發生 (40, 45, 112, 123)。有越來越多研究指出脂肪組織 (adipose tissue) 所分泌的荷爾蒙 adipokines 與肥胖是有相關性的，另外瘦體素是在脂肪組織上第一個被認為導致肥胖和動脈粥狀硬化的重要因子，一般來說，血清瘦體素值在肥胖人身上通常是高的，且它與身體質量指數、身體脂質百分率以及大部分的脂質是有明確的關連性 (34, 110)。雖然瘦體素扮演一個造成動脈粥狀硬化發生的角色，但大部分肥胖的人下視丘會對瘦體素有阻抗的現象，而有關肥胖人周圍瘦體素的影響. 17.

(31) 目前仍不清楚 (115)。根據之前的假說認為在肥胖人身上觀察到瘦體素的阻抗而導致無法抑制食慾。因為瘦體素被認為是很可能造成前動脈粥狀硬化的原因，高瘦體素血症也可能造成其影響 (115)。先前研究顯示胰島素 (insulin) 會增加脂肪細胞分泌瘦體素，因此血漿中瘦體素與胰島素的相關性值得注意，而由於胰島素的阻抗和高胰島素血症的發生，使瘦體素很難排除與動脈粥狀硬化的相關性，所以瘦體素可能被認為是造成動脈粥狀硬化、高血壓和糖尿病的危險因子之一 (39, 119)。動脈粥狀硬化的形成上，發炎扮演一個重要的角色 (103, 191) 。因此發炎系統特別是 CRP 都是造成冠心病的危險因子，CRP 可能會影響內皮細胞 NO 的產生、活化血管平滑肌細胞、促進單核球黏附到內皮上 (185)。血漿中的瘦體素被證實與急性期的反應物 CRP、serum amyloid A (SAA) protein 具相關性，而這是在正常體重和肥胖人身上所觀察到的，因此瘦體素可能與前發炎以及肥胖有關 (90, 183)。. 六、瘦體素與血管平滑肌細胞. Oda (138) 等人是第一個証實瘦體素的接受器會表現在血管平滑肌細胞 (VSMC) 上，且在體外試驗顯示隨著瘦體素的劑量濃度增加，會促. 18.

(32) 進大鼠動脈 VSMC 的遷移和增生。而瘦體素所造成的增生在人類的動脈 VSMC 也觀察到 (100)。在先前瘦體素促進增生研究上提出，透過細胞蛋白質與 DNA 的比率增加，而證實瘦體素會促進 VSMC 的增生 (163)，而對 VSMC 的遷移表現上則是藉由活化 PI3K 路徑 (138) 、 JAK2 路徑以及細胞外的訊號調控激酶 (163)。另外瘦體素會促進人類 VSMC 上基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinases-2, MMP-2 ) 的表現 (12, 100)，MMP-2在 VSMC 從中膜遷移至內膜和斑塊破裂扮演著重要角色 (38)。瘦體素也會促進人類臍靜脈內皮細胞 ET-1的合成和分泌，在有冠心病的肥胖人身上 ET-1是會影響血管細胞粒腺體的表現增加，而 ET-1是一種造成血管收縮的物質，可促進血管平滑肌細胞分裂、增生 (41)。. 七、細胞外信號調節激酶 (ERK 1/2) 與動脈粥狀硬化. 細胞可以辨識並經由細胞內的特殊調控而反應到細胞外，例如訊號放大效應 (signaling cascade)，導致活化細胞有絲分裂之蛋白質激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs)。所有的真核細胞都有複雜的 MAPKs 路徑，同樣的都是在調控細胞的活化，一連串的從基因表現、. 19.

(33) 細胞的有絲分裂、新陳代謝、存活、凋亡以及分化。至今 MAPKs 在哺乳動物上分成五組 : (1) 細胞外的訊號調控激酶. Extracellular. signal-regulated kinases (ERKs) 1和2 (ERK1/2 ; p42/44 MAPK)，(2) c-Jun amino-terminal kinases (JNKs) 1、 2和3，(3) p38 isoforms α、β、γ和δ， (4) ERKs 3 and 4，(5) ERK5 (27, 96)。MAPKs 可以經由廣泛不同的刺激而被活化，在生長因子刺激下 ERK1和 ERK2首先被活化，而當滲透性的撞擊、輻射和細胞激素等壓力的促進下，使得 JNK 和 p38 kinases 因而活化 (143)。 ERK 1/2是屬於分裂原型 (mitogen) 激酶，是一種 Ser/Tyr 雙磷酸化蛋白酶 (serine/ threonine protein kinase)，由 (1) MAPKKKs A-Raf、B-Raf、和 Raf-1、(2) MAPKKs MEK1和 MEK2、(3) MAPKs ERK 1和 ERK 2所構成的。ERK 1和 ERK 2含有83%的胺基酸，並且廣泛的表現在所有的組織中 (27)。當細胞受到生長因子、細胞激素、病毒感染、滲透性的壓力、血清、phorbol esters 等刺激作用下，會活化 ERK1/2訊號傳遞路徑，而活化的 ERK 1/2會形成同型二聚體 (homodimer) 進入到細胞核內，並磷酸化及活化轉錄因子，影響下游的基因的表現，造成細胞的多種反應，例如細胞增生、細胞分化、細胞凋亡等。ERK 1/2普遍的存在於細胞中，值得注意的是堆積在細胞核中，當 p42/44 MAPK 被活化，會誘導細胞. 20.

(34) 內基因的表現，這通常和細胞的生長和分化的過程有關 (26, 61, 99)。而 ERK 1/2的訊號活化被認為是在細胞增生的調控關鍵，因此，在臨床的試驗可經由抑制 ERK 的傳遞路徑，而達到抗癌的作用 (92)。在許多心血管疾病形成的過程中，造成血管內層增厚的主要原因包含平滑肌細胞從血管內層遷移至外膜和增生，並且在動脈硬化疾病的發展上，血小板和白血球、細胞外的間質 (extracellular matrix components) 和生長激素的釋放，都可能促進了平滑肌細胞的型態轉變與增生 (155)。. 八、基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases ; MMPs). 血管中層的主要細胞為平滑肌細胞，而平滑肌細胞有分成收縮態 (contractile) 和合成態 (synthetic) 兩種表現型 (179)，當血管於正常情況下，平滑肌細胞會保持在收縮態，但當受到傷害時，則會轉變成為合成態，此時細胞外基質蛋白 (extracellular matrix protein) 和生長激素的分泌會增加，導致平滑肌細胞的增生和遷移，這是造成血管內膜增厚的主要原因之一 (161)。然而在許多生理過程中，細胞外基質 (extracellular Matrix, ECM) 的分解是必要的，基質金屬蛋白酶是一群需要鋅和鈣離子的內胜肽酶，可與細胞外的基質結合，修飾組織的完整結構，因此適量分泌基. 21.

(35) 質金屬蛋白酶可用來維持正常的生理狀態，包含: 細胞胚胎時的生長、細胞的遷移 (35, 51)。但大量分泌時，則會導致疾病的發生 (47)，例如: 發炎現象、心血管疾病、血管新生 (angiogenesis)、癌細胞的生長及轉移等，並且也有研究指出動脈硬化會受到基質金屬蛋白酶的調控。MMPs 可分成六組: (37) (1) 膠原蛋白酶 (collagenases): 包括 collagenase-1 (MMP-1)、collagenase-2 (MMP-8)、collagenase-3 (MMP-13) 與 collagenase-4 (MMP-18)，可分解膠原蛋白 (collagen) type I、II、III、V。 (2) 明膠分解酶 (gelatinases): 包括 gelatinase A (MMP-2; 72 kDa) 、 gelatinase B (MMP-9; 92 kDa)。可分解明膠 (gelatin)、彈性蛋白 (elastin) 和粘連蛋白，由於 gelatin 是細胞外基質中主要組成的物質，因此 gelatinases 在所有基質金屬蛋白酶中，被視為與心血管疾病有著重要的相關性 (55)。 (3) 基質溶解素 (stromelysins): 包括 stromelysin-1 (MMP-3)、stromelysin-2 (MMP-10)、stromelysin-3 (MMP-11)。可分解 collagen、fibronectin 和 elastin。 (4) (matrilvsin) : MMP-7、MMP-26。 (5) 金屬彈性蛋白酵素 (metalloelastase): MMP-12 (22 kDa)、MMP-19、. 22.

(36) MMP-20、MMP-21、MMP-23、MMP-28。 (6) 膜型基質金屬蛋白酶 (membrane-type matrix metalloproteinases ; MT-MMPs): 包括 MT1-MMP (MMP-14) 、 MT2-MMP (MMP-15) 、 MT3-MMP (MMP-16) 和 MT4-MMP (MMP-17)、MMP-24、MMP-25，可分解 collagen，幫助其他 MMP 的活化 (37, 159)。而在斑塊破裂的地方有發現到由巨噬細胞所分泌的基質金屬蛋白酶 (159)。在 Losartan (140) 等人的研究上提出在人類血管平滑肌細胞上，MMP-2的活性明顯增強，且會隨著年齡的增加而增加 (120)，並在體內能夠持續性的表現，由於能分解 gelatin 和血管基底膜 (vascular basement membrane)，因此會影響血管細胞外基質的重塑 (remodeling) 以及調控細胞的增生、黏附、遷移作用。所以要穩定斑塊可經由降低細胞外的基質蛋白的活化 (22, 57)。因此改變 MMP 的表現或活性可能在臨床上具有療效作用 (59)。至今在動物試驗模式上 MMP 是否會經由對斑塊的破裂和凝血系統，而更進一步的造成動脈損傷和急性栓塞的影響，目前還未被證實 (98)。從一些凝血因子，包含有纖維蛋白原、凝血因子VII都與增加冠心病有關。在人類複雜的動脈損傷過程中，觀察到有纖維蛋白的堆積，而當溶血的活性降低，則會增加動脈粥狀硬化血栓的形成 (98)。在體外的研. 23.

(37) 究也証實 MMP 的活化，可能會發展成急性冠狀動脈疾病。因此在動脈硬化及心血管疾病發生的過程中，MMP-2可能扮演著一個重要的角色。. 九、簡介馬鬱蘭. 雖然氧氣對需仰賴氧而生存的環境下是最重要的元素，但是它也參與許多的化學毒性反應。尤其是脂質過氧化作用，此作用會引起食物的毒性反應。因此要預防這樣的反應，可以由食物獲取天然的抗氧化劑，來預防氧化上的傷害 (181)。馬鬱蘭 (Origanum majorana L.)，又稱為薄荷花，市上有做為茶葉等產品，它的植物遍及於全世界，化合物包含有酚萜類 (phenolic terpenoids) 、黃酮類 (flavonoids) 、丹寧酸 (tannins) 、酚苷 (phenolic glycosides) 等 (6, 135)。馬鬱蘭一般做為食品及藥品使用上是安全的，而馬鬱蘭對於能抗病毒、殺菌、抗菌、防黴等作用，主要受其中成分之一熊果酸的影響 (8, 134, 184)。在身體療效方面，馬鬱蘭有助於治療憂鬱症、頭暈、頭痛、胃腸不適、神精緊張、咳嗽和利尿等作用 (182)。在最近的研究有提出馬鬱蘭具有抗氧化及抗腫瘤的作用 (20, 78, 192)，並且還可抑制脂質過氧化、提昇免疫力、增強肝、腎、肺、心臟、大腦等. 24.

(38) 內生性的抗氧化物質、降低高血壓、貧血、肝腎功能不良、血管功能異常等 (46, 145, 194)。來自馬鬱蘭 (Origanum majorana L.) 中的抗氧化物質是可用乙醇、n己烷和二氧化碳萃取出來。包含鼠尾草酸 (carnosic acid，CA)、熊果酸 (ursolic acid，UA ) 和鼠尾草苦內酯 (carnosol) (46)。鼠尾草 (Sage ; SalVia officinalis) 是一般常見的唇形科植物，在世界上常做為香料和藥物使用，被視為是草本植物中，例如: 鼠尾草 (sage, Salvia officinalis)、迷迭香 (rosemary, Rosmarinus officinalis) 其他雙萜烯形成的先驅物，具有很強的抗氧化能力，被廣泛的使用在食物的保存上(117, 144)。這些植物中，鼠尾草酸是主要的酚類物質，CA 是一個脂溶性的抗氧化物，可以清除單態氧、氫氧自由基和脂質過氧化自由基，因此可以預防脂質的過氧化和細胞膜的破裂 (5, 75)。而它清除自由基的機制與其他的抗氧化劑相似，例如: 維生素E，這是因為它有兩個氫氧基 (O-phenolic hydroxyl group) 分別在 C11 和 C12的位置上 (圖 4)。在體內所誘發的氧化壓力，透過 CA 的抗氧化能力，因而提高雙萜烯 (diterpenes) 的形成，例如苦內酯 (carnosol) 和迷迭香醇 (rosmanol) (127, 128)。但有些產物會降低抗氧化能力，而抗氧化的活性主要在於中斷自由基連鎖反應，是因為抗氧化劑能提供帶電原子 (H．)，使自由基趨於. 25.

(39) 穩定的原因，而來防止生物膜被氧化的作用 (116)。熊果酸 (3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid) 是個五環萜烯類酸性物質 (圖 5)，來自莓果、藥用植物的葉、花和果實中有被分離出來，例如:. Rosemarinus officinalis、Eriobotrya japonica、Calluna vulgaris、Ocimum sanctum 和 Eugenia jumbolana (104)。而在 UA 的相關研究上大多在探討抗發炎、抗腫瘤之作用，由於 UA 可間接抑制與發炎相關基因的轉錄，包括： iNOS、COX-2、lipoxygenase、MMP-9 的表現 (23, 24, 129, 152, 171, 172)，而這些基因的調控都是受 NF-κB 的影響。因此提出具有抗腫瘤的活性 (81)、抗血管新生的作用 (165) 以及可作為乙烯膽鹼的抑制劑，因而可以用來治療阿茲海默症 (Alzheimer’s disease, AD) (28)。. 26.

(40) 圖 1. 動脈血管壁的結構 ( Lusis, 2000.). 27.

(41) 圖 2. 發炎與脂肪分泌之細胞激素. (David et al., 2005.). 28.

(42) 圖 3. 動脈粥狀硬化形成假說 (Roland, 2004.). 29.

(43) 圖 4.鼠尾草酸化學結構式 (Pelillo et al., 2003.). 圖 5. 熊果酸化學結構式 (Shishir Shishodia et al., 2003.). 30.

(44) 圖 6.纖維斑塊誘發訊息調控之路徑 (Albrecht, 2004.). 31.

(45) 圖 7. NF-κB 調控路徑 (Barnes and Karin, 1997.). 32.

(46) 表 1. 脂肪激素對血管凝血與代謝系統上的影響. (David et al., 2005.). 33.

(47) 表 2. 基質金屬蛋白酶分類. (Hans-Peter Marti, 2002.). 34.

(48) 第三章實驗設計. 一、體外試驗: 測定鼠尾草酸、熊果酸的抗氧化能力，利用總抗氧化能力、清除 DPPH 自由基來測定。. 二、細胞試驗: 將大鼠血管平滑肌細胞在無血清同步化後，分別加入鼠尾草酸和熊果酸 (10、20 μmol/L)，探討抑制瘦體素 (500 ng/ml) 誘發細胞增生表現的影響，並透過西方點墨法觀察 ERK1/2、NF-κB、MMP-2 蛋白質的表現以及明膠蛋白酵素電泳法觀察 MMP-2 活性的表現。. 圖 8. 體外實驗流程簡圖. 35.

(49) 圖 9.. 細胞實驗流程簡圖. 36.

(50) 第四章材料與方法. 一、材料. (一) 儀器無菌操作檯 (NUAIRE, MN, USA) 細胞培養箱 (NUAIRE, MN, USA) 酸鹼值測定計 (HANNA, RI, USA) 去離子水製造機 (Minipore, USA) 水浴槽 (TKS, Taiwan) 微量天平 (A&D, Japan) 細胞計數器 (Boeco, Germany) 光學顯微鏡 (Motic, Japan) 加熱板 (Cornign, Taiwan) 超高速離心機 (Hamburg, Germany) 微量吸管 (Bilson, France) 分光光度計 (HITACHI, Japan) 振盪培養箱 (Orbital, VA, USA). 37.

(51) 電泳槽套組 (Bio-Rad, CA, USA) 蛋白質轉漬電泳套組 (Bio-Rad, CA, USA) ELISA reader (Bio-Rad, CA, USA) Power supply (Hoefer, CA, USA). (二). 材料. 細胞培養皿 (騰達行，Taiwan) 細胞培養盤 (騰達行，Taiwan) PVDF 轉漬膜 (Minipore, USA) 蓋玻片 (Kimble, USA) 冷凍管 (騰達行，Taiwan) 微量離心管 (季勗，Taiwan) 離心管 (季勗，Taiwan) Falcon (汎泰，Taiwan). （三）試劑 30% Acrylamide (Amresco, OH, USA) 2, 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) (Molecular Probe, OR, USA). 38.

(52) Acetic acid (Amresco, OH, USA) Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, MO, USA) Bradford (Bio-Rad, CA, USA) Chloroform (BDH, Poole, England) Fetal Bovine serum (FBS) (GIBCO, NY, USA) Carnosic acid (Sigma, MO, USA) Ursolic acid (Sigma, MO, USA) Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Amresco, OH, USA) Dodecylsulfate sodium salt (SDS) (Amresco, OH, USA) Enhanced chemiluminescence (ECL) (Upstate, CA, USA) Ethanol (景明化工，Taichung, Taiwan) DMEM (GIBCO, NY, USA) Fetal bovine serum (FBS) Gelatin (Amresco, OH, USA) Glycerol (Ameresco, OH, USA) Glyciin (Amresco, OH, USA) Hepes (Gibco, NY, USA) Methanol (Tedia, OH, USA). 39.

(53) Penicillin-streptomycin (Gibco, NY, USA) Recombinant Rat Leptin (Rocky Hill, NJ, USA) Sodium biocarbonate (Sigma, MO, USA) Sodium chloride (Sigma, MO, USA) TEMED (Amresco, OH, USA) Tris base (Amresco, OH, USA) Tris-HCl (Amresco, OH, USA) Triton X-100 (Amresco, OH, USA) Peroxidase (Sigma, , MO, USA) Trolox (Alderich, WI, USA) ABTS (Sigma, , MO, USA) Trypsin-EDTA (Sigma, MO, USA) Trypan blue (Sigma, MO, USA) Bromophenol blue (USB) NF-κB kit (TransAM, CA, USA) Tween-20 (Amresco, OH, USA) Protein maker (Amersham, UK) 脫朌奶粉 (安佳，New Zealand). 40.

(54) 顯影劑 (Kodak, USA) 定影劑 (Kodak, USA). （四）抗體一級抗體 (primary antibodies) Mouse monoclonal to MMP2 (Abcam, Cambridge, UK) Rabbit polyclonal to NF-κB p105 / p50. (Abcam, Cambridge, UK). Rabbit polyclonal to NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) Mouse monoclonal to ERK1 + ERK2 (Abcam, Cambridge, UK) Rabbit Anti-phospho-MAP kinase 1/2 (ERK1/2) (Upstate, California, CA) Mouse Anti-Actin Monoclonal Antibody (Chemicon, Temecula, USA) Mouse Anti-Human Nuclei & Chromosomes Monoclonal Antibody (Chemicon, Temecula, USA) 二級抗體 (second antibodies) Goat polyclonal to Rabbit IgG (Abcam, Cambridge, UK) Sheep polyclonal to Mouse IgG (Abcam, Cambridge, UK) 螢光二級抗體 Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa-488 (Invitrogen, Oregon, USA). 41.

(55) 二、方法. （一）鼠尾草酸、熊果酸配製方法分別秤取鼠尾草酸 (CA) 及熊果酸 (UA) 粉末並溶於 DMSO 中，配製成 100 mmol/L 備用。. （二）細胞培養來自大鼠胸主動脈之血管平滑肌細胞株 (購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心，生資中心編號 : 60127，細胞株名稱 : A 10 )。將其培養在 10 % Dulbecco’s Modified Eagified Eagle’s Medium (DMEM) 中，含有 high glucose 、L-glutamien、 pyridoxine hydrochloride、 10 mg/L sodium pyruvate，並再加入 soudium bicarbante 3.7 g、10 % fetal bovine serum (FBS)、1% Hepes Buffer Solution、1% Strpotomycin/penicilline，於 37℃，5% CO2 下。當細胞長滿約 9 分時，進行分盤。. （三）總抗氧化能力 (TEAC) 依 Miller 等 (1993) 方法，將 peroxidase 、 ABTS (2,2–azino-bis 〔3-ethylbenzthizazoline-6-sulfonic acid〕)、H2O2 混合均勻，放於 6 分鐘後，. 42.

(56) +. 待其產生藍綠色之 ABTS · 陽離子自由基，再加入 Trolox 分別與鼠尾草酸、熊果酸反應 6 分鐘，混合均勻取出至 96 孔盤中，用 ELISA (Quant， +. Bio-Tek，USA) 測量 734 nm 下的吸光值。利用 Trolox 清除 ABTS· 陽離子自由基的能力，來表示樣品的總抗氧化能力。全程需避光。. （四）清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基能力測定鼠尾草酸、熊果酸分別加入 DPPH 之甲醇溶液，混合 30 分鐘後，取出至 96 孔盤，用 ELISA (Quant, Bio-Tek, USA) 測量 517 nm 下的吸光值。吸光值低表示清除 DPPH 自由基能力愈強，以未添加 carnosic acid、ursolic acid 之吸光值為 100% 來作比較，結果以 IC 50 表示，以代表清除 50%的 DPPH 自由基所需的濃度。 DPPH‧+ AH DPPH2 + A‧. Violet decolorized. DPPH 自由基清除能力 % = [（控制組在 517 nm 下吸光值－試樣在 517 nm 下吸光值）/ 控制組在 517 nm 下吸光值 ] x 100. (105)。. （五）細胞計數試驗大鼠血管平滑肌細胞用 PBS 清洗後，加入 1X trypin-EDTA，待貼附於培養皿上的細胞懸浮後，與含血清培養基中和並移至離心管，離. 43.

(57) 心 12,000g、10 分鐘後，倒掉上清液並加入含血清培養基混勻，取出 100 μl 細胞懸浮液於 96 孔盤中，和 10μl typan-blue 混合，在血球計數盤上各打入 10μl 混合液，顯微鏡下計數 9 大格中之 5 大格 (十字) 所含細胞數目。. 放大. 計數室蓋玻片. （六）測量細胞內的 ROS 大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時。然後以 10 μmol/l 2,7-dichlorofluorescein ( DCF ) diacetate ( DCF-DA ) 與細胞一起放 37℃ 培養箱中 30 分鐘。藉由細胞內的酯解酵素作用將其變化為 DCF (Kim et al., 2006)。並透過 ROS 使的氧化成高螢光 DCF，再以微量盤螢光偵側儀 FLX800 TBI 在發光波長 485 nm 和發散光波長 528 nm 下測得吸光值 (Bio-tek, VT, USA) 。以倒立式螢光顯微鏡 OLYMPUS IX71 (Olympus America, Melville, NY) 和自冷式螢光數位 SPOT RT Color (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI) 拍照其螢光表現 (100)。. 44.

(58) （七）蛋白質定量利用 Bradford 染劑與標準品蛋白質 (0、5、10、15、20、25 μg BSA) 混合 5 分鐘後，測其 590 nm 下之吸光值，將值帶入 Excel 畫出檢量線， 2. 2. 並求得趨勢線方程式Ｒ值，Ｒ值要＞0.99 以上的準確度。樣品蛋白質濃度測定: 取 5 µl 的樣品和 495 µl 的二次水混合後，加入 100 µl Bradford 染劑，作用 5 分鐘後測其 590 nm 下之吸光值，再將測得的吸光值 (y) 帶入求得的趨勢線方程式，而計算得到蛋白質濃度 (138)。. （八）ERK1/2、NF-κB、MMP-2 之測定-西方點墨法利用大鼠血管平滑肌細胞蛋白質，測試 ERK1/2、NF-κB、MMP-2 活性的表現。將大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時。利用 lysis buffer (包含 10 mmoll Tris/HCL (pH8.0)、0.32 MOL/L sucrose、5 mmol/l Ethyienediamine Teraacetate Disodium Salt (EDTA)、1% Triton X-100、2 mmol/l 1,4-Dithio-D、L-thereitol (DTT)、1 mmol/l PMSF) 將細胞取下來，並把收下的細胞進行蛋白質定量後，配置 loading sample，並加熱 (95℃，5 分鐘)，隨即放於冰上 30 秒，則 loading 到 SDS-PAGE. 45.

(59) (9%) 中，在 100V 跑膠約 2.5 小時，待取出膠片後，把蛋白質轉漬於 PVDF 膜上，把轉漬後的 PVDF 膜放入含 5%的脫脂牛奶中，於室溫 blocking 約 1 小時，取出，以 0.1% PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，即可將膜放入含一級抗體 (Mouse monoclonal to MMP2、Rabbit polyclonal to NF-κB p105 / p50、Rabbit polyclonal to NF-κB p65、Mouse monoclonal to ERK1 + ERK2、Anti-phospho-MAP kinase 1/2、Mouse Anti-Actin Monoclonal Antibody 或 Mouse Anti-Human Nuclei & Chromosomes Monoclonal Antibody) 封口袋內，置於 4℃ 冰箱至隔天。接著再將膜以 0.1% PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘後，放入含二級抗體 (Goat polyclonal to Rabbit IgG 或 Sheep polyclonal to Mouse IgG) 封口袋內，在室溫下搖盪 1 小時，取出膜以 0.1% PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，於暗房將 PVDF 膜浸泡於化學發光試劑 (enhanced chemiluminescence reagent; ECL) 中約 1 分鐘後取出，與底片一起放至在壓片夾中約 5 分鐘，取出底片與顯影劑作用至影像顯現，再浸於定影劑中定影，最後利用掃瞄密度測定儀和影像分析軟體來定量結果 (138)。. 46.

(60) （九）核蛋白的萃取將大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時後，使用 TransAM nuclear extract kit，萃取大鼠血管平滑肌細胞之核蛋白。分別將取下的細胞加入 10X PBS 和 phosphatase inhibitors 混合溶液中，離心 3000 x g、5 分鐘，取沉澱物與 hypotonic buffer 作用 15 分鐘後，加入 Detergent，離心 14000 x g、30 秒，去上清液，加入含有 10 mmol/L. DTT、. lysis buffer AM2、protease inhibitor cocktail 的混合液，於冰上搖 30 分鐘後，離心 14000 x g、10 分鐘、4℃，取上清液進行實驗或儲存在-80℃ 備用 (54)。. （十）MMP-2 之測定-明膠蛋白酵素電泳法 (Gelatin zymography for MMP-2) 大鼠血管平滑肌細胞分別加入 10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預處理 1 小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用 24 小時後，收取上清液，透過明膠蛋白酵素電泳法 (zymography) 使用 SDS-PAGE (7.5%) 包含 1 mg/mL 明膠 (gelatin)，測量 MMP-2 的活性表現 (147)。將上清液與 2x sample buffer (1.5M Tris-HCl (pH 6.8)、20% glycerol、30%. 47.

(61) SDS、0.3% bromophenol blue) 混合，loading 至電泳膠片中，以 100 伏特進行電泳跑膠約 3 小時，待膠取出後在室溫下與 Renaturing buffer (2.5% Triton X-100) 反應 30 分鐘，再與 Develiping buffer (50 mmol/l Tris-HCl、pH 8.0、5 mmol/l CaCl2、0.2 mmol/l NaCl、0.02% Brij 35) 在 37℃ 下培養 48 小時。反應後的膠片以 Staining buffer (0.1% Coomassie Brillant Blue R-250) 染色 30 分鐘，再以退色液 (50% methanol、10% acetic acid) 退染後，觀察透明 band 的表現，以表示 MMP-2 的活性 (48)。. （十一） NF-κB 之測定-免疫螢光染色法 (Immunocytochemistry, ICC) 大鼠血管平滑肌細胞分別加入10、20 μmol/L 鼠尾草酸及熊果酸預處理1小時，接著加入誘導劑 Leptin (500 ng/ml) 作用24小時。加入100% 丙酮溶液，作用15分鐘後用 PBS 清洗，再加入0.1 % Triton X-100，5分鐘後以 PBS 清洗。加入10 % normal goat serum 作用1小時，PBS 清洗後，加入一級抗體 (Rabbit anti-NFκB p50) (1：50) 於4℃ 下作用至隔夜，再以 PBS 清洗，加入二級抗體 Alexa-488 (Goat anti-rabbit IgG (H+L) ; 1： 200) 作用1小時 (需要避光)，再用 PBS 清洗，之後加入0.5%碘化物 (propidium iodide ; PI) 於室溫下作用15分鐘，用 PBS 清洗後，取出載玻片並封片，再以雷射掃描共軛焦掃描系統，含共軛焦專用正立顯微鏡觀. 48.

(62) 察、數位影像量測分析系統 (Leica TCS SP2)，觀察並拍照 (150)。. （十二）統計分析細胞計數試驗以及西方墨點轉漬法觀察瘦體素對血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響是利用 One way ANOVA-Dunnett’s test 來比較其結果，其他實驗則利用 One way ANOVA- Duncan’s Multiple Range Test 來進行分析。值以 mean ± SD 的表示當 p＜0.05 表示具有統計上的差異。. 49.

(63) 第五章結果. 一、鼠尾草酸與熊果酸抗氧化能力及清除 DPPH 自由基能力. TEAC 方法中鼠尾草酸與熊果酸與水溶性的維生素 E (Trolox) 的抗氧化能力比較下，觀察到鼠尾草酸與熊果酸的總抗氧化能力分別是在維生素 E-trolox 的 6.6±0.02、1.3±0.14 倍，即表示皆為 Trolox 的 6.6 和 1.3 倍的抗氧化能力，並且比維生素 E-Trolox 的抗氧化能力還要強，而主要清除的自由基為 ROO．、RO．。但在清除 50％ DPPH 的自由基試驗上，鼠尾草酸在 30.14±1.35 µmol/L 則可以清除 50％ DPPH 自由基的產生，但熊果酸在實驗測試後，發現其結果再線性低，因此以 ND 表示 (表 3)。. 二、鼠尾草酸和熊果酸對血管平滑肌細胞之影響(-細胞毒性傷害). 利用細胞計數方法測量鼠尾草酸和熊果酸對大鼠血管平滑肌細胞的毒性傷害。大鼠血管平滑肌細胞培養在6孔盤中，並經無血清培養基下同步化24小時後，給予不同濃度的鼠尾草酸與熊果酸 (10、20、30、. 50.

(64) 40和50 µmol/L ) 再處理25小時，以 Trypan blue 染色後，以血球計數盤計算總細胞的數目。實驗結果顯示 (圖10、11) 鼠尾草酸與熊果酸分別在濃度30 µmol/L 以上時，兩者都會導致細胞的毒性，因此分別選擇10 µmol/L、20 µmol/L 的鼠尾草酸與熊果酸做為以下的實驗濃度。. 三、評估不同濃度瘦體素對血管平滑肌細胞增生之影響. 大鼠血管平滑肌細胞培養於6孔盤，並經無血清培養基下同步化24 小時後，給予不同濃度的瘦體素 (0、100、200、300、500 ng/ml) 處理24 小時，以 Trypan blue 染色後，以血球計數盤計算總細胞的數目。實驗結果顯示 (圖12)，隨濃度的增加，細胞存活率呈現劑量相關性 (dose dependent)，在 500 ng/ml 濃度時，增生表現最強，因此選擇 500 ng/ml 瘦體素做為以下的實驗濃度。. 四、評估瘦體素誘導血管平滑肌細胞增生在不同時間下之影響. 大鼠血管平滑肌細胞培養於 6 孔盤，並經無血清培養基下同步化 24 小時後，給予 500 ng/ml 瘦體素，並分別處理 24、48、72 小時，以 Trypan. 51.

(65) blue 染色後，以血球計數盤計算總細胞的數目。實驗結果顯示 (圖 13)，加入瘦體素 24 小時後的增生表現最強，而在 48、72 小時增生則有減弱的現象，因此選擇以瘦體素作用 24 小時為以下實驗的作用時間。. 五、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞增生之影響. 大鼠血管平滑肌細胞培養於 6 孔盤，並經無血清培養基下同步化 24 小時後，先分別給予濃度 10、20 µmol/L 的鼠尾草酸與熊果酸預處理 1 小時，再給予 500 ng/ml 瘦體素刺激 24 小時，以 Trypan blue 染色後，再以血球計數盤計算總細胞中存活的數目。實驗結果顯示 (圖 14)，血管平滑肌細胞在瘦體素的誘導下，細胞的增生明顯增強，並分別在有加入鼠尾草酸與熊果酸 (10、20 µmol/L) 後的組別，明顯地都抑制細胞存活率的表現，並隨著鼠尾草酸與熊果酸濃度的提高，抑制能力越強，表示鼠尾草酸與熊果酸皆具有抑制瘦體素誘導的血管平滑肌細胞增生的作用。. 52.

(66) 六、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞自由基生成之影響. 大鼠血管平滑肌細胞經無血清培養基下同步化 24 小時後，先分別給予濃度 10、20 µmol/L 的鼠尾草酸與熊果酸預處理 1 小時，再給予 500 ng/ml 瘦體素刺激 24 小時後，加入 DCF-DA 與細胞一起放於培養箱中 30 分鐘，測其發光波長 485 nm 和發散光波長 528 nm 下的吸光值，實驗結果 (圖 15、16)，分別觀察到，血管平滑肌細胞在瘦體素的誘導下，細胞內產生的自由基明顯增強，而在分別加入鼠尾草酸與熊果酸在濃度 20 µmol/L 後，都較 10 µmol/L 時，其抑制 ROS 生成的能力較佳。. 七、以西方點墨轉漬法觀察瘦體素對血管平滑肌細胞 ERK 1/2 和立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白之影響. 大鼠血管平滑肌細胞經無血清培養基同步化24小時後，分別給予500 ng/ml 瘦體素作用於不同長度的時間 (0、1、5、10、20、30、60 分鐘)，並以西方墨點電泳法測試在瘦體素刺激下不同時間點後，血管平滑肌細胞中，ERK 1/2與立即性早期磷酸化 ERK 1/2蛋白的表現。實驗結果顯示. 53.

(67) (圖 17)，在瘦體素刺激下不同的作用時間，對血管平滑肌細胞中的 ERK 1/2蛋白表現大多相同，但對立即性早期磷酸化 ERK 1/2蛋白的表現，則隨瘦體素刺激作用時間的增加而增強，此現象持續到20分鐘，但於20分鐘後表現明顯降低。並以此時間點作為以下相關實驗之時間點。. 八、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞ERK 1/2和立即性早期磷酸化ERK 1/2蛋白之影響. 藉由西方點墨電泳法測試鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素刺激血管平滑肌細胞 ERK 1/2 與立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白表現的影響。大鼠血管平滑肌細胞經無血清培養基下同步化 24 小時後，先分別給予濃度 10、20 µmol/L 的鼠尾草酸與熊果酸預處理 1 小時，再給予 500 ng/ml 瘦體素刺激 20 分鐘。實驗結果顯示 (圖 18)，大鼠血管平滑肌細胞中的 ERK 1/2 蛋白表現幾乎一致。不過在立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白的表現上觀察到，當大鼠血管平滑肌細胞在瘦體素的誘導下，立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白明顯增強，當分別加入鼠尾草酸或熊果酸的組別，發現都能抑制立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白的表現，而熊果酸抑制立即性早期磷酸化 ERK 1/2 蛋白表現的能力，不論濃度是在 10 或是 20 µmol/L. 54.

(68) 時，都較同濃度的鼠尾草酸抑制能力為強。. 九、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞血管平滑肌細胞 NFκB p50 及 p65 蛋白之影響. 利用萃取細胞核蛋白，透過西方點墨電泳法測試鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素刺激大鼠血管平滑肌細胞 NF-κB 蛋白質表現的影響。實驗結果 (圖 19、20)，分別觀察到 NF-κB p50 與 p65 在瘦體素的作用下，都比控制組有明顯的表現，並且在加入鼠尾草酸與熊果酸的組別，都能具有抑制 NF-κB p50 與 p65 蛋白質的表現，當濃度在 10 µmol/L 時，可觀察到熊果酸的抑制能力比鼠尾草酸強，相同的結果在濃度 20 µmol/L 時也可以觀察到，且熊果酸 20 µmol/L 是四組中抑制能力是最強的。. 十、鼠尾草酸與熊果酸對瘦體素誘發之血管平滑肌細胞核轉錄因子 NFκB 之影響. 利用免疫螢光染色法觀察大鼠血管平滑肌細胞，活化的 NF-κB p50 在細胞核內的表現。將大鼠血管平滑肌細胞培養在24孔盤中，經無血清. 55.