1. 汙染菌分離
將綠豆種子以無菌水漂洗後，以滅菌鑷子夾取至Water agar plate，一皿放 置5 顆，放置 5 皿，置於 28℃恆溫培養箱，進行黑暗培養 3-5 日，觀察真菌與 細菌落形成，挑取真菌菌絲尖端或細菌單菌落，繼代至馬鈴薯葡萄糖洋菜培養 基 (Potato Dextrose Agar；簡稱 PDA)，或是營養洋菜培養基 (Nutrient Agar；簡 稱NA)。
2. DNA 萃取
取50mg 經液態氮研磨過後乾燥的菌絲體，利用植物 DNA 萃取套組(Plant Genomic DNA Extraction Miniprep System, Viogene U.S.A) 萃取 DNA。將菌絲體 加入400 μL 萃取套組中的 PX1 buffer 與 400 μg 的 RNase A 溶液，放入 65℃水 浴槽反應10 分鐘 (反應期間每隔 2–3 分鐘震盪混合一次)。再加入 130 μL 的 PX2 buffer 混合後，置於冰上 5 分鐘。將樣品移至套組提供的收集管，8000 ×g 離 心轉速2 分鐘。取得 150 μL 上清液並加入 0.5 倍體積的 PX3 buffer 與 1 倍體 積的99.7%酒精，混合後取此溶液於裝置好的 mini column 管子中，利用離心方 法讓DNA 被吸附在 mini column 上，再以 washing buffer 清洗 mini column，
最後去除washing buffer 並加入無菌水，將吸附在 mini column 上面的 DNA 溶 出來，保存於-20℃。
3. ITS rDNA PCR
聚 合 酶 連 鎖 反 應 使 用 引 子 ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 與 ITS4 (5’-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3’) 根據 White 等人所描述 (White,T.J., 1990)。取 40 ng 的 DNA，加入 2.5 μL 的 10 倍 PCR buffer、10 μM 引子、2.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.5 U taq DNA polymerase 及加入去離子水 (Millipore)，
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最後總體積為25 μL。使用 DNA 酵素聚合反應器進行 PCR，PCR 反應步驟為：
起始變性溫度 95℃，5 分鐘。變性溫度 (denature) 95℃，30 秒；煉合溫度 (annealing) 54℃，30 秒；延展溫度 (extension) 72℃，45 秒，循環 35 週期。最 後延展溫度72℃，10 分鐘 (張，2001)。當所有反應結束後，反應產物取 5 μL，
以2% (w/v) 的 agarose gel 於 0.5 倍 TAE 緩衝液，以 110V 電壓電泳分離 20 分 鐘，以0.6 mg/mL ethidium bromide 染色檢測，紫外燈下觀察結果。
4. PCR 產物的純化
將PCR 產物利用 2% (w/v) 的 agarose gel 電泳分離，切下電泳膠上主要 PCR 產物，使用QIAGEN 公司的產品 QIA quick PCR Purification Kit 純化產 PCR 產 物，獲得濃度為10-30 ng/μL PCR 產物。
5. 基因序列之比對分析方法
將本研究所使用菌種的DNA 序列運用 VectNTI 軟體將序列的正反股接合起 來。並運用基因序列資料庫PubMed 提供的軟體 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 尋找資料庫中相似之序列。
6. 種子物理性消毒處理 6.1. 乾熱種子消毒溫度試驗
將綠豆種子分別進行乾熱種子消毒溫度試驗處理後：80℃、75℃、70℃、
65℃、60℃、50℃、40℃放置 30 分鐘後，放置 WA 培養基直接培養，觀察各處 理間種子消毒之效力與種子發芽率。
6.2. 乾熱種子消毒時間試驗
處理時間70℃：將綠豆種子分別進行乾熱種子消毒溫度 70℃試驗處理以下 時間 10min、30min、60min，放置 WA 培養基直接培養，觀察各處理間種子消 毒之效力與種子發芽率。
7. 一般芽菜與安全芽菜生產流程與成本分析
針對中南部數家芽菜生產業者進行實地訪察，針對各場芽菜生產流程、差 異產量與成本面進行詢問與記錄，最終整理比較差異。
8. 臺灣部分地區傳統市場、超市或量販店販售之綠豆芽藥劑殘留檢測 自臺灣隨機收購傳統市場、超市或量販店販售之綠豆芽產品，確認包裝密
封後，送至檢測中心，針對以下標的物包括過氧化氫、硼砂、螢光劑、二氧化 硫 (檢測靈敏度為 ppm 級)、6-BA (檢測靈敏度為 ppb 級)、2,4-D (檢測靈敏度為 ppb 級)，並記錄該產品之下胚軸長度及寬度。
結果與討論
未經消毒的綠豆種子，經由培養基直接培養可知綠豆種子的真菌汙染率為 42%，細菌汙染率為 24% (圖 1)。
1. 經 ITS 區間 (真菌)、16s rDNA (細菌) 序列增幅、解序分析得知，真菌多以 Alternaria sp.、Fusarium sp.為主，細菌則以 Pseudomonas sp.及 Pantoea sp.為 主。
細菌： Pseudomonas psychrotolerans、Sphingobium yanoikuyae、Pantoea sp.、
Enterobacter sp. 、 Sphingomonas panni strain 、 Pseudomonas sp. 、 Duganella zoogloeoides、Pseudomonas sp.、Pseudomonas fluorescens。
真菌： Alternaria atrans、Alternaria sp.、Alternaria multirostrata、Fusarium equiseti、Ampelomyces sp.、Alternaria tenuissima、Alternaria alternate、
Aspergillus niger、Pleosporales sp.、Aspergillus sp.。
圖1. 未經消毒的綠豆種子，經由培養基直接培養可知綠豆種子的真菌汙染分離狀況。
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2. 經接種試驗得知，部分分離 Alternaria 菌株會造成芽菜發育期壞疽。
3. 綠豆種子經 1%次氯酸鈉水溶液消毒 1 分鐘後，經由培養基直接培養可知綠豆 種子的真菌汙染率下降至為10%，細菌汙染率為 2%。
4. 以 70℃熱處理 30 分鐘即可有效將綠豆種子的真菌汙染率下降至為 25%，細 菌汙染率為 5%，並且不會影響種子之發芽率。