第二章 實驗材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.4 培養液與緩衝液
Ampicillin stock solution (100mg/mL)
將Ampicillin 溶於二次去離子水，再用 0.2 μM 濾膜過濾，去除雜菌，
儲存於 -20 ℃。
50X TAE buffer
2 M Tris acetate，0.1 M EDTA，pH 8.5，儲存於室溫，以一次水稀釋 50 倍使用。
50X ALTHMU solution
0.2% Adenine, 0.3% Lysine, 0.2% Tryptophan, 0.2% Histidine, 0.2%
Methonine, 0.2% Uracil 溶解於一次水，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
50X ALHMU solution
0.2% Adenine, 0.2% Lysine, 0.2% Histidine, 0.2% Methonine, 0.2%
Uracil 溶解於一次水，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
50 X ALTHU：
0.2% Adenine，0.3% Lysine，0.2% Tryptophan，0.2% Histidine，0.2%
Uracil，經高壓滅菌後存於 4 ℃。
50 X ALTU：
0.2% Adenine，0.3% Lysine，0.2% Tryptophan，0.2% Uracil，經高壓
50 X ALT：
0.2% Adenine、0.3% Lysine、0.2% Tryptophan 經滅菌後存於 4 ℃。
50% Glucose solution
500g Glucose 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
80% Glycerol solution
80 ml Glycerol 溶解於 20 ml 的一次水，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
LB medium
25g LB Broth 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
LB plate
25g LB Broth 與 20g BactoTM Agar 溶解於一公升的一次水中，經高壓 滅菌後倒入於Petri dishes 中待其凝固。
G418 stock solution (1g/mL)
500mg G418 溶解於 500μl 經高壓滅菌之二次水，避光保存於 4℃。
SD medium
6.7g Yeast nitrogen base 溶解於一公升的次水中經高壓滅菌後儲存於 常溫。
20% EA developing solution
將Ehyl acetate 與 Hexane 以 1 : 4 互相混合。
TLC staining solution
緩慢的將95% Erhanol、Sulfonic Acid 與 p-Anisaldehyde 以 18 : 1 : 1 之比例混合。
1M sorbitol solution
364.4g D-sorbitol 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
5X sequencing buffer
取4.85g 的 Tris base 與 0.203g 的 MgCl2溶於100 ml 的一次水中並 調至pH 9.0，保存於 4℃。
10X SYBR Green solution
以DMSO 稀釋 10,000X SYBR Green stock solution 至 10X，避光保存 於-20℃。
6X DNA loading dye
0.25% Bromophenol blue 與 30% Glycerol 溶解於一次水中，保存於 -20℃。
Heme solution
在無菌環境下將0.5g Hemin chloride 溶解於 250ml 0.2N 的氫氧化鈉 溶液中，再加入250ml 95%酒精後避光保存於室溫。
Ergosterol solution
在無菌環境下將1g Ergosterol 溶解於 250ml 95%的酒精中，再加入 250ml Tween 80，避光保存於室溫。
ALHMU/Heme/Ergosterol plate
將0.67g yeast nitrogen base 與 2g BactoTM Agar 溶解於 100ml 的一 次水中，經高壓滅菌後加入 2ml 50X ALHMU solution、4ml 50%
Glucose solution 、 2ml Heme solution 、 2ml Ergosterol supplement
2.1.6 實驗儀器
水浴槽 ( Baxter, DurabathTM Water Bath )
電源供應器 ( GE healthcare, Electrophoresis Power Supply EPS 301 ) 掃描器 ( EPSON, EPSON® GT-7000 Scanner )
微量旋轉式真空濃縮機 ( EYELA, Rotary vaccum evaporator N-N series )
數位照相系統 ( Kodak, DC120 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 )
震盪培養箱( Firstek Scientific, Orbital shaking incubator Model-S302R ) PCR ( Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700 )
紫外光/可見光光譜儀 ( Beckmann, DU 7500 Spectrophotometer ) 高速離心機 ( Beckmann, Allegra 21 Series )
電泳槽 ( GE Healthcare, Hoefer® HE 33 Mini Horizontal Submarine Unit )
DNA 定序儀 ( PerkinElmer, ABI Prism 377 DNA Sequencer ) 脈衝控制器 ( BioBad , Pulse Controller )
2.2 實驗方法
2.2.1 重組質體的建構 (The construction of recommbinants)
利 用 Stratagen 公 司 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互 補引子。再以含有正常功能的ERG7序列之載體RS314WT作為模板，
利用QuikChange PCR的方法（圖2-1），建構飽和定點突變之質體。
Wild-type Plasmid (RS314WT)
Mix
PCR Cycle (Pfu DNA polymerase)
Temperature cycle to extend and incorporate mutation
Pirmers
Digest
(DpnI enzyme)
Digest parental DNA template
Mutated plasmid
Transform
Transform the resulting annealed double-stranded nicked DNA
After transformation, XL1-Blue E.coli cell repairs nicks in plasmid
（1）設計引子
（2）QuikChange Site-Directed Mutagenesis
利 用 Stratagene 公 司 （ Merck 代 理 ） 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，按照下表所列之溫度條件進行聚合酶連 鎖反應來建構飽和定點突變之質體DNA。
reagent Volume(µl)
Template 0.5 Primer1 (1000ng/μl) 0.5 Primer2 (1000ng/μl) 0.5
10X pfu Buffer 2 dNTP (2.5mM) 1.6
DDW 14.5 Pfu polymerase 0.4
《表2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所用的材料條件
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min
95℃ 30 sec
53℃ 1 min
2 25
68℃ 4min 3 1 68℃ 5min
4 1 4℃ ∞
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所使用之聚合酵 素放大程式
（3）Dpn I 酵素切除母股 DNA
將 PCR 產物以下表之條件放置在水浴槽中於 37℃下反應四個小 時，因 DpnI 限制酶具有截切甲基化 DNA 之特性，因此我們可以用 其去除不含有突變之母股DNA。
reagents Volume (µl)
PCR products 16 10× NE Buffer 4 2
DpnI 2
《表2-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物處理材料條件
（4）突變質體的放大與酵素鑑定
（A）製備勝任細胞
取少許XL1-Blue在含有Tetracycline（100 mg/L）的LB Agar培養 皿上劃四區，於37℃培養箱一天後。由Tetracycline/ LB Plate上挑取單 一菌落培養於含有Tetracycline（100 mg/L）的3 ml LB試管，同樣在 37℃下於培養箱隔夜培養。接著將菌液接種於1,000 ml的SOB培養液
之離心瓶中，並冰浴十分鐘，接著在4℃下以4,100 rpm的條件離心十 分鐘，待去除上清液之後以經高壓滅菌過之二次水清洗pellet，冰浴 十分鐘後，再以4,100 rpm、4℃條件離心十分鐘。去除上清液後，以 320 ml TB buffer清洗pellet，並重複上述條件離心之。倒除上清液後，
以80 ml TB buffer重新懸浮菌體，繼而加入5.6 ml的DMSO冰浴十分 鐘。取350 μl菌液於經高壓滅菌後的微量小管中，丟入液態氮急速冷 凍，最後保存於-80℃冰箱即可。
（B）質體 DNA 的轉殖與放大
從-80℃冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取10 μl含有突變
點之質體DNA，並加入100 μl的勝任細胞，冰浴20分鐘使質體DNA附 著於細胞的表面。置於42℃的水浴一分鐘，使細胞表面因熱產生小孔 洞而促使質體DNA進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入於1 ml的 LB試管中，以37℃、200 rpm震盪條件培養一小時後，將菌液以8,000 rpm的條件離心一分鐘並去除上清液，接著在無菌環境下將菌液塗在 LB plate（with Ampicillin 100mg/l），在37℃下培養約16小時後，挑取 單一菌落培養於3 ml的LB tube（with Ampicillin 100mg/l），於37℃、200 rpm震盪條件下培養12小時即可抽取放大之質體DNA。
（C）限制酶鑑定
將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依下表所示之條件以 所設計之限制酶與特定緩衝液混和，並置於 37℃水域槽中反應三小 時，再以DNA 電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。
reagents Volume (µl)
Plasmid 0.5 10× NE Buffer 1
Enzyme 0.5 DDW 8
《表2-5》特定限制酶鑑定之材料條件
（5）突變質體的定序
將上述經由限制酶鑑定過之含有突變的質體 DNA 以 Sanger Method （dideoxynucleotide chain termination） 進 行 定 序 。 首 先 利 用 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 以下表所示之材料條件 下進行聚合酶連鎖反應，其引子列於附錄一。在反應過後以酒精沈澱 法取得DNA，再以 ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
reagents Volume (µl)
Template 2 5X Sequencing Buffer 4
Primer 1.5 DDW 11.5 BigDye 3.1 1
《表2-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min
96℃ 10 sec
50℃ 5 sec
2 25
60℃ 4 min
3 1 4℃ ∞
2.2.2 酵母菌珠 TKW14C2 與 CBY57 的電穿孔作用
（1） TKW14C2
於-80℃冰箱中取出 TKW14C2 菌株，由於 TKW14C2 不具有正 常的ERG7 功能 (即不含有 ERG7 基因 ) 且 Heme 基因已被置換掉，
因 此 培 養 液 需 要 額 外 補 充 Hemin + Ergosterol + Met ( 胺 基 酸 Methionine 在體內的生合成與 Heme 基因相關，當 Heme 基因被置換 掉時，Methionine 的生合成會受影響，故要額外補充)。將其接種於 3 ml 的 SD（with ALTHMU/ hemin/ Ergosterol/ Glucose）試管在 30℃
後以250 rpm 震盪條件培養約三天。繼而將菌液倒入 100 ml 含有相 同培養液條件下培養至其 OD600值介於 1 至 1.5 之間，後將全部菌液 以 3,000 rpm 於 4℃條件下離心十分鐘，去除上清液後以經高壓滅菌 之二次（50 ml）緩慢沖洗菌體。重複上述離心步驟後以 20 ml 經高壓 滅菌之二次水沖洗菌體。再重複上述離心步驟，倒除上清液並以4 ml 經高壓滅菌之冰過的 1M D-sorbitol 溶液緩慢沖洗菌體。同樣地，再 以3,000 rpm 於 4℃條件下離心十分鐘並倒除上清液。最後加入 50 μl
× n（n 為所需轉殖的樣品數目）之 D-sorbitol 溶液。之後取 50 μl 菌液 混和 5 μl 含有突變之質體 DNA，並於 4℃下冰浴 5 分鐘。接著將混合 液置入 2 mm 的電穿透玻璃管，設定玻璃管入脈衝控制器條件為 1.5 kV，200 Ω，25 μF 以進行電穿透作用。在電擊後立刻加入 500 μl 無 菌的1M D-sorbitol 溶液將細胞懸浮混勻，最後取 120 μl 的菌液塗佈 在SD plate 中（with ALHMU/ Hemin/ Ergosterol/ Glucose），於30℃恆 溫箱中培養3 至 5 天待其菌落生長即可進行功能性補充篩選分析。
（2） CBY57
於-80℃冰箱中取出 CBY57 菌株，接種於 3 ml 的 SD（with ALTH/
Glucose）試管中在 30℃、250 rpm 震盪條件下培養約三天後，將菌液 倒入100 m 含相同培養液的條件下培養至其 OD600值介於1 至 1.5 之 間。其餘步驟同上述 TKW14C2 作法，但最後需將菌液塗佈在 SD plate
（with ALH/ Glucose）上。
2.2.3 功能性補充活性篩選
（1） 麥角固醇補充篩選
將先前以電穿孔方式轉殖入酵母菌TKW14C2之菌株培養皿取 出，於其上挑取單一菌落，並依序劃眉於以下兩組培養皿上：Glucose + ALHMU + Hemin（實驗組）與 Glucose + ALHMU + Hemin + Ergosterol（對照組）。利用外界補充麥角固醇與否，得以篩選出哪 些突變株會使酵素失去ERG7正常的催化功能，並藉此分析那些突變 位置在ERG7催化機制上具有重要影響性。另外需與下列反向篩選的 結果做對照，接著將具有重要影響的突變ERG7酵母菌進行大量培 養，以獲得突變株得產物圖譜。
（2） 質體交換與反向篩選
從電穿孔轉殖作用的培養皿中挑取含有突變之單一 CBY57 菌
落，於 3 ml SD（with ALHU/ Glucose）中 30℃、250 rpm 震盪條件培 養一天。取少量菌液依序劃眉於以下兩組培養皿：SD + Glucose + Ade + Lys + His + Ura（對照組）與 SD + Glucose+ Ade + Lys + His + Ura + 5-FOA（實驗組）並於 30℃培養三至五天。由於含 pZS11 的質體無 法在含5-FOA 的環境中生長；因此，能於 SD + Ade + Lys + His+ Ura酵母菌，即表示此突變株仍具有 ERG7 功能，可補足 CBY57 中缺少 ERG7 之環化酵素的功能。若重組質體中之突變 ERG7 功能其基因不 具有功能性，即無法生長在 SD + Ade + Lys + His+ Ura+ 5-FOA （實 驗組）之選擇性培養皿上，代表著突變位置會影響正常的ERG7 環化 功能，因而導致無法生成下游產物以供菌株生長，透過此種反向的篩 選方式，初步篩選哪些突變位置在 OSC 催化機制上具有重要的影響 性。
2.2.4 酵母菌的培養
從麥角固醇補充篩選培養皿上挑取含有突變之菌落，並接種於 3 ml 的 SD 中（with ALHMU/ Hemin/ Ergosterol）於 37℃、250 rpm 震 盪條件下培養約五天。將試管底部菌體重新懸浮均勻，再把菌液到入 100 ml 無菌之相同培養液並於同樣環境下培養二至三天。同樣地，將 菌體懸浮均勻後置入2.5 L 經高壓滅菌過之相同培養液，在 37℃下震 盪培養一個禮拜即可。
2.2.5 非皂化脂質的萃取
將培養一個星期之酵母菌於 4℃、6,000 rpm 條件下離心十分鐘，
再以15% KOH 與 0.1% Pyrogallol 溶液重新懸浮細胞，接著加入等體 積之 95%酒精，並於 110℃下進行兩個小時熱迴流（Reflux）反應。
此方法是利用高溫強鹼來打破酵母菌，並以Pyrogallol 去除掉可皂化 之脂質。之後加入三倍體積之石油醚萃取非皂化性脂質（NSL），收 集有機層後加入無水硫酸鈉以去除水分並且過濾。接著利用旋轉真空 濃縮機乾燥收集產物，等待進行管柱層析。
2.2.6 管柱液相色層分析（Silca Gel Colum Chromatography）
本方法是利用矽粉（silica gel）作為管柱中的固相態，另外使用 不互溶之極性溶液乙酸乙酯（Ethyl acetate ; EA）作為流動相之沖堤 液（Eluent），利用幫浦施壓並不斷添加沖堤液，使樣品中的化合物 依極性不同而分佈於兩相之間，再利用TLC 片將相同 Rf 值之試管溶 液收集在一起，以迴旋濃縮機濃縮後即可利用GC/MS（氣相層析/ 質 譜儀）作進一步分析，詳細步驟如下。
首先將適量矽粉與 100 ml 的正已烷互相混和攪拌均勻後，倒入 管 柱 中 填 充 管 柱 並 以 幫 浦 壓 實 緊 密 。 接 著 將 樣 品 溶 於 二 氯 甲 烷
（CH2Cl2）中，在不破壞矽粉層表面情況下小心加入管柱中。接著以 5.5% EA 與 94.5% Hexane 混合液作為沖堤液，並以幫浦加壓將流出 之溶劑依序以 50 根試管收下，再用 TLC 片將其相同 Rf 值之試管收 集即可以迴旋濃縮機濃縮。
2.2.7 薄層色層分析 ( Thin Layer Chromatography )
將試管中的樣品各取 500 μl 於微量小管中，利用真空乾燥機抽乾 溶劑。裁取適當大小之表面附有矽粉的玻璃薄層平版，利用少許二氯 甲烷回溶樣品後，接著以毛細管將樣品點於平版邊緣約0.5 公分處，
為了獲得最佳之分離效率，這些斑點應該要具有最小之直徑。之後利
為了獲得最佳之分離效率，這些斑點應該要具有最小之直徑。之後利