第二章 實驗材料與方法
2.2 實驗方法
2.2.1 重組質體的建構（The construction of recommbinants）….51
利 用 Stratagen 公 司 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互 補引子。再以含有正常功能的ERG7序列之載體RS314WT作為模板，
利用QuikChange PCR的方法（圖2-1），建構飽和定點突變之質體。
Wild-type Plasmid (RS314WT)
Mix
PCR Cycle (Pfu DNA polymerase)
Temperature cycle to extend and incorporate mutation
Pirmers
Digest
(DpnI enzyme)
Digest parental DNA template
Mutated plasmid
Transform
Transform the resulting annealed double-stranded nicked DNA
After transformation, XL1-Blue E.coli cell repairs nicks in plasmid
（1）設計引子
（2）QuikChange Site-Directed Mutagenesis
利 用 Stratagene 公 司 （ Merck 代 理 ） 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，按照下表所列之溫度條件進行聚合酶連 鎖反應來建構飽和定點突變之質體DNA。
reagent Volume(µl)
Template 0.5 Primer1 (1000ng/μl) 0.5 Primer2 (1000ng/μl) 0.5
10X pfu Buffer 2 dNTP (2.5mM) 1.6
DDW 14.5 Pfu polymerase 0.4
《表2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所用的材料條件
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min
95℃ 30 sec
53℃ 1 min
2 25
68℃ 4min 3 1 68℃ 5min
4 1 4℃ ∞
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所使用之聚合酵 素放大程式
（3）Dpn I 酵素切除母股 DNA
將 PCR 產物以下表之條件放置在水浴槽中於 37℃下反應四個小 時，因 DpnI 限制酶具有截切甲基化 DNA 之特性，因此我們可以用 其去除不含有突變之母股DNA。
reagents Volume (µl)
PCR products 16 10× NE Buffer 4 2
DpnI 2
《表2-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物處理材料條件
（4）突變質體的放大與酵素鑑定
（A）製備勝任細胞
取少許XL1-Blue在含有Tetracycline（100 mg/L）的LB Agar培養 皿上劃四區，於37℃培養箱一天後。由Tetracycline/ LB Plate上挑取單 一菌落培養於含有Tetracycline（100 mg/L）的3 ml LB試管，同樣在 37℃下於培養箱隔夜培養。接著將菌液接種於1,000 ml的SOB培養液
之離心瓶中，並冰浴十分鐘，接著在4℃下以4,100 rpm的條件離心十 分鐘，待去除上清液之後以經高壓滅菌過之二次水清洗pellet，冰浴 十分鐘後，再以4,100 rpm、4℃條件離心十分鐘。去除上清液後，以 320 ml TB buffer清洗pellet，並重複上述條件離心之。倒除上清液後，
以80 ml TB buffer重新懸浮菌體，繼而加入5.6 ml的DMSO冰浴十分 鐘。取350 μl菌液於經高壓滅菌後的微量小管中，丟入液態氮急速冷 凍，最後保存於-80℃冰箱即可。
（B）質體 DNA 的轉殖與放大
從-80℃冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取10 μl含有突變
點之質體DNA，並加入100 μl的勝任細胞，冰浴20分鐘使質體DNA附 著於細胞的表面。置於42℃的水浴一分鐘，使細胞表面因熱產生小孔 洞而促使質體DNA進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入於1 ml的 LB試管中，以37℃、200 rpm震盪條件培養一小時後，將菌液以8,000 rpm的條件離心一分鐘並去除上清液，接著在無菌環境下將菌液塗在 LB plate（with Ampicillin 100mg/l），在37℃下培養約16小時後，挑取 單一菌落培養於3 ml的LB tube（with Ampicillin 100mg/l），於37℃、200 rpm震盪條件下培養12小時即可抽取放大之質體DNA。
（C）限制酶鑑定
將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依下表所示之條件以 所設計之限制酶與特定緩衝液混和，並置於 37℃水域槽中反應三小 時，再以DNA 電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。
reagents Volume (µl)
Plasmid 0.5 10× NE Buffer 1
Enzyme 0.5 DDW 8
《表2-5》特定限制酶鑑定之材料條件
（5）突變質體的定序
將上述經由限制酶鑑定過之含有突變的質體 DNA 以 Sanger Method （dideoxynucleotide chain termination） 進 行 定 序 。 首 先 利 用 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 以下表所示之材料條件 下進行聚合酶連鎖反應，其引子列於附錄一。在反應過後以酒精沈澱 法取得DNA，再以 ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
reagents Volume (µl)
Template 2 5X Sequencing Buffer 4
Primer 1.5 DDW 11.5 BigDye 3.1 1
《表2-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min
96℃ 10 sec
50℃ 5 sec
2 25
60℃ 4 min
3 1 4℃ ∞
2.2.2 酵母菌珠 TKW14C2 與 CBY57 的電穿孔作用
（1） TKW14C2
於-80℃冰箱中取出 TKW14C2 菌株，由於 TKW14C2 不具有正 常的ERG7 功能 (即不含有 ERG7 基因 ) 且 Heme 基因已被置換掉，
因 此 培 養 液 需 要 額 外 補 充 Hemin + Ergosterol + Met ( 胺 基 酸 Methionine 在體內的生合成與 Heme 基因相關，當 Heme 基因被置換 掉時，Methionine 的生合成會受影響，故要額外補充)。將其接種於 3 ml 的 SD（with ALTHMU/ hemin/ Ergosterol/ Glucose）試管在 30℃
後以250 rpm 震盪條件培養約三天。繼而將菌液倒入 100 ml 含有相 同培養液條件下培養至其 OD600值介於 1 至 1.5 之間，後將全部菌液 以 3,000 rpm 於 4℃條件下離心十分鐘，去除上清液後以經高壓滅菌 之二次（50 ml）緩慢沖洗菌體。重複上述離心步驟後以 20 ml 經高壓 滅菌之二次水沖洗菌體。再重複上述離心步驟，倒除上清液並以4 ml 經高壓滅菌之冰過的 1M D-sorbitol 溶液緩慢沖洗菌體。同樣地，再 以3,000 rpm 於 4℃條件下離心十分鐘並倒除上清液。最後加入 50 μl
× n（n 為所需轉殖的樣品數目）之 D-sorbitol 溶液。之後取 50 μl 菌液 混和 5 μl 含有突變之質體 DNA，並於 4℃下冰浴 5 分鐘。接著將混合 液置入 2 mm 的電穿透玻璃管，設定玻璃管入脈衝控制器條件為 1.5 kV，200 Ω，25 μF 以進行電穿透作用。在電擊後立刻加入 500 μl 無 菌的1M D-sorbitol 溶液將細胞懸浮混勻，最後取 120 μl 的菌液塗佈 在SD plate 中（with ALHMU/ Hemin/ Ergosterol/ Glucose），於30℃恆 溫箱中培養3 至 5 天待其菌落生長即可進行功能性補充篩選分析。
（2） CBY57
於-80℃冰箱中取出 CBY57 菌株，接種於 3 ml 的 SD（with ALTH/
Glucose）試管中在 30℃、250 rpm 震盪條件下培養約三天後，將菌液 倒入100 m 含相同培養液的條件下培養至其 OD600值介於1 至 1.5 之 間。其餘步驟同上述 TKW14C2 作法，但最後需將菌液塗佈在 SD plate
（with ALH/ Glucose）上。