第一章 緒論
1.3 氧化鯊烯環化酵素家族的簡介
1.3.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）
在高等植物的酯醇生合成途徑中，受質氧化鯊烯會由氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素催化其環化反應物，生成植物固醇的前驅物－環阿 屯 醇 （Cycloartenol ） ， 進 一 步 的 代 謝 形 成 最 終 產 物 植 物 固 醇
（Phytosterol）。在阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環 化酵素（CAS, EC 5.4.99.8）是由759個胺基酸所組成，分子量為86kDa。
氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）與氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素（OSC）在環化的機制上，除了在脫氫的位置不同外，其他地 方基本上均十分相似。兩者都是利用氧化鯊烯作為受質，並且在環化 時受質皆會在酵素活性區內以椅形-船形-椅形的方式摺疊，之後並經 過一連串類似的環化過程而形成C-20原脂醇碳陽離子中間物，並且有 相同的甲基與氫化基轉移機制，只是在進行到最後一步的去質子化步 驟時，氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素會催化C-19上的氫行脫除反應而 生成環阿屯醇，而氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素則催化C-8上的氫脫 除而生成羊毛硬脂醇。另外，學者也發現在兩者的序列比對中，其活 性區域內胺基酸基團只有少數相同，因此這些相異性的位置被認為可 能造成兩者脫氫位置不同的關鍵性胺基酸。所以目前有許多研究就是 針對序列比對上在CAS1與ERG7之間的不同胺基酸序列，利用突變的 方式來加以研究其酵素催化機制上的相關性64,65。
從熱力學的觀點來看，環阿屯醇比羊毛硬脂醇較為不穩定，所以 學者認為環阿屯醇環化酵素之所以可以將產物環化成為能量較不趨 向的環阿屯醇，可能是因為酵素CAS裡的某些特定胺基酸的作用。而 在先前對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素（AthCAS1）的突變實驗中也發 現，Tyr410、His477與Ile481在CAS環化機制中扮演著十分重要的角
色65-68。這些胺基酸在各物種的CAS中皆具有高度保留的特性，但是
在ERG7中則分別以Thr、Cys、Gln及Val的形式存在《圖1-17》。所 以這些胺基酸被認為會促進環阿屯醇的形成，因此若將這些胺基酸進
行突變也可以得到羊毛硬脂醇67。
《圖1-17》Tyr410 (◆), His477 (＊) and Ile481 (▼)在CAS1具有高度保 留性而在ERG7中則被Thr、Cys、Gln或是Val所取代67
舉例來說，Ile481在所有物種中的CAS皆具有高度保留性，而在 ERG7中則為Val《圖1-17》。根據研究結果顯示，Ile481會藉由其γ 位置的甲基來防止碳陽離子與A環上兩支甲基的交互作用，來促使環 阿屯醇的形成。若將Ile481突變成為Val，在產物中可以得到25%的羊 毛硬脂醇與55%的環阿屯醇和20%的parkeol。另外，Ile481也被認為 會利用其較大的立體空間來幫助受質作正確的摺疊，而如果將其突變 成側鏈體積較小的胺基酸（如Ala與Gly）則會得到achilleol A與 camelliol C《圖1-18、表1-1》。
在酵素CAS中，Tyr410與His257被認為在靠近C-19的位置會有氫 鍵配對的交互作用，因此可以藉此幫助最後的去質子化作用67。而在 在AthCAS1Tyr410Thr的突變株中，產物會由原本的環阿屯醇變成75%羊 毛硬脂醇、24% 9β-lanosta-7, 24-dien-3β-ol以及1% Achilleol《圖1-18、
表1-1》。另外，若將Tyr410突變成為Thr時，則會減低碳陽離子中間 物上方的立體空間障礙，而且由於Thr上的氫氧基團較Tyr更接近α-碳，因此在AthCAS1Tyr410Thr突變株中，Tyr532與His257的極性基團將 會被重新排列，因而造成酵素CAS不會產生環阿屯醇，反而會在 C-8/C-9 部 位 上 進 行 脫 氫 反 應 而 形 成 羊 毛 硬 脂 醇 、 parkeol 與
CAS His477雖不位於受質鍵結的活性區域，但是曾有報導指出，
位於活行區外圍（second-sphere）的His477會與Tyr410產生氫鍵的交 互作用而互相拉扯，進而影響環化機制的最終脫氫反應67。His477在 所有物種的CAS中皆具有高度保留性，而在ERG7中則會以Gln或Cys 取而代之。在AthCAS1His477Gln的突變株中，帶有極性的官能基會向C-11 移動靠近，造成在C-11位置行脫氫反應而產生parkeol多於羊毛硬酯醇 的結果；而在AthCAS1His477Asn的突變株中，則會產生大量的羊毛硬酯 醇 ， 但 由 於 其 胺 基 酸 基 團 也 夠 靠 近C-11的位置，所以也會產生 parkeol68。
在整個CAS環化過程中，His257與Asp483被認為是CAS催化活性 上所必須的。Asp483被認為會作為一個路易士酸來幫助環氧基的開 環，以協助環化的起始作用；His257則被認為是位在活性區域的鹼性 基團，能協助C-19上的氫與活性區上的酸基有一質子的來回移動，以 幫 助 在C-19 位 置 上 的 脫 氫 作 用43。 另 外 在 雙 定 點 突 變 突 變 株 AthCAS1I481V/Y410T中，發現其產生羊毛硬酯醇的比例比較其他定點突 變 株 高 出 許 多 ； 然 而 在 三 定 點 突 變 株 （His477Asn/Gln,Ile481Val, Tyr410Thr）中，因為Thr的氫氧基距離Asn與Gln的氨基過遠，所以並 沒有辦法促進羊毛硬酯醇的生成。而經實驗的結果證實，產生羊毛硬 脂醇效率最好的突變株為雙定點突變株AthCAS1H477N/I481V《表1-1》68。
整合上述在植物CAS中的定點突變可以發現，在AthCAS1H477N與 AthCAS1I481V與兩者的雙定點突變株中可以導致植物CAS產生最大量 的羊毛硬脂醇。Suzuki等人在2006年時發表了植物羊毛硬脂醇的合成 酵素，他們從阿拉伯芥中發現At3g45130可以在植物中合成羊毛硬脂 醇，最後名為LAS（lanosterol synthesis）。有趣的是從序列比對中可 以發現到LAS在CAS胺基酸His477與I481位置分別被換成Asn與Val，
這於CAS中的突變結果不謀而合，也顯示了這兩個胺基酸對於羊毛硬 脂醇合成的重要性。
《圖1-18》阿拉伯芥CAS定點突變產物結構圖
AthCAS1 mutants Cycloartenol Lanosterol Parkeol 9ß-Δ7-
Lanosterol Achilleol A Camelliol C
CAS1I481 99 - 1 - - -
(3S)-2,3-oxidosqualene Protosterylyl Cation +
lanosterol cycloartenol
9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol Achilliol A
Camelliol C Parkeol