利用定點飽和突變的方法針對酵母菌中氧化鯊烯環化酵素內高度保留之芳香族胺基酸進行功能性的分析

國

立 交 通 大 學

生物科技研究所

碩士論文

利用定點飽和突變的方法針對酵母菌中氧化鯊烯環化

酵素內高度保留之芳香族胺基酸進行功能性的分析

Functional Analysis of the Conserved Aromatic

Amino Acids within Oxidosqualene-Lanosterol

Cyclase from Saccharomyces cerevisiae

by Site-Saturated Mutagenesis

研

究 生 : 謝文祥

指導教授 : 吳東昆 博士

Functional Analysis of the Conserved Aromatic Amino Acids within Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Saccharomyces cerevisiae

by Site-Saturated Mutagenesis

研究生：謝文祥 Student: Wen-Shiang Shie 指導教授：吳東昆 博士 Adisor: Dr. Tung-Kung Wu

國 立 交 通 大 學

生物科技研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Department of Biological Science and Technology College of Biological Science and Technology

National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master

in

Biological Science and Technology July, 2008

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

利用定點飽和突變的方法針對酵母菌中氧化鯊烯環化 酵素內高度保留之芳香族胺基酸進行功能性的分析 學生: 謝文祥 指導教授: 吳東昆 博士 摘要 在固醇類生合成途徑中，酵素催化直鏈狀的氧化鯊烯形成羊毛硬 脂醇的步驟，在近半世紀以來引起科學家極大的興趣。而在真菌與動 物體中，由氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素負責催化這個複雜的環化 與骨架重排的反應。為了了解酵素中一些具有高度保留性的芳香族胺 基酸所具有的功能，我們利用定點飽和突變的方式對酵母菌內其氧化 鯊烯環化酵素中Trp390、Phe528 與 Trp587 等三個胺基酸進行功能性 的全面分析。在 Trp390 的功能性分析中，我們發現當 Trp 換成其他 三個帶正電荷基團的胺基酸與Gly 時，因為無法互補原本酵素的功能

而使酵素失去活性，而在其他七個突變株ERG7W390X (X= Asn, Glu, Thr, Cys, Phe, Tyr, Pro）中，連帶產生了 Achilleol A 與 CamelliolC。這 個結果顯示了Trp390 不僅會影響開環步驟中的 Asp456，還對 A 環的 形成有極大的影響。

對照 Trp587 的產物分析結果可以發現，除了 ERG7W587F 與

ERG7Trp587Tyr 外其他突變株都會使酵素失去活性，這表示這個胺基酸

在酵素中扮演著極為重要的角色。而在ERG7W587F與 ERG7W587Y突變

株中得到了三環與四環的產物，也顯示了 Trp587 在整個環化與骨架

重排反應上具有重要的影響。

在 Phe528 飽 和 定 點 突 變 中 ， 有 六 個 突 變 株 （ ERG7F528G、

ERG7F528A、ERG7F528I、ERG7F528Q、ERG7F528M 與 ERG7F528Y）會連帶

生成單環的產物的Achilleol A 與 CamelliolC，不過其生成量都很少。 另外，有三個胺基酸（Asp、Arg 與 Thr）在功能性補充中，無法互補

Functional Analysis of the Conserved Aromatic Amino Acids within Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Saccharomyces cerevisiae

by Site-Saturated Mutagenesis

Student: Wen-Shiang Shie Advisor: Dr. Tung-Kung Wu Abstract

The enzymatic cyclization of oxidosqualene is one of the most remarkable step in the biosynthesis of steroids and triterpenoids. Oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7) catalyzes the complex cyclization/rearrangement of (3S)-2,3-oxidosqualene to lanosterol in fungi and mammals. In order to clarify the functional role of these highly conserved aromatic amino acids, site-saturated mutagenesis experiments on Trp390, Trp587 and Phe528 residues of Saccharomyces cerevisiae oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7) were carried out. Genetic complementation results of ERG7Tyr390 showed that three positive-charged amino acids (His, Lys, Arg) and Gly substitutions cannot complement the yeast viability. Two truncated monocyclic intermediates, achilleol A and camelliol C, were concomitantly produced from ERG7W390X (X= Asn, Glu, Thr, Cys, Phe, Tyr, Pro) . These results suggested that the functional role of Trp390 in affecting both Asp456 to protonate the epoxide ring and the A ring formation.

Functional analysis of Trp587 residue showed that most of the substituted mutantions fail to complement the cyclase activity in a yeast ERG7 deficient strain, TKW14C2, except for the ERG7W587F and ERG7W587Y mutants, indicating the importance of this position for the catalytic function of ERG7. Moreover, diverse tricyclic and tetracyclic products were isolated from the ERG7W587Fand ERG7W587Y mutants. The result suggested the possible stabilizing role of Trp587 in the ERG7-catalyzed cyclization/rearrangement cascade.

The site-saturated mutations on the ERG7F528 revealed that trace amount of two truncated monocyclic intermediates, achilleol A and camelliol C, were concomitantly produced from six ERG7F528X (X=Gly, Ala, Ile, Gln, Met, Tyr). In the functional analysis of ERG7F528X mutants, only three mutations (X=Asp, Arg, Thr) cannot complement the cyclase activity. The homology modeling studies suggested that Phe528 is located in the substrate entrance channel and possibly affect enzymatic activity through substrate binding.

謝 誌 說短不短，說長卻又一轉眼就過去的兩年，終於在這篇論文結束以後將要畫 下句點。在最後寫這段謝誌的時候才發現，原來最難的不是一百多頁的論文，而 是如何將七百多個日子與對各位的感情與謝意，表現在這短短的一頁。不好意 思，我這個人不太會表達自己，但大家對我的幫助，其實我都記得清清楚楚。 能夠完成這兩年的碩士生活，最要感謝的人當然是指導教授吳東昆博士。除 了要感謝您當初願意讓我進入這個大家庭磨練，您在實驗上所提供的方向與意 見，不時引導我一個正確的方向。另外還有您對研究生生活上的關心，雖然我們 作息還是不正常，真的謝謝您了，老師。 接下來要謝謝李耀坤老師、袁俊傑老師與鄭建中老師: 謝謝您們在百忙之中 抽空審閱、修改我的論文、親臨指導我的口試，並且不吝惜的給予許多寶貴的建 議，使我收穫良多。 在實驗室的成員中，最要感謝的人我想很多人都一樣是程翔學長，感謝你在 最後這麼短的時間裡幫我修改論文，還有平常你的實驗態度也一直是大家的榜 樣，你不只是實驗室的燈塔，也是大家最敬愛的翔哥！恭喜你早我們一步順利畢 業，也祝你在未來的研究生涯一路順利。 本來我以為要離開這寂寞的城市，對我來說會很容易，但我錯了。這都是要 感謝下面這幾位好朋友，幫我把研究生活化作一道美麗的彩虹。媛婷學姊，你那 傻裡傻氣的笑容在苦悶的時光裡，總是帶來許多生氣；晉源學長，叫你學長還真 不習慣，哪有人叫麻吉學長的，對吧。恭喜你，我走了以後你就可以榮升生科第 一竿了。這一年發生了太多，不用多說，因為你們一定會懂！無敵浩呆大景、殺 手小妹，雖然你們一個在監獄一個正要進去蹲，但與你們在一起的一切，我相信 除非我得老人痴呆，不然也不可能忘記。 另外，已經畢業的文暄學姊、皓宇學長，謝謝你們帶我了解 OSC，你們對 我實驗上的指導與幫助，都是我畢業不可或缺的。媽媽，大家應該知道此媽非彼 媽，有你在實驗室總是不斷會有新的美食出現，你也算是實驗室吃的燈塔吧。晉 豪學長，謝謝你在GC/MS 上的幫助，還有影視娛樂的提供。文鴻、裕國學長與 Mili，也謝謝你們這兩年裡的陪伴。還有我的同學與學弟妹小高、采婷、亦諄、 天昶、禕庭、育勳與剛剛進入實驗室的新成員們，謝謝你們為實驗室所作的一切。 最後要感謝的是我的家人，謝謝你們提供給我這麼好的環境助我求學，讓我 沒有後顧之憂。國欽學長、亦涵學姊，這算是對你們遲了兩年的感謝，謝謝你們 對我們像是長輩又像好朋友的幫助。還有我的女朋友婷方，我還是不會說好聽的 話，但沒有你我走不到這裡，如果你願意，未來我想跟你一起一直一直走下去。 最後，祝福各位都可以一切順利，最重要的是要身體健康，再次感謝各位對 我所作的幫助，謝謝！

目錄

中文摘要 ………...………...…..Ⅰ 英文摘要 ……….………...Ⅱ 謝誌………..Ⅲ 目錄 ………....Ⅳ 圖目錄 ………...…...….…….Ⅶ 表目錄 ……….…………...…Ⅸ 第一章 緒論………..1 1.1 固醇類的生化角色與重要性……….1 1.1.1 膽固醇在生物體內扮演的生理角色………...2 1.1.2 膽固醇的生合成途徑………...3 1.2 三萜類環化酵素家族的簡介……….6 1.2.1 三萜類產物的多樣性與特異性………...6 1.2.2 氧化鯊烯的摺疊結構與環化………...8 1.3 氧化鯊烯環化酵素家族的簡介………...10 1.3.1 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）………...12 1.3.1.1 氧化鯊烯環化酵素受質穩定之假說………...12 1.3.1.2 氧化鯊烯環化酵素的環化機制………...14 1.3.2 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素………21 1.3.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）……….24 1.3.4 鯊烯-蛇麻烯環化酵素（SHC）……….28 1.4（氧化）鯊烯環化酵素之胺基酸序列比對………..32 1.5 研究目的……….38

第二章 實驗材料與方法………44 2.1 實驗材料……….44 2.1.1 化學藥品與材料………..44 2.1.2 實驗套組………..46 2.1.3 菌珠與載體………..46 2.1.4 培養液與緩衝液………..47 2.1.5 實驗儀器………..50 2.2 實驗方法……….51

2.2.1 重組質體的建構（The construction of recommbinants）….51 2.2.2 酵母菌珠 TKW14C2 與 CBY57 的電穿孔作用……….56

2.2.3 功能性補充活性篩選………..57

2.2.4 酵母菌的培養………..58

2.2.5 非皂化脂質的萃取………..58

2.2.6 管柱液相色層分析（Silca Gel Colum Chromatography）…59 2.2.7 薄層色層分析（Thin Layer Chromatography）………59

2.2.8 氣相層析/質譜儀（GC/MS）的條件……….60 2.2.9 突變電腦模擬圖的建構………..60 第三章 實驗結果與討論………61 3.1 酵母菌 ERG7Trp390X功能性分析………61 3.1.1 建構 ERG7Trp390的定點飽和突變株………...61 3.1.2 ERG7Trp390X突變株功能性補充篩選……….61 3.1.3 ERG7Trp390X突變株產物分析……….64 3.1.4 ERG7Trp390X突變株電腦模擬分析……….67 3.1.4.1 鹼性胺基酸對開環的影響………...69 3.1.4.2 Trp390 與 A 環形成的關係……….71 3.2 酵母菌 ERG7Trp587X功能性分析………75 3.2.1 建構 ERG7Trp587飽和定點突變株………...75

3.2.2 ERG7Trp587X突變株功能性補充篩選……….75 3.2.3 ERG7Trp587X突變株產物分析……….77 3.2.4 ERG7Trp587X突變株電腦模擬分析……….80 3.2.4.1 Trp587 與受質間的關係………..81 3.2.4.2 Trp587 在環化過程所扮演的角色………..83 3.2.5 ERG7Trp587X產物生成途徑推測……….87 3.3 酵母菌 ERG7Phe528X功能性分析………89 3.3.1 建構 ERG7Phe528飽和定點突變株………...89 3.3.2 ERG7 Phe528X突變株功能性補充篩選………89 3.3.3 ERG7 Phe528X突變株產物分析………91 3.3.4 ERG7 Phe528X突變株電腦模擬分析………93 3.3.4.1 Phe528 在受質通道扮演的角色……….94 第四章 實驗結論………97 4.1 酵母菌 ERG7W390X功能性分析………..97 4.2 酵母菌 ERG7W587X功能性分析………..98 4.3 酵母菌 ERG7F528X功能性分析………...99 第五章 未來展望………..101 第六章 參考文獻………..102 附錄………107

圖目錄

圖 1-1 固醇類皆具有相似結構…………...………1

圖 1-2 固醇類的合成途徑………...………5

圖 1-3 三萜類環化酵素在不同物種間的特異性……...………7

圖 1-4 氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物途徑...9

圖 1-5 Johnson 提出的理論模型 Johnson Model………...………...13

圖 1-6 Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 理論模組...13

圖 1-7 OSC 催化氧化鯊烯形成羊毛硬酯醇的環化機制.…………14 圖 1-8 酵母菌 ERG7 與人類 OSC 假設開環環化機制……….…. .15 圖 1-9 人類 OSC 受質在 B 環的構型與穩定………16 圖 1-10 受質 C 環會先形成五圓環... 17 圖 1-11 Hess 認為 C 環與 D 環會經由過渡態 10 同時形成... 18 圖 1-12 人類 OSC 高度保留的芳香族性胺基酸………20 圖 1-13 人類 OSC 與受質距離在 5Å 內的胺基酸………..….. 20 圖 1-14 人類 OSC X-ray 晶體結構...22 圖 1-15 人類 OSC 與膜結合時的構型... 22 圖 1-16 SHC 之 X-ray 結晶結構與假設起始環化機制...………... 23 圖 1-17 CAS1 與 ERG7 中胺基酸保留形式的差異………25 圖 1-18 阿拉伯芥 CAS 定點突變產物結構圖………27 圖 1-19 SHC 的環化機制與 OSC 十分類似………28 圖 1-20 SHC 之 X-射線晶體結構圖………29 圖 1-21 抑制劑 Ro48-8071（灰色）與 SHC 結合的分子模擬圖….30 圖 1-22 SHC 活性區域內假設活性胺基酸的位置與功能………….31 圖 1-23 各物種間環化酵素序列比對圖...33 圖 1-24 Q-W Motif 在環化酵素家族內之分佈情形...37 圖 1-25 細菌所得到 6-6-6-5 四環產物的產物途徑推測圖...41 圖 1-26 實驗流程圖...43

圖 2-1 QuikChange Site-Directed Mutagenesis 意示圖……….51

圖 3-1 麥角固醇補充篩選與反向篩選意示圖……….62

圖 3-2 酵母菌 ERG7Trp390X其產物質譜與其結構對照圖…..……...66

圖 3-3 野生型酵母菌 ERG7Trp390與附近胺基酸結構模擬圖……...68

圖 3-4 酵母菌 ERG7Trp390突變株結構模擬圖………...70

圖 3-5 ERG7Trp390Gly與野生型的ERG7 空間結構比較………72

圖 3-6 酵母菌 ERG7Trp390突變株結構模擬圖………...74 圖 3-7 酵母菌 ERG7Trp587突變株產物相對應時間圖...78 圖 3-8 酵母菌 ERG7Trp587突變株產物質譜與結構對照圖…..…….79 圖 3-9 野生型酵母菌 ERG7Trp587與附近胺基酸結構模擬圖……...80 圖 3-10 ERG7Trp587突變株與野生型ERG7 其空間結構的比較……82 圖 3-11 在 ERG7Trp587突變株中，受質入塢的結構模擬圖…………84 圖 3-12 ERG7Trp587突變株與野生型ERG7 的空間結構比較圖……86 圖 3-13 ERG7Trp587X產物假設生成路徑推測圖……….86 圖 3-14 酵母菌 ERG7Trp528產物質譜與其結構對照圖………...92 圖 3-15 野生型酵母菌 ERG7 與受質通道口胺基酸結構…………..93 圖 3-16 酵母菌突變株 ERG7Phe528Asp與附近胺基酸結構模擬圖…..94 圖 3-17 酵母菌 ERG7Phe528突變株與附近胺基酸結構模擬圖……..95

表目錄

表 1-1 阿拉伯芥 CAS 定點突變產物及比例分配表………27 表 1-2 SHC 活性區域內胺基酸酵素動力學實驗結果...40 表 2-1 飽和定點突變之引子設計……….52 表 2-2 QuikChange PCR 所用的材料條件………52 表 2-3 QuikChange PCR 放大程式………53 表 2-4 Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物處理材料條件...53 表 2-5 特定限制酶鑑定之材料條件...55 表 2-6 Sequencing Kit 所用之材料………..55 表 2-7 Sequencing Kit 所用之溫度………..55 表 3-1 酵母菌 ERG7Trp390X功能性篩選表……….63 表 3-2 酵母菌 ERG7Trp390X的產物分析表……….65

表 3-3 ERG7Trp390Gly與野生型ERG7 胺基酸相對距離比較………71

表 3-4 酵母菌 ERG7Trp587X功能性篩選表……….76

表 3-5 酵母菌 ERG7Trp587X產物分析表……….77

表 3-6 ERG7Trp587突變株和野生型ERG7 與受質的距離比較表…86 表 3-7 酵母菌 ERG7Phe528X功能性篩選表………90

第一章

序論

1.1 固醇類的生化角色與重要性

固醇類（Sterols）是多環脂醇類物質的通稱，其組成通常具有四 至六個環作為其結構的中心骨架，並含有一個長短不一且經由不同官 能基修飾之側鏈，同時在其 C-3 位置上會有一羥基者稱之。自然界的 固醇類普遍存在於動、植物與細菌中，例如：膽固醇（cholesterol）、 麥角固醇（ergosterol）、β-麥胚固醇（β-amyrin）、植物固醇（phytosterol） 以及其生合成代謝途徑中的上游產物及其衍生物，彼此間皆具有十分 相似的結構《圖 1-1》；由於在大多數的真核細胞中，固醇類物質扮 演著細胞膜組成及生理調控的重要角色 1，所以固醇類的生合成途徑 與其代謝調節機制一直是近年來十分重要的研究課題。 《圖1-1》固醇類皆具有相似結構 在動物體內，最常見的固醇類物質以膽固醇（Cholesterol）最為 重要。而膽固醇是一種類似脂肪的複合體，主要是由肝臟所製造產 生，其次是在腸、腎上腺皮質及動脈管壁上生成，同時也可經由食物 的攝取而獲得 2。膽固醇在動物體內參與了許多新陳代謝相關的生理 調控。由於它是細胞膜的重要成分可以調控細胞膜的流動性，進而影 響胞內外物質的滲透。此外膽固醇亦可藉此調控細胞膜上之蛋白質使 其進行訊息傳遞、代謝反應與催化等作用3。另外，膽固醇也是膽汁、 D O H O H O H O H Lanosterol Cycloartenol Lupenol β -Amyrin

礦物皮質固醇（Mineralocorticoids）中的醛固酮（Aldosterone）、雄 性激素（Androgens）、雌激素（Estrogens）與黃體酮（Progestins）。

人體也可利用膽固醇，自行合成脂溶性維生素D3，而維生素D3是一

種具有激素功能的固醇，會影響鈣質吸收，進而造成血鈣與骨鈣的回

饋循環平衡，並刺激基因表現與增加骨質的密度 4。此外，膽固醇也

是脂質筏（Lipid raft）的組成成分。Lipid raft 是指細胞膜中一塊固性 區域，當細胞膜上膽固醇比例增加時，細胞膜的流動性會減少，即一 塊較不具流動性的富含膽固醇的區域 5。許多文獻的研究也指出，脂 質筏可能與訊息傳遞、發炎反應、細胞移動（Migration）、神經傳導 等反應有關，如：阿茲海默症（Alzheimer’s disease）等6。此外，在 酵母菌的實驗也發現，部份具特定結構的固醇類，以及其相對應的激 素，對於細胞分裂中增生週期的調控，有密切的相關性。因此，固醇 類及三萜類天然物在酵母菌、動、植物細胞一直被廣泛注意7, 8。

1.1.1 膽固醇在生物體內扮演的生理角色

膽固醇在體內的運送需要藉由與脂蛋白結合的方式來運送，主要 可 分 為 三 種 脂 蛋 白 ： (1) 非 常 低 密 度 脂 蛋 白 - 膽 固 醇 （VLDL-cholesterol），負責從肝臟中將脂質攜帶至全身各組織，同時 VLDL 也 會 轉 變 為 LDL ； (2) 低 密 度 脂 蛋 白 - 膽 固 醇 （LDL-cholesterol），將膽固醇運送至全身各部位，但若含量過高的會 對人體不利，是造成血管阻塞、硬化的元凶；(3) 高密度脂蛋白-膽固 醇（HDL-cholesterol），可將黏在血管上多餘的膽固醇運送回肝臟進 行代謝排除，以降低血液中總膽固醇的含量。另外藉內每日飲食所攝 食的脂肪，經由腸胃道吸收而形成的乳糜微粒（chylomicrons）還有 非常高密度脂蛋白-膽固醇（VHDL-cholesterol）也都會參與脂質的拴 工作。然而，在人體受到自由基攻擊時，或處於高氧化壓力的情況之 下，血液循環中的LDL會被修飾，也就是進行乙醯化作用或其LDL apo B （LDL apolipoprotein B，低密度脂蛋白表面脂蛋白B）會被氧化而

形成ox-LDL（氧化型低密度脂蛋白），使其失去攜帶膽固醇之能力， 進而引起高血壓、心臟病、動脈粥狀硬化、中風……等心血管疾病的 發生9-11。另外，在黴菌中，固醇類生合成途徑的最終產物－麥角固 醇為黴菌胞膜上的重要組成，也是不可或缺的存活因子。因此，目前 許多先進的分子生物學技術已被大量用來研究生物體中固醇類及三 萜類天然物的重要性，了解其代謝上的反應途徑，用以發展抗黴菌及 降膽固醇的藥物12,13。

1.1.2 膽固醇的生合成途徑

自然界固醇類的生合成，是由兩個碳的乙醯輔酶-A（Acetyl-CoA） 開始合成，在經由幾個步驟的反應縮合後，利用其速率決定步驟－3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）的催化而形 成二羥甲基戊酸（Mevalonic acid），之後再經一連串的ATP水解參與 反應，進而生成異戊二烯類的中間物（Isoprenoid intermediates），隨 後六個五碳的異戊二烯單元體經過縮合及還原反應形成二萜基焦磷 酸 鹽 （ geranyl pyrophosphate ） 與 三 萜 基 焦 磷 酸 鹽 （ farnesyl pyrophosphate）最後產生疏水性的鯊烯（Squalene）。鯊烯經氧化代 謝生成的氧化鯊烯，會經由環化及一連串反應，進而合成其最終產物 14_{。值得注意的是，在不同物種間，生物體會分別利用鯊烯或氧化鯊} 烯作為其環化起始物。例如，在細菌或一些原核生物及低等植物中它 們會利用鯊烯環化生成蛇麻烯（Hopene），而高等植物、真菌、動物…… 等則會由氧化鯊烯進行環化，並經一連串反應而生成植物固醇、麥角 固醇、膽固醇等固醇類的產物《圖1-2》。 以往在降膽固醇的藥物研究方面，主要是著重於HMG-CoA Reductase來做為抑制劑的研究對象，然而此一方式卻會影響其下游產 物異戊二烯中間物與三萜類化合物的生成，進而影響具有重要功能的

－氧化鯊烯環化酵素（Oxidosqualene Cyclase；OSC）位於整個反應 的中下游，若由此處做為研發抑制物的研究標的，對身體的副作用理 論上會相對較小，故近年來OSC已逐漸成為抗黴菌及降膽固醇藥物的 研發目標15。此外，由於此環化酵素的環化反應，涉及了包括十幾個 鍵的斷裂、形成及碳骨架的重排、去質子化等步驟(終止脫除反應)， 如此高度複雜且極具效率的環化反應，更強烈地引發我們想去探究的 興趣。

Sterol Biosynthetic Pathway

《圖1-2》固醇類的合成途徑 Squalene-Hopene cyclase High plant Isoprenoid intermediate Lanosterol (3S)2,3-Oxidosqualene Hopene Bacteria 2Acetyl CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Mevalonate Dolichol Heme A Isopentenvl tRNA Ubiquinone Squalene HMG-CoA synthase HMG-CoA reductase Cycloartenol

Phytosterol _{Ergosterol Cholesterol}

Fungi Animal

Cycloartenol

1.2 三萜類環化酵素家族的簡介

三萜類化合物（Triterpenoid）是一群由三十個碳的前驅物衍生而 來的多烯類產物。目前，已知天然來源而產生的不同多烯類骨架的三 萜類化合物有近兩百多種 16。這些三萜類化合物，主要是由自然界的 三萜類環化酵素家族，經由單一步驟的酵素催化反應，並藉由酵素與 受質間的鏡像或立體選擇性的環化及骨架重排作用，而生成了如此多 樣的產物，而這些產物泛存於自然界的各物種中形成產物多樣性。然 而，正因為此一催化反應的複雜性與其產物的多樣性，三萜類環化酵 素 家 族 對 於 其 催 化 鯊 烯 （ Squalene ） 或 氧 化 鯊 烯 （(3S)-2,3-oxidosqualene ） 進 行 環 化 反 應 ， 而 形 成 多 環 多 烯 類 （terpenes）的催化機制在這半世紀以來一直是分子生物學家及化學 家所公認是最迷人及最具挑戰性的生物轉化反應之一。 三萜類在不同物種間依其所使用之酵素，能分別將直鏈狀多烯類 的鯊烯或氧化鯊烯，經由其單一生物轉化的過程，催化形成多個不對 稱立體中心的多環類脂醇或三萜類化合物17。整個環化過程包括雙鍵 或環氧鍵（Epoxide）的質子化（Protonation）、誘導開環、環化 （Cyclization）、甲基與氫化鍵之重組（Rearrangement）、與最後的 終止脫除（Elimination）反應。

1.2.1 三萜類產物的多樣性與特異性

三萜類化合物依物種的特異性會分別利用不同之環化酵素來進 行三萜類的環化反應。例如在細菌中，直鏈狀的鯊烯會經由鯊烯-蛇 麻烯環化酵素（Squalene - Hopene Cyclase；SHC）的環化作用而生成 具有五環的產物－蛇麻烯（Hopene），或藉其他環化酵素的反應而生 成蛇麻醇（Hopanol） 或里白醇（diplopterol） 等環狀產物；在較高 等的植物與藻類中，氧化鯊烯可以被環阿屯醇合成酵素（Cycloartenol Synthase；CAS）環化而生成五環之環阿屯醇（cycloartenol），或是

經由羽扇醇合成酵素（Lupeol Synthase；LUS ） 的作用而合成五環 的羽扇醇（Lupeol），亦可以被香桂素合成酵素（Amyrin Synthase； AMS） 環化而形成五環的 α-香桂素（α-Amyrin）或 ß-香桂素 （ß-Amyrin），又或藉其他環化酵素環化而形成不同的四環至六環的 產物；而在動物、真菌與其它甲基營生菌（methylotrophic bacterium） 中 ， 氧 化 鯊 烯- 羊 毛 硬 脂 醇 環 化 酵 素 （ Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase ； OSC ） 則 會 將 氧 化 鯊 烯 環 化 形 成 四 環 之 羊 毛 硬 脂 醇 （Lanosterol；LA）。這些具有物種專一性的環化產物，可分別依反 應的產物骨架的複雜性進而區分為 6-6-6-5 四環、6-6-6-6-5 五環、 6-6-6-6-6 五環或其它單環、雙環、三環與六環的三萜類化合物 16《圖 1-3》。 《圖1-3》三萜類環化酵素在不同物種間的特異性 O 2 3 6 10 15 18 2 3 19 1 4 5 7 8 9 10 11 13 14 12 15 16 18 20 21 22 24 23 6 O H 26 27 29 30 28 25 2 3 19 1 4 5 7 8 9 10 11 13 14 12 15 16 18 20 21 22 24 23 6 O H 27 29 30 28 25 26 O H O H O H OH (3S)-2,3-Oxidosqualene Lanosterol Cycloartenol Dammaradienol Lupenol Hopene _Hopanol Bacterial Squalene

Animals and Fungi Higher plants

Higher plants Higher plants Higher plants Bacterial

1.2.2 氧化鯊烯的摺疊結構與環化

在三萜類的環化過程中，一開始是由環化酵素中的酸性胺基酸提 供電子，進而使得親核性的雙鍵或是環氧基藉由其親核性作用進行開 環起始反應。而在整個環化過程中包含了 16 個鍵的斷裂與生成，並 經過一連串的碳陽離子-烯烴環化作用（cation-olefin cyclization）生成 帶有正電的高能碳陽離子中間產物（cationic intermediates）。而大部 分的碳陽離子中間產物皆只存在於十分短暫的時間，所以並不容易被 科學家所分離。此外，鯊烯在其環化酵素的活性區域中，會依全椅形 的形式（all-chairform）摺疊，而相對地氧化鯊烯在不同的氧化鯊烯 環化酵素活性區域中，經由不同物種的環化酵素上胺基酸殘基的誘 導，則會有兩種摺疊的方式：椅形-船形-椅形（chair-boat-chair）與椅 形-椅形-椅形（chair-chair-chair），依這些摺疊方式來進行上述開環 反應進而形成碳陽離子中間產物 3。正因為相同的反應受質在酵素中 具有不同的摺疊方式，所以造成了立體構形相異的反應機制，經質子 化及一連串的雙鍵電子轉移後，會生成二種類型的碳陽離子中間物 如：（一） 經由 chair-boat-chair 骨架摺疊生成的原脂醇碳陽離子中 間物（Protosteryl Cation intermediates）；（二）經由 chair- chair –chair 骨 架 摺 疊 會 形 成 達 瑪 烯 碳 陽 離 子 中 間 物 （ Dammarenyl Cationintermediates）。其中原脂醇碳陽離子中間物經過不同的甲基與 氫化基的轉移等骨架重排作用後，會在不同位置進行脫氫反應，或是 藉由水分子作用來終止反應進而形成環阿屯醇、羊毛硬脂醇和南瓜子 雙烯脂醇（Cucurbitidienol）；而達瑪烯碳陽離子中間物在不同酵素 中可以被繼續誘導環化而形成6-6-6-6-5 及 6-6-6-6-6 五環的碳陽離子 中間物，接著在經由類似的骨架重排與脫氫作用而生成達瑪雙烯醇 （Dammaradienol）、羽扇醇、α-香桂素及 ß-香桂素等 18-20《圖 1-4》。

《圖1-4》氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物途徑 O 2 3 6 10 15 18 O O H O H H O H H O H O H O O H O H O H HO O H O H O H O H (3S)-2,3-Oxidosqualene chair-boat-chair Enz-AH + Protosteryl Cation 20 + + + Cycloartenol Lanosterol Enz-AH + chair-chair-chair Dammarenyl Cation 20 + 20 Dammaradienol + Baccharenyl Cation 17 18 Lupenol Lupenyl Cation + ₁₉ 20 +19 β -Amyrin 12 ₁₃ α -Amyrin

1.3 氧化鯊烯環化酵素家族的簡介

氧化鯊烯環化酵素屬於自然界三萜類環化酵素家族的一類，包含 許多環化酵素，如：氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）、氧化 鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）、羽扇醇合成酵素（LUS）、香桂 素合成酵素（AMS）等。主要是利用氧化鯊烯（Oxidosqualene；OS） 作為其反應受質，並催化其進行複雜的生物轉換反應進而生成下游的 二次代謝產物的前驅物，如：固醇類、膜組成物、固醇類激素或其他 二級代謝物。 對於氧化鯊烯環化酵素的研究已經行之有年。1970 年，Robinson 發現酵素必須將受質的碳原子折疊在膽固醇結構的相似位置才可進 行催化反應 21。Bloch 與 Cornforth 則利用混入實驗（incorporation） 直接証明了在羊毛硬脂醇合成反應機制中，酵素具有催化甲基與氫化 基轉移的骨架重排反應的能力22。而 Corey 與 Bloch 則進一步証明了 哺乳類中其氧化鯊烯環化酵素合成羊毛硬脂醇的反應受質是 2,3-氧 化鯊烯而非鯊烯23。Barton 則更進一步証明真核生物是利用 3(S)-2,3-氧化鯊烯做為其環化的反應受質，而非 3(R)的鏡像異構物24,25。另外， Corey 藉由合成氧化鯊烯環化酵素所催化生成的可能中間物，探討此 單一步驟高效率的生物轉化，如何將不具立體中心的氧化鯊烯環化生 成具多個不對稱立體中心的反應機制17。而Ruzicka 與其研究團隊， 也利用生命期短以及離子性的中間物，建構出立體化學的假說 27。同 時，Corey 和 Matsuda 也以實驗証明環氧基的親電性活化開環，及需 要酸性基團作為其質子供應者以誘導活化開環28,29。 在先前的研究中指出，若將鯊烯置於中性或是弱酸的溶液中，在 室溫下可穩定地存放一天，因此強酸被認為是在開環的起始反應中所 必需的27。而突變實驗也證明了胺基酸Asp在氧化鯊烯環化酵素家族 中具有高度保留性並且為催化所必須之胺基酸3。因此，Asp被認為是 誘導環氧基開環的重要基團，可以提供質子進行開環。

在環化反應方面，受質經由受質通道進入酵素以後酵素上的胺基 酸基團電子會誘導受質摺疊程式當結構，再經由酵素上酸性基團Asp 誘導開環，過程中會形成許多具有高能量的碳陽離子中間產物，進而 進行環化與骨架重排等反應。最後再經由酵素胺基酸與受質間的牽引 交換，或是藉由水分子的作用以提供氫氧基來吸引電子，進而形成雙 鍵或是由所提供的氫氧基團形成雙醇類產物而終止反應。目前約有近 200種氧化鯊烯環化酵素的產物被報導出來30,31，這些產物經由類似的 催化機制都具有相似的骨架結構，但是由於酵素活性區域與受質結合 區的不同，導致其在環化骨架上的差異，另外經由甲基與氫化基的重 排也會後會產生許多不同的碳陽離子中間產物，最後則依不同的碳陽 離子的脫除（cation-quenching）步驟中止反應，進而成多樣的產物。

1.3.1 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 (OSC)

在氧化鯊烯環化酵素家族中，存在於真菌類與動物中的氧化鯊烯 -羊毛硬脂醇環化酵素其主要負責催化受質氧化鯊烯進行環化反應而 形成四環的羊毛硬脂醇，進而代謝形成重要的生理物質麥角固醇與膽 固醇。在酵母菌（Saccharomyce scerevisiae）中，S.c. ERG7是一種由 ERG7基因所轉譯出來的膜蛋白，由2,196個鹼基對轉譯而生成731個 胺基酸序列，而其理論蛋白質分子量為83.7 kDa。正因為此酵素與膜 結合的特性，再加上其分子量很大，因而造成酵素在純化上十分不 易，至今尚未有結晶結構被解析出來，也因此在其結構與催化機制方 面的探討仍然有限。目前在對ERG7環化反應機制的研究方面，主要 是利用分生技術及反應受質類似物進行探討，通常會透過以下三種方 式：（1）利用氧化鯊烯的類似物來取代受質進行環化機制的研究。 （2）比對不同物種之羊毛硬脂醇環化酵素之蛋白質序列與基因選 殖，從得到的序列資訊進行結構與機制上的探討。（3）以定點突變 的方式來研究酵素上某些胺基酸基團在環化機制上所扮演的角色。而 這三種方法中又以第三種最為普遍，經由突變實驗所得到的新產物可 以讓科學家藉此推測環化過程中胺基酸的催化功能。

1.3.1.1 氧化鯊烯環化酵素受質穩定之假說

針對OSC的受質專一性和反應的立體化學等特性，有兩種假說 被提出來，用以說明酵素是如何穩定這些具有高能量的碳陽離子中間 產物。1987年，Johnson提出了第一個理論模型（Johnson Model）《圖 1-5》，在這個模型中Johnson認為酵素會利用具相位選擇性（facing selective）的負電荷來穩定過渡狀態（transition state）的正電高能量 的碳陽離子32,33。

《圖1-5》Johnson提出的理論模型Johnson Model32,33 另外，在1992年Griffin也提出了另一個Aromatic Hypothesis的理 論模組34《圖1-6》。由於在氧化鯊烯環化酵素中，具有芳香族基團的 胺基酸Tyr、Trp與Phe在各物種中皆具有高度保留性，因此Griffin認 為這些基團會利用碳陽離子-π電子作用（cation-π interaction）的穩定 效應，來引導受質進行適當的骨架摺疊並且穩定具有高能量且帶正電 的中間產物，使其之後的甲基與氫化基可以做適當的轉移重排。 《圖1-6》Griffin所提出的Aromatic Hypothesis理論模組34 O H Enz-AH 2 3 6 7 10 11 15 18 23 14 19 + B: O H Enz-AH 2 3 6 7 10 11 15 18 23 14 19 + B: O H Enz-AH 2 3 6 7 10 11 15 18 23 14 19 + B: O H Enz-AH 2 3 6 7 10 11 15 18 23 14 19 + B:

1.3.1.2 氧化鯊烯環化酵素的環化機制

氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的環化機制包含了數個步驟，並且 會產生許多高能量的碳陽離子中間物。首先，酵素會誘導受質(3S)-2,3 氧化鯊烯在活性區域摺疊成椅形-船形-椅形（chair-boat-chair）的構 型。接著酸性胺基酸Asp455（human OSC）會提供質子來誘導環氧基 進行開環反應，進而引起電子的轉移環化而形成A至D環，最後碳陽 離子會落在C-20位置上而形成原脂醇碳陽離子中間物（Protosteryl Cationic intermediate）。最後經過甲基與氫化基的轉移後，酵素會藉 由鹼性胺基酸或是與水的交互作用進行脫氫反應而形成最終的產物 羊毛硬酯醇《圖1-7》。 《圖1-7》OSC催化氧化鯊烯形成羊毛硬酯醇的環化機制 HO 6 HO H 10 HO 14 HO H 14 HO H H H 9 8 17 20 Enz-B: HO H H H Lanosterol chair‐boat‐chair O Enz-AH HO 6 HO H 10 HO 14 HO H 14 HO H H H 9 8 17 20 Enz-B: HO H H H Lanosterol chair‐boat‐chair O Enz-AH HO 6 HO H 10 HO 14 HO H 14 HO H H H 9 8 17 20 Enz-B: HO H H H Lanosterol chair‐boat‐chair O Enz-AH chair‐boat‐chair O Enz-AH O Enz-AH

（一）開環起始反應

在人類OSC的結晶結構尚未被解析出來之前，科學家多藉由透過 受質類似物與OSC做親和性標定（Affinity labeling），或以定點突變 的方式來推測反應機制40。1997年，Corey等人利用一系列的丙胺酸定 點突變式掃瞄法（alanine scanning site-directed mutagenesis）針對酵母 菌ERG7的活性區域內高度保留性的胺基酸進行實驗，實驗結果顯示 酵母菌ERG7中His146、His234、Asp456位置在催化機制上扮演十分 重要的角色41,42。這些研究認為ERG7在催化環氧基開環反應時， His146會藉由氫鍵拉扯效應來增強Asp456的酸性，進而提供質子促使 環氧基質子化而開環《圖1-8a》43。同樣地，由人類OSC的X-ray結晶 結構可以發現，Cys456和Cys533兩者皆與Asp455間有氫鍵連結，可 藉此增強Asp455的酸性以誘導環氧基的質子化開環，同時Asp455還 可透過與水分子及Glu459的羧酸基團作用，或是藉由最後脫氫步驟的 質子轉移而再質子化《圖1-8b》44,45。另外有許多研究也相信，在經 由質子化開環反應後，會同步引起A環的環化形成，這兩個步驟目前 為止被認為是同步發生的46~50。

《圖1-8》a. 酵母菌OSC假設開環環化機制43 b. 人類OSC開環環化

機制44,45

（二）環化的過程 早期在環化機制尚不清楚的時候，Matsuda等人在研究B環形成時 發現在酵母菌ERG7內的胺基酸Val454位置具有高度的保留性。同樣 的，對應到植物CAS的Ile481位置亦然。所以他們利用分子生物學的 方法將Val454突變成同為疏水性胺基酸的Phe、Leu與Ile，還有立體空 間較為簡單的Ala與Gly。實驗的結果顯示在Ala與Gly的突變中，會得 到單環的產物，所以他們認為Val454會藉由其立體空間較大的側鏈來 幫助B環的形成51。 在2004年Nature所發表的人類OSC結晶結構中，Thoma等人指出 幾個具有高度保留性的胺基酸位置，其中Trp387、Phe444與Trp581（對 應到酵母菌ERG7分別為Trp390、Phe445與Trp587）會利用其含有苯 環的側鏈，並透過碳陽離子-π共振交互作用來，穩定形成A環與B環 時產生的C-6和C-10的碳陽離子中間產物。然而，在酵母菌ERG7 Phe445的定點突變實驗裡，卻得到了三環與在不同地方去質子化的四 環產物。這也證明了在酵母菌ERG7中，Phe445會影響在C環形成時 的C-14碳陽離子中間物與最後在C-8/C-9的去質子化步驟52。另外，在 B環形成時，能量較不傾向的船形結構方面，Thoma認為Tyr98位置其 立體空間較大的側鏈推動氧化鯊烯C-10上的甲基至到分子平面之 下，而進一步地阻礙B環形成能量較傾向的椅形構形《圖1-9》35。不 《圖1-9》Trp387、Phe444、 Trp581穩定A環與B環形成 時的C6、C10-碳陽離子中間 物；Tyr98的側鏈藉由立體 空間障礙促使B環形成能量 較不傾向的船形結構35

過在酵母菌ERG7胺基酸Tyr99位置的飽和定點突變實驗結果中， Tyr99已被證實是與C-14碳陽離子的穩定有關，在此位置進行突變則 會 得 到 (13αH)-isomalabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol 、 (13αH)-isomalabarica-14Z,17E, 21–trien-3β-ol與羊毛硬脂醇等相關產 物77。 1995年，Corey等人在以20-oxaoxidosqualene取代氧化鯊烯作為受 質的實驗中，發現除了6-6-6-5的四環產物以外還有6-6-5的三環系統 產物。所以他們藉此結果推測，在C環形成的過程中會先形成五圓 環，再經由擴環反應而成為六圓環《圖1-10》53,54。另一方面，利用 電腦模擬所作的理論能量計算方面，也認為C環的環化過程會先形成 五圓環再行擴環作用成為六圓環55；Hess則從他的計算結果認為6-6-5 的三環碳陽離子中間物為環化過程中的第一個中間物，而之後C環與 D環的形成會經由過渡態10而同時發生，並非為先前所認為的會先形 成六圓環的C環再行擴環作用而產生《圖1-11》56,57。另外Gao在其以 SHC為受質的理論計算的研究中，則是認為在整個環化過程中只會生 成單環與雙環的碳陽離子中間物，其C、D與E環都是同時形成的76。 《圖1-10》利用類似物作為受質結果顯示C環會先形成五圓環 O O O O H H H O O H H H HO H H O H H + 19 +

《圖1-11》Hess認為C環與D環會經由過渡態10同時形成58 在人類OSC的結晶結構中，His232與Phe696被認為它們可以藉由 其胺基酸側鏈上所富含π電子的特性，來穩定形成C環時依反-馬可尼 可夫（anti-Markovnikov）法則產生二級碳陽離子，並且可以利用碳 陽離子-π共振作用來穩定帶有正電荷的高能C-20碳陽離子中間物。 然而在酵母菌ERG7胺基酸Phe699位置的定點突變實驗中，除了發現 三環的相關產物以外，還發現了在不同位置脫氫的產物，這結果顯示 Phe699也會對C-17碳陽離子有所影響78。最後氧化鯊烯一連串的環化 步驟會終止在五圓環的D環所形成的C-20原脂醇碳陽離子，這是因為 OSC缺少像SHC中Trp169與Phe605的芳香族性官能基，因此無法藉由 其π電子來穩定C-17二級碳陽離子中間物使其有較長的生命期，而能 更進一步的環化形成E環。

（三）骨架重排與脫氫反應 在環化反應結束之後，酵素會藉由其活性內許多具有高度π電子 性質的芳香族基團之胺基酸（如Trp192、Trp230、His232、Tyr237、 Tyr503、Phe521與Phe696等），透過碳陽離子-π電子的共振作用來 穩定甲基與氫化基的轉移重排，使得C-20四級原脂醇碳陽離子順利轉 變成為C-8/C-9碳陽離子中間物《圖1-12》3,35。在整個骨架重排過程 結束之後，於人類OSC中，具有高度保留性的胺基酸His232（對應到 酵母菌ERG7為His234），由於其鹼性殘基十分靠近C-8/C-9碳陽離 子，所以被認為是能夠接受質子，並進而進行整個環化機制的最後步 驟－脫氫反應的關鍵胺基酸位置。另外，His232除了會透過鄰近的水 分子的交互作用去影響催化反應的進行外，還會與其附近的Tyr503 之側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯作用，使得His232得以位於脫 氫反應的最佳位置《圖1-13》35。

《圖1-12》具有高度保留性的芳香族性胺基酸Trp192、Trp230、 His232、Tyr237 Tyr503、Phe521與Phe696可以利用碳陽離 子-π電子共振交互作用去穩定甲基與氫化基的骨架重排 35_。 《圖1-13》氧化鯊烯環化酵素 與其產物-羊毛硬脂醇形成複 合物的結構圖。圖中所顯示 的胺基酸基團為距離產物在 5Å內的位置，水分子只有在 Asp456及His232附近被觀察 到35。

除了人類OSC的結晶結構外，在酵母菌ERG7中對於His234與 Tyr510的飽和定點突變的實驗結果也更進一步的證明了這兩個胺基 酸在活性區域內所具有的功能。在酵母菌ERG7中His234的定點突變 產 生 了 許 多 在 不 同 地 方 進 行 脫 氫 反 應 的 四 環 產 物 如 protosta-20,24-dien-3β-ol、protosta-12,24-diene-3β-ol還有parkeol59,60。 另外，在Tyr510突變成Ala的突變點中也發現了parkeol61,62。綜合以上 結果，更加證明了His234在酵母菌ERG7活性區域中的功能，除了利 用碳陽離子-π電子的共振作用穩定甲基與氫化基的骨架重排以外， 也會幫助酵素在正確的位置上進行脫氫反應63。

1.3.2 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）

人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之X-ray晶體結構已經被 Thoma等人在2004年解出，發表於當年的Nature期刊中35。由於OSC 結構的確定《圖1-14》，使得學者得以對於酵素活性區域以及其胺基 酸基團可能參與的反應機制有更進一步了解，並且可以利用人類OSC 的結晶結構做為模版，提供結構與反應機制等相關訊息，來研究不同 物種裡面的氧化鯊烯環化酵素。 由人類OSC的結晶結構中可以得知，此酵素位於膜的部分有一個 直徑約25Å的通道，此通道被認為是受質氧化鯊烯進入疏水性活性區 域的入口，並且會對活性區域具有分隔的作用。此受質通道會藉由其 環狀區域胺基酸516~524區域與697~699區域的重排作用，或是藉由 Tyr237、Cys233及Ile524等胺基酸其側鏈構形的改變來形成《圖1-15》。

《圖1-14》人類OSC X-ray 晶體結構，圖中黑色處為抑制劑

Ro48-8071，用以指出與受質結合的反應活性位置35

《圖1-15》人類OSC與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑Ro48-8071

同屬於三萜類環化家族的SHC其X-ray結晶結構也已由Ulrich Wendt於1997年發表在Science期刊《圖1-16a》36。早期的SHC結晶結 構常常被用於作為瞭解OSC環化機制的比較模版，但由於SHC的演化 程度較早，且其受質為鯊烯而非氧化鯊烯，所以將其作為同源性模組 有其限制性。SHC是利用組胺酸-456（Histidine）的殘基來增強Asp376 的酸性，進而活化打開雙鍵的起始環化作用《圖1-16b》39，並且藉由 SHC Trp169的碳陽離子-π電子的共振穩定效應，引起D環的擴張，進 而引導E環的環化而形成五環的蛇麻烯（Hopene）37。而在先前許多 OSC環化機制的研究上，證實了OSC是以氧化鯊烯作為受質，且其B 環是以能量較不傾向的船形（Boat form）構形來摺疊，而環化反映在 D環形成以後終止38。正因為OSC與SHC在環化機制上的明顯差異， 再加上人類OSC與酵母菌OSC的同源性較高，所以利用人類OSC的結 晶結構來研究此高立體選擇性的環化機制是較為恰當35。 《圖1-16》a. SHC之X-ray結晶結構，其中L為抑制劑而E則為受質進 入之孔洞36 b. SHC環化起始假設反應機制39 a. _b.

1.3.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）

在高等植物的酯醇生合成途徑中，受質氧化鯊烯會由氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素催化其環化反應物，生成植物固醇的前驅物－環阿 屯 醇 （Cycloartenol ） ， 進 一 步 的 代 謝 形 成 最 終 產 物 植 物 固 醇 （Phytosterol）。在阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環 化酵素（CAS, EC 5.4.99.8）是由759個胺基酸所組成，分子量為86kDa。 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）與氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素（OSC）在環化的機制上，除了在脫氫的位置不同外，其他地 方基本上均十分相似。兩者都是利用氧化鯊烯作為受質，並且在環化 時受質皆會在酵素活性區內以椅形-船形-椅形的方式摺疊，之後並經 過一連串類似的環化過程而形成C-20原脂醇碳陽離子中間物，並且有 相同的甲基與氫化基轉移機制，只是在進行到最後一步的去質子化步 驟時，氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素會催化C-19上的氫行脫除反應而 生成環阿屯醇，而氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素則催化C-8上的氫脫 除而生成羊毛硬脂醇。另外，學者也發現在兩者的序列比對中，其活 性區域內胺基酸基團只有少數相同，因此這些相異性的位置被認為可 能造成兩者脫氫位置不同的關鍵性胺基酸。所以目前有許多研究就是 針對序列比對上在CAS1與ERG7之間的不同胺基酸序列，利用突變的 方式來加以研究其酵素催化機制上的相關性64,65。 從熱力學的觀點來看，環阿屯醇比羊毛硬脂醇較為不穩定，所以 學者認為環阿屯醇環化酵素之所以可以將產物環化成為能量較不趨 向的環阿屯醇，可能是因為酵素CAS裡的某些特定胺基酸的作用。而 在先前對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素（AthCAS1）的突變實驗中也發 現，Tyr410、His477與Ile481在CAS環化機制中扮演著十分重要的角 色65-68。這些胺基酸在各物種的CAS中皆具有高度保留的特性，但是 在ERG7中則分別以Thr、Cys、Gln及Val的形式存在《圖1-17》。所 以這些胺基酸被認為會促進環阿屯醇的形成，因此若將這些胺基酸進

行突變也可以得到羊毛硬脂醇67。

《圖1-17》Tyr410 (◆), His477 (＊) and Ile481 (▼)在CAS1具有高度保

留性而在ERG7中則被Thr、Cys、Gln或是Val所取代67 舉例來說，Ile481在所有物種中的CAS皆具有高度保留性，而在 ERG7中則為Val《圖1-17》。根據研究結果顯示，Ile481會藉由其γ 位置的甲基來防止碳陽離子與A環上兩支甲基的交互作用，來促使環 阿屯醇的形成。若將Ile481突變成為Val，在產物中可以得到25%的羊 毛硬脂醇與55%的環阿屯醇和20%的parkeol。另外，Ile481也被認為 會利用其較大的立體空間來幫助受質作正確的摺疊，而如果將其突變 成側鏈體積較小的胺基酸（如Ala與Gly）則會得到achilleol A與 camelliol C《圖1-18、表1-1》。 在酵素CAS中，Tyr410與His257被認為在靠近C-19的位置會有氫 鍵配對的交互作用，因此可以藉此幫助最後的去質子化作用67。而在 在AthCAS1Tyr410Thr的突變株中，產物會由原本的環阿屯醇變成75%羊

毛硬脂醇、24% 9β-lanosta-7, 24-dien-3β-ol以及1% Achilleol《圖1-18、 表1-1》。另外，若將Tyr410突變成為Thr時，則會減低碳陽離子中間 物上方的立體空間障礙，而且由於Thr上的氫氧基團較Tyr更接近α-碳，因此在AthCAS1Tyr410Thr突變株中，Tyr532與His257的極性基團將 會被重新排列，因而造成酵素CAS不會產生環阿屯醇，反而會在 C-8/C-9 部 位 上 進 行 脫 氫 反 應 而 形 成 羊 毛 硬 脂 醇 、 parkeol 與

CAS His477雖不位於受質鍵結的活性區域，但是曾有報導指出， 位於活行區外圍（second-sphere）的His477會與Tyr410產生氫鍵的交 互作用而互相拉扯，進而影響環化機制的最終脫氫反應67。His477在 所有物種的CAS中皆具有高度保留性，而在ERG7中則會以Gln或Cys 取而代之。在AthCAS1His477Gln的突變株中，帶有極性的官能基會向C-11 移動靠近，造成在C-11位置行脫氫反應而產生parkeol多於羊毛硬酯醇 的結果；而在AthCAS1His477Asn的突變株中，則會產生大量的羊毛硬酯 醇 ， 但 由 於 其 胺 基 酸 基 團 也 夠 靠 近C-11的位置，所以也會產生 parkeol68。 在整個CAS環化過程中，His257與Asp483被認為是CAS催化活性 上所必須的。Asp483被認為會作為一個路易士酸來幫助環氧基的開 環，以協助環化的起始作用；His257則被認為是位在活性區域的鹼性 基團，能協助C-19上的氫與活性區上的酸基有一質子的來回移動，以 幫 助 在C-19 位 置 上 的 脫 氫 作 用43。 另 外 在 雙 定 點 突 變 突 變 株 AthCAS1I481V/Y410T中，發現其產生羊毛硬酯醇的比例比較其他定點突 變 株 高 出 許 多 ； 然 而 在 三 定 點 突 變 株 （His477Asn/Gln,Ile481Val, Tyr410Thr）中，因為Thr的氫氧基距離Asn與Gln的氨基過遠，所以並 沒有辦法促進羊毛硬酯醇的生成。而經實驗的結果證實，產生羊毛硬 脂醇效率最好的突變株為雙定點突變株AthCAS1H477N/I481V《表1-1》68。 整合上述在植物CAS中的定點突變可以發現，在AthCAS1H477N與

AthCAS1I481V與兩者的雙定點突變株中可以導致植物CAS產生最大量

的羊毛硬脂醇。Suzuki等人在2006年時發表了植物羊毛硬脂醇的合成 酵素，他們從阿拉伯芥中發現At3g45130可以在植物中合成羊毛硬脂 醇，最後名為LAS（lanosterol synthesis）。有趣的是從序列比對中可 以發現到LAS在CAS胺基酸His477與I481位置分別被換成Asn與Val， 這於CAS中的突變結果不謀而合，也顯示了這兩個胺基酸對於羊毛硬 脂醇合成的重要性。

《圖1-18》阿拉伯芥CAS定點突變產物結構圖

AthCAS1 mutants Cycloartenol Lanosterol Parkeol 9ß-Δ7-

Lanosterol Achilleol A Camelliol C

CAS1I481 99 - 1 - - - CAS1I481L 83 1 16 - - - CAS1I481V 55 24 21 - - - CAS1I481A 12 54 15 - 13 6 CAS1I481G 17 23 4 - 44 12 CAS1Y410T - 65 2 33 - - CAS1Y410C - 75 - 24 1 - CAS1H477N - 88 12 - - - CAS1H477Q _{- 22 73 5 - -}

CAS1I481V/ Y410T - 78 < 1 22 - -

CAS1I481V/ H477N/ Y410T - 78 - 22 - -

CAS1I481V/ H477Q/ Y410T - 78 - 22 - -

CAS1I481V/ H477N - 99 1 - - - O HO H H H H O H H H O H H H H O H H H H O H H O H HO H H

(3S)-2,3-oxidosqualene Protosterylyl Cation + lanosterol cycloartenol 9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol Achilliol A Camelliol C Parkeol

1.3.4 鯊烯-蛇麻烯環化酵素（SHC）

在自然界中，細菌與原生動物並不會產生固醇類，而是以五環的 蛇麻烯作為替代。細菌中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素（Squalene-Hopene； SHC）與OSC、CAS同樣屬於三萜類環化酵素家族，而SHC也與OSC 具有類似的環化機制《圖1-19》。從受質的觀點來看，真核細胞的氧 化鯊烯環化酵素利用氧化鯊烯作為受質，而細菌的鯊烯環化酵素則是 利用鯊烯作為受質，所以鯊烯環化酵素被認為出現在演化過程中較早 的厭氧時期。另外，細菌的鯊烯環化酵素對受質的專一性也較低，不 僅可以利用鯊烯作為受質，對於氧化鯊烯或是其光學異構物甚至是一 般的多萜醇也可以進行反應。相反地，真核的氧化鯊烯環化酵素則具 有很高的受質結構專一性。若從環化機制上來觀察，鯊烯環化酵素在 反應機制和形態上都是以較簡單的方式進行。當它在進行環化作用 時，受質會以較穩定的”椅形-椅形-椅形”的結構存在，這使得受質需 要的酵素助力較小，而在細菌的鯊烯環化酵素中，也不具有最後的骨 架重排步驟。 《圖1-19》SHC的環化機制與OSC十分類似 在所有三萜類環化酵素中，A. acidocaldarius 鯊烯-蛇麻烯環化酵 素(SHC, EC5.4.99.x)是最早被結晶出來，並且於1997年Science期刊中 發表其X-ray晶體結構、酵素蛋白的活性區域與可能的反應機制36。從 其結晶結構上可以發現SHC是一個啞鈴型雙聚體膜蛋白，結構中含有 豐富的α螺旋（α-helix）。雖然SHC為膜蛋白，但它並未完全穿透 細菌的細胞膜，其受質鯊烯會經由疏水性的孔道進入酵素的活性區域 H H H OH chair-chair-chair conformation + C22-hopanyl cation 22 hopene hopanol anti-Markovnikov addition Enz-AH+

中《圖1-20》。這些結構的資訊，可用作其它同源性環化酵素家族的 基本模版，並且提供反應機制與酵素結構功能的研究方向。另外， A. acidocaldarius 的 SHC 與 人 類 OSC 的 重 要 胺 基 酸 約 有 20% 相 同 性 （Identity），並由於其具有同源性，因此可以透過SHC結構上的相關 資訊，來推測OSC的環化過程的機制。 《圖1-20》SHC之X-射線晶體結構圖。C：胺基酸的COOH端；N： NH2端；L：抑制劑（LDAO）接合位置；E：酵素表面唯 一的非極性區域，約為1600Å2並被認為是受質進入的通道 （Entrance Channel）。紅色與黃色之滾筒狀緞帶構形為 α-Helix的結構；綠色為β結構；紫色為 QW-Motifs 之重 複區域36 1998 年 Abe 等 人 曾 經 利 用 固 醇 類 抑 制 劑 Ro48-8071 來 研 究 A. acidocaldarius中SHC其酵素結構與催化功能的相關性15。從Ro48-8071

區域位置，以及藉由之前酵素動力學之實驗數據，並可以用來證明 SHC與Ro48-8071間的抑制關係，可以發現胺基酸Asp376在酵素中扮 演著誘導雙鍵打開質子化的角色，並且會與His451間產生氫鍵作用， 另外若加上Tyr495和Asp376與水分子的互相聯繫，增強Asp376所扮 演的路易士酸來協助起始環化反應的角色《圖1-21》。 《圖1-21》藉由目前OSC的抑制劑 Ro48-8071（灰色）與SHC結合的 分子模擬圖，證明Asp376為提供質子起始環化反應15 綜合SHC的結晶結構與定點突變的實驗結果，可以提供我們足夠 的證據，來了解酵素在催化反應進行時，活性區內胺基酸與受質鯊烯 的交互作用64。其中具有芳香族基團特性的胺基酸Trp312與Trp169， 被認為可能是與受質的辨識鍵結有關，而Wendt等人則認為這兩個胺 基酸會利用其碳陽離子-π電子的交互作用分別穩定C-4與碳C-13 （Hopene編號）的碳陽離子中間物《圖1-22》39,64。同樣地，Trp489

結晶結構來看，儘管Tyr609的位置在C-8附近，但Tyr420仍然被認為 具有穩定C-8碳陽離子中間物的功能。因為在定點突變的實驗中，將 Tyr420突變成Ala與Gly時，會得到雙環與三環的產物；另外，Tyr420 也被認為會利用其立體空間的結構來幫助蛇麻烯骨架在B與C環的結 構中進行排列70。在酵素SHC中的Phe605位置除了在空間中十分靠近 E環外，其在所有的SHC也具有高度保留性，然而在OSC並不具有這 個胺基酸，所以Phe605被認為是蛇麻烯E環形成的關鍵39。 《圖1-22》SHC活性區域內假設活性胺基酸的位置與功能71

1.4 （氧化）鯊烯環化酵素之胺基酸序列比對

從序列比對的結果我們可以知道，酵母菌ERG7和人類OSC及細 菌的SHC三者約只有40%的相似度，但它們在結構、立體選擇性與催 化機制上都具有很高的相似性。因此學者們認為這些環化酵素家族催 化生成高度產物的特異性主要是由於下列原因所造成的：（1）有嚴 格的反應機制。反應受質必須結合至酵素上正確的受質結合區，以促 使受質排列成特殊的結構。（2）在環化過程中會產生許多具有高能 量的碳陽離子中間產物。（3）活性區內的芳香族胺基酸會利用碳陽 離子-π電子的交互作用來穩定過渡態的中間產物，因此可以預防早期 環化重組的過程被截斷，以確保產物的順利生成38。 從生物演化的觀點來看，若不同物種間的序列會彼此保留相同的 胺基酸，則此胺基酸可能是在生物體中具備重要功能且不可或缺，所 以才會在不同物種中都被高度保留下來。相反地，較不重要的胺基酸 則會隨物種的需要而產生變異或者根本被剃除掉，所以這些差異可以 幫助我們了解酵素的環化機制。為了探求進一步的資訊，我們利用相 似功能的同一家族酵素其胺基酸序列比對，進而得知彼此間的相同 性、相似性及性質相近之胺基酸在比對序列時其排列之相對應位置， 因而可以用來探討酵素在結構上與功能上的相關性。 而《圖1-23》則列出環化酵素家族的蛋白質序列比對，其中包含：

A. acidocaldarius 的SHC、阿拉伯芥（A. Thaliana）之CAS、阿拉伯

芥（A. Thaliana）LAS與酵母菌（S. cerevisiae）之OSC及人類（H.

Hs_OSC ---MTEGTC---LRRRGGPYKTEPATDLGRWRLN-CERGRQTWTYLQD 41 Sc_OSC ---MTEFYS---DTIG---LPKTDPRLWRLRTDELGRESWEYLTP 36 At_LAS MWRLKLSEGDE---ESVNQHVGRQFWEYDNQFGTSEERHHINHLRSNFTL 47 At_CAS MWKLKIAEGGSPWLRTTNNHVGRQFWEFDPNLGTPEDLAAVEEARKSFSD 50 Aa_SHC --- Hs_OSC ERAGREQTGLEAYALGLDTKN--YFKDLPKAH---TAFEGAL 78 Sc_OSC QQAANDPPSTFTQWLLQDPK---FPQPHPERNKHSPDF---SAFDACH 78 At_LAS NRFSSKHSSDLLYRFQCWKEKGKGMERLPQVKVKEGEERLINEEVVNVTL 97 At_CAS NRFVQKHSADLLMRLQFSREN-LISPVLPQVKIEDTDD--VTEEMVETTL 97 Aa_SHC ---MAEQLVEAP---AYARTL 15 Hs_OSC N-GMTFYVGLQAED-GHWTGDYGGPLFLLPGLLITCHVARIP---LPAGY 123 Sc_OSC N-GASFFKLLQEPDSGIFPCQYKGPMFMTIGYVAVNYIAGIE---IPEHE 124 At_LAS RRSLRFYSILQSQD-GFWPGDYGGPLFLLPALVIGLYVTEVLDGTLTAQH 146 At_CAS KRGLDFYSTIQAHD-GHWPGDYGGPMFLLPGLIITLSITGALNTVLSEQH 146 Aa_SHC DRAVEYLLSCQKDE-GYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVD----RDR 60 Hs_OSC REEIVRYLRSVQLP-DGGWGLHIEDKSTVFGTALNYVSLRILGVGPD--D 170 Sc_OSC RIELIRYIVNTAHPVDGGWGLHSVDKSTVFGTVLNYVILRLLGLPKD--H 172 At_LAS QIEIRRYLYNHQNK-DGGWGLHVEGNSTMFCTVLSYVALRLMGEELDGGD 195 At_CAS KQEMRRYLYNHQNE-DGGWGLHIEGPSTMFGSVLNYVTLRLLGEGPNDGD 195 Aa_SHC MEKIRRYLLHEQRE-DGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRD--E 107 Hs_OSC PDLVRARNILHKKGGAVAIPSWGKFWLAVLNVYSWEGLNTLFPEMWLFPD 220 Sc_OSC PVCAKARSTLLRLGGAIGSPHWGKIWLSALNLYKWEGVNPAPPETWLLPY 222 At_LAS GAMESARSWIHHHGGATFIPSWGKFWLSVLGAYEWSGNNPLPPELWLLPY 245 At_CAS GDMEKGRDWILNHGGATNITSWGKMWLSVLGAFEWSGNNPLPPEIWLLPY 245 Aa_SHC EPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGK 157 Hs_OSC WAPAHPSTLWCHCRQVYLPMSYCYAVRLSAAEDPLVQSLRQELYVEDFAS 270 Sc_OSC SLPMHPGRWWVHTRGVYIPVSYLSLVKFSCPMTPLLEELRNEIYTKPFDK 272 At_LAS SLPFHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGRRFVCRTNGTILSLRRELYTIPYHH 295 At_CAS FLPIHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGKRFVGPITSTVLSLRKELFTVPYHE 295 Aa_SHC RMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVP--ELYETDVPP 205

Hs_OSC IDWLAQRNNVAPDELYTPHSWLLRVVYALLNLYEHHHS---AHLRQRA 315 Sc_OSC INFSKNRNTVCGVDLYYPHSTTLNIANSLVVFYEKYLRN----RFIYSLS 318 At_LAS IDWDTARNQCAKEDLYYPHPKIQDVLWSCLNKFGEPLLERWPLNNLRNHA 345 At_CAS VNWNEARNLCAKEDLYYPHPLVQDILWASLHKIVEPVLMRWPGANLREKA 345 Aa_SHC RRRGAKGG---GGWIFDALDRALHGYQKLSVHP---FRRAA 240 Hs_OSC VQKLYEHIVADDRFTKSISIGPISKTINMLVRWYVDGPASTAFQEHVSRI 365 Sc_OSC KKKVYDLIKTELQNTDSLCIAPVNQAFCALVTLIEEGVDSEAFQRLQYRF 368 At_LAS LQTVMQHIHYEDQNSHYICIGPVNKVLNMLCCWVES-SNSEAFKSHLSRI 394 At_CAS IRTAIEHIHYEDENTRYICIGPVNKVLNMLCCWVED-PNSEAFKLHLPRI 394 Aa_SHC EIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGL 290 Hs_OSC PDYLWMGLDGMKMQGTNGSQIWDTAFAIQALLEAGGHHRPEFSSCLQKAH 415 Sc_OSC KDALFHGPQGMTIMGTNGVQTWDCAFAIQYFFVAGLAERPEFYNTIVSAY 418 At_LAS KDYLWVAEDGMKMQGYNGSQLWDVTLAVQAILATNLVD--DYGLMLKKAH 442 At_CAS HDFLWLAEDGMKMQGYNGSQLWDTGFAIQAILATNLVE--EYGPVLEKAH 442 Aa_SHC ELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPAD---HDRLVKAG 337 Hs_OSC EFLRLSQVPDNPPDYQK-YYRQMRKGGFSFSTLDCGWIVSDCTAEALKAV 464 Sc_OSC KFLCHAQF--DTECVPG-SYRDKRKGAWGFSTKTQGYTVADCTAEAIKAI 465 At_LAS NYIKNTQIRKDTSGDPGLWYRHPCKGGWGFSTGDNPWPVSDCTAEALKAA 492 At_CAS SFVKNSQVLEDCPGDLNYWYRHISKGAWPFSTADHGWPISDCTAEGLKAA 492 Aa_SHC EWLLDRQIT--VPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWAL 385 Hs_OSC LLLQEK--CPHVTEHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD----GGFATYETKRG 508 Sc_OSC IMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSFEYGSFATYEKIKA 515 At_LAS LLLSQMP-VNLVGEPMPEEHLVDAVNFILSLQNKN----GGFASYELTRS 537 At_CAS LLLSKVP-KAIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD----GGLATYELTRS 537 Aa_SHC NTLRLPD---ERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSN----GGWGAYDVDNT 425 Hs_OSC GHLLELLNPSEVFGDIMIDYTYVECTSAVMQALKYFHKRFPEHRAAEIRE 558 Sc_OSC PLAMETLNPAEVFGNIMVEYPYVECTDSSVLGLTYFHKYF-DYRKEEIRT 564 At_LAS YPELEVINPSETFGDIIIDYQYVECTSAAIQGLVLFTTLNSSYKRKEIVG 587 At_CAS YPWLELINPAETFGDIVIDYPYVECTSAAIQALISFRKLYPGHRKKEVDE 587 Aa_SHC SDLPNHIPFCD-FG-EVTDPPSEDVTAHVLECFG---SFGYDDAWK 466

Hs_OSC TLTQGLEFCRRQQRADGSWEGSWGVCFTYGTWFGLEAFACMGQTYRDGTA 608 Sc_OSC RIRIAIEFIKKSQLPDGSWYGSWGICFTYAGMFALEALHTVGETYEN--- 611 At_LAS SINKAVEFIEKTQLPDGSWYGSWGVCFTYATWFGIKGMLASGKTYES--- 634 At_CAS CIEKAVKFIESIQAADGSWYGSWAVCFTYGTWFGVKGLVAVGKTLKN--- 634 Aa_SHC VIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREP-- 514 Hs_OSC CAEVSRACDFLLSRQMADGGWGEDFESCEERRY--LQSAQSQIHNTCWAM 656 Sc_OSC SSTVRKGCDFLVSKQMKDGGWGESMKSSELHSY--VDSEKSLVVQTAWAL 659 At_LAS SLCIRKACGFLLSKQLCCGGWGESYLSCQNKVYTNLPGNKSHIVNTSWAL 684 At_CAS SPHVAKACEFLLSKQQPSGGWGESYLSCQDKVYSNLDGNRSHVVNTAWAM 684 Aa_SHC --YIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAY--AGKGASTPSQTAWAL 560 Hs_OSC MGLMAVRHPDIE--AQERGVRCLLEKQLPNGDWPQENIAG-VFNKSCAIS 703 Sc_OSC IALLFAEYPNKE--VIDRGIDLLKNRQEESGEWKFESVEG-VFNHSCAIE 706 At_LAS LALIEAGQASRDPMPLHRGAKSLINSQMEDGDYPQQEILG-VFNRNCMIS 733 At_CAS LALIGAGQAEVDRKPLHRAARYLINAQMENGDFPQQEIMG-VFNRNCMIT 733 Aa_SHC MALIAGGRAESE--AARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLG 608 Hs_OSC YTSYRNIFPIWALGRFSQLYPERALAGHP 732

Sc_OSC YPSYRFLFPIKALGMYSRAYETHTL---- 731 At_LAS YSAYRNIFPIWALGEYRKLMLSL--- 756 At_CAS YAAYRNIFPIWALGEYRCQVLLQQGE--- 759 Aa_SHC YTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR--- 631

《圖1-23》人類 OSC（H. sapienes OSC；Hs_OSC）、酵母菌 OSC（S.

cerevisiae OSC；Sc_OSC）、阿拉伯芥 LAS（A. thaliana

LAS；At_LAS）、阿拉伯芥 CAS（A. thaliana CAS； At_CAS）與細菌 SHC（A.acidocaldarius SHC；Aa_SHC） 序列比對圖

從不同的環化酵素家族其蛋白質序列比對中，可以發現到一段獨 特的胺基酸序列：Q-W 活性功能區域（Q-W Motif），其序列常為 [ (K/R)(G/A) X2-3 (F/Y/W)(L/I/V) X3QX2-5GXW ]。此功能區域在 SHC 中有八次的重複而在OSC、CAS 中則有五次重複出現42《圖1-24》。 早期學者認為Q-W Motif 與酵素進行環化反應過程中，在鍵的斷裂與 生成時所引起的放熱反應的以及焓（enthalpy）有關，另外也可能藉 由這些功能區域中具有高度保留性的 Tyr 與 Trp，利用其富含π電子 軌域的側鏈與高能量的碳陽離子中間物產生碳陽離子-π電子的交互 作用（cation-π interaction）來穩定這些中間產物。而此推測也符合 Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 的理論模組34。

然而，在 SHC 的 X-ray 結晶結構被解出來以後，卻發現到 Q-W Motif 並不位於酵素的活性區域上，而是位於酵素的表面。這些具有 高度保留性的胺基酸會透過氫鍵與疏水性的交互作用和α螺旋結構 進行鍵結，而 Wendt 等人也認為酵素是利用這些交互作用來穩定本身 的結構，避免被環化過程中所釋放的能量所破壞。所以 Q-W Motif 近年來已被證實並不全部與環化機制有關，反而多是認為其作為穩定 酵素結構的胺基酸的功用。

《圖1-24》Q-W Motif 在環化酵素家族內之分佈情形 H. sapienes OSC

（H.s. OSC ）； S. cerevisiae OSC （ S.c. OSC ）； A.

acidocaldarius SHC（A.a. SHC）； A. thaliana CAS（A.t.

CAS）

OSC (H.S.) QW6 79 NGMTFYVGLQAEDGHW 94

OSC (S.c.) QW6 79 NGASFFKLLQEPDSGIF 95

SHC (A.a.) QW6 17 RAVEYLLSCQKDEGYW 32 CAS (A.t.) QW6 99 RGLDFYSTIQAHDGHW 114 OSC (H.S.) QW5 127 EIVRYLRSVQLPDGGW 142

OSC (S.c.) QW5 127 ELIRYIVNTAHPVDGGW 143

SHC (A.a.) QW5c 63 KIRRYLLHEQREDGTW 78 CAS (A.t.) QW5 139 EMRRYLYNHQNEDGGW 164 SHC (A.a.) QW5b 243 RALDWLLERQAGDGSW 258 SHC (A.a.) QW5a 335 KAGEWLLDRQITVPGDW 363 SHC (A.a.) QW4 402 KGFRWIVGMQSSNGGW 417 OSC (H.S.) QW3 561 TQGLEFCRRQQRADGSW 577

OSC (S.c.) QW3 568 IAIEFIKKSQLPDGSW 583

SHC (A.a.) QW3 470 RAVEYLKREQKPDGSW 485 CAS (A.t.) QW3 591 KAVKFIESIQAADGSW 606 OSC (H.S.) QW2 614 RACDFLLSRQMADGGW 629

OSC (S.c.) QW2 617 KGCDFLVSKQMKDGGW 632

SHC (A.a.) QW2 518 KALDWVEQHQNPDGGW 533 CAS (A.t.) QW2 640 KACEFLLSKQQPSGGW 655 OSC (H.S.) QW1 672 RGVRCLLEKQLPNGDW 687

OSC (S.c.) QW1 675 RGIDLLKNRQEESGEW 690

SHC (A.a.) QW1 576 RGVQYLVETQRPDGGW 591 CAS (A.t.) QW1 702 RAARYLINAQMENGDF 718

1.5 研究目的

氧化鯊烯環化酵素在三萜類生合成途徑中扮演著十分重要的角 色，由於其在生理及演化上的重要性，因此酵素的環化機制與其胺基 酸基團所具有的功能，一直是近年來科學家十分感興趣的研究課題。 研 究 蛋 白 質 結 構 與 功 能 的 方 法 主 要 有 下 列 兩 種 ： 核 磁 共 振 光 譜 （Nuclear Magnetic Resonance，NMR）及蛋白質 X-ray 單晶繞射 （Protein X-ray Crystallography，X-ray diffraction）。但上述兩種方法 皆有所限制，核磁共振光譜只能夠解出分子量較小的蛋白質（小於 30kDa）；而在進行X-ray 單晶繞射之前則必須先純化出一定數量的蛋 白質，但是在利用蛋白質進行結晶試驗時，養晶的條件往往複雜不易 拿捏。而且，我們所研究的氧化鯊烯環化酵素是一種膜蛋白，分子量 大而且十分不穩定且不容易被純化，所以我們無法利用上述兩種方法 來得到氧化鯊烯環化酵素的結構與催化機制間的關係。目前在研究酵 母菌 ERG7 最常見的方式包括利用生物資訊學的方式加以研究其催 化機制與抑制劑間的探討，另外也會利用序列比對，透過同源物種的 結晶結構來模擬探討其催化機制64。 隨著 1997 年細菌的 SHC36與2004 年人類的 OSC35 X-ray 結晶結 構的解讀，提供了我們更多對酵母菌 ERG7 的了解，特別是人類 OSC 的結晶結構。透過這些資訊我們可以知道受質在酵母菌ERG7 整個環 化過程中會經過十幾個鍵的斷裂與生成，最後經由甲基與氫化基的轉 移，然後在不同的地方進行脫氫反應。在環化的過程中，酵素活性區 域的胺基酸基團扮演著辨識受質、穩定中間產物等等十分重要的功 能，所以近年來科學家也針對活性區域內的假設活性胺基酸進行了許 多突變實驗的研究。 在酵素催化機制的研究中，利用突變的技術研究蛋白質功能上的 變化或影響，已經是蛋白質工程及分子生物技術中，一種很常被應用 的方法，而最常見的方法為定點突變與隨機突變。定點突變通常是針

對某個位置的胺基酸進行取代、刪除或嵌入，用以探討某個重要區段 上特定胺基酸序列所執行的功能。而隨機突變是對蛋白質上的胺基酸 序列不預設位置地進行突變效應探討，通常一開始並不知道被突變的 位置，且突變的量之大而需建構成一個突變株庫（library），再設計 篩選方式從中挑選出所要的突變株。 透過胺基酸序列比對我們可以發現到許多在SHC 與 OSC 間都被 保留下來的芳香族胺基酸，而近年來科學家也對這些胺基酸進行了許 多突變實驗來驗證其所具有的功能。例如 Sato 等人在 1998~2000 年 間對細菌 SHC 許多芳香族胺基酸進行了定點突變與酵素動力學的實 驗，在這些實驗中他們發現若將 Trp312（對應到酵母菌 ERG7 為 Trp390；人類 OSC 為 Trp387）突變成 Leu 則會造成酵素失去活性； 而若突變成胺基酸Phe，則 Km值會增加約3.5 倍，Vmax值則沒有改變 《表 1-2》。所以 Sato 等人根據酵素動力學結果，假設 Trp312 在細 菌 SHC 中可能扮演著受質辨認的角色，而辨認受質的引力可能是藉 由芳香環上的π 電子軌域與受質上甲基的 C-H 鍵形成的 CH-π 交互作 用（CH-π interaction），或是利用芳香環上的 π 電子軌域與受質雙鍵 互相堆疊而形成的引力來辨認受質。另外，他們認為將 Trp 突變成 Phe 會使酵素 Km值增加的原因，可能是由於 Phe 相對於 Trp 而言 π 電子密度較低而且較為鬆散才會使得 Km值增加，也就是受質較不容 易鍵結 73。若從 SHC 結晶結構來看，Trp312 則被認為會與提供質子 開環的胺基酸Asp376，或和其周圍的 Asp374、Asp377 互相有交互作 用而影響開環反應74；而Thoma 也由人類 OSC 結晶結構結果觀察認 為 Trp387 會藉由其側鏈中的苯環，並利用其碳陽離子-π 電子的共振 作用來穩定C-6 與 C-10 的碳陽離子中間物《圖 1-12》35。