第三章 實驗結果與討論
3.3 酵母菌 ERG7 Phe528X 功能性分析
3.3.4 ERG7 Phe528X 突變株電腦模擬分析
3.3.4.1 Phe528 在受質通道扮演的角色
在酵母菌 ERG7 的假設活性區域的尾端部分，所具有的芳香族性 胺基酸相對地較為稀少，在加上之前研究認為Phe528 對於骨架重排 與脫氫作用可能會有影響，所以我們本來推測若在這個胺基酸進上行 突變可能可以得到類似的產物，不過從我們的產物分析結果看來似乎 並非如此，所以我們認位為Phe528 的功能可能與受質通道有關。
在下面三張圖中分別顯示了在三個會使酵素失去活性的突變株
ERG7F528D、ERG7F528R與 ERG7 F528T中其在假設受質孔洞附近的胺基
酸之空間相對位置《圖 3-16》《圖 3-17》。從結構上來看，這三個突 變株與野生型酵母菌 ERG7 並沒有太大的改變；若從胺基酸特性來 看，Asp 與 Arg 分別為最強的酸性與鹼性胺基酸。在受質的通道中，
最重要的是維持一個穩定的狀態，所以當裡面的胺基酸突變成為強酸 或強鹼時可能會改變通道的pH 值或是極性，進而使受質無法進入酵 素活性區域中，才會沒有任何產物生成。
《圖3-16》酵母菌突變株 ERG7F528D與附近胺基酸結構模擬圖 T235
lanosterol
F528D
W194
Y239
I531
H234
W232
《圖3-17》A. 酵母菌突變株 ERG7F528R與附近胺基酸結構模擬圖 B. 酵母菌突變株 ERG7F528T與附近胺基酸結構模擬圖
lanosterol
F528T
W194
Y239
I531
T235
H234
W232 lanosterol
F528R
W194
Y239
I531
T235
H234 W232
另外，在 ERG7 F528T的突變株中，由於Thr 並非強酸或強鹼性胺 基酸，而與其同類型的胺基酸也不會使酵素失去活性，我們從《圖 3-17》的電腦模擬圖中也沒有發現太大的結構改變，所以目前 ERG7
F528T會使酵素失去活性的原因尚不清楚。而 Phe528 的空間位置位於
受質尾部下端，在其他的胺基酸突變點中卻會得到少許單環產物 Achilleol A 與 Camelliol C 的原因，我們推測可能是因為突變過後會 些微影響了整個酵素的結構而導致有少許的受質行成單環的產物。我 們也期待未來，酵母菌 ERG7 環化酵素可以被大量表現純化，進而進 行X-ray 結晶結構與酵素動力學的實驗分析，將可以對整個酵素有更 進一步的了解。
第四章 結 論
在整個論文研究中，我們主要是利用定點飽和突變的技術來進行 酵母菌具ERG7 中其活性區域的假設活性胺基酸的功能性研究。透過 QuikChange PCR 我們得以建構 ERG7W390X、ERG7W587X與 ERG7W528X 的三個胺基酸的定點飽和突變株，進而進行突變產物的分析。
這三個胺基酸都對酵素具有特殊的功能，特別是 Trp390 與 Trp587 更是酵母菌 ERG7 中不可或缺的重要胺基酸。它們影響受質進 入酵素的通道與整個催化過程中，包括 A 環與 C 環的形成，還有藉 由與胺基酸的交互作用來影響骨架重排與脫氫步驟。以下將對本篇研 究作一個整理與總結。
4.1 酵母菌 ERG7
W390X功能性分析
（1） 在酵母菌 ERG7W390X的功能性篩選中，除了W390G、W390I、
W390H、W390K、W390R、W390M 與 W390P 會使酵素失去活 性以外，其餘的突變株都可以互補或部分互補原本 Trp390 的功 能。
（2） 在 W390G、W390H、W390K 與 W390R 四個突變株中都沒有 得到任何產物，經過電腦模擬發現，在突變成 Gly 後與 C-2 的 距離會加大到 7.6Å 因而使得在開環之後無法穩定 C-2 碳陽離 子，所以沒有產物生成；亦或許是因為突變過後造成 Asp456 轉向因而影響開環反應。另外，在W390H、W390K 與 W390R 中，則是因為His、Lys 與 Arg 皆為帶正電荷的胺基酸，可能會 與提供質子開環的 Asp456 和開環之後的氫氧基質子互相排斥
（3） 在 W390I、W390M 與 W390P 的突變株中，會使得在 A 環形成 時的C-6 碳陽離子遠離取代胺基酸的位置（距離分別為 7.8Å、
6.9Å 與 8.4Å），進而形成單環產物。另外，W390N、W390E、
W390T、W390C、W390F、W390Y 可能也是因為類似原因而在 羊毛硬脂醇之外，額外生成單環產物。
（4） 總合以上的實驗與電腦模擬結果，Trp390 在酵素內所具有的功 能除了穩定A 環的形成以外，對於開環反應與開環之後的反應 也有會有很大的影響，是一個在催化反應初期十分重要的胺基 酸。
4.2 酵母菌 ERG7
W587X功能性分析
（1） 在酵母菌 ERG7W587X的功能性篩選的結果中，很令人感到興趣 的是只有W587Y 與 W587F 可以互補 Trp587 的部份功能，其餘 的17 種胺基酸突變株都會使得酵素完全失去活性。
（2） 從產物分析表中，可以發現 17 個會使酵素失去活性的胺基酸都 沒有產生任何的產物，這可能是因為酵素需要芳香族胺基酸其 側鏈的苯環作為辨認受質之用，所以除了芳香族胺基酸 Tyr 與 Phe 以外，所有的胺基酸突變株都會因為無法辨認受質而導致 酵素失去活性。
（3） 在 W587Y 的突變株中，其苯環並不像其他在野生型酵母菌 ERG7 中的 Tyr 大部分都是指向受質，而是以其苯環面對受質，
這使得突變株仍然可以辨認受質不致於失去活性。而在整個環 化反應結束後在行骨架的重排時，此突變株中會因為會影響到 胺 基 酸 Tyr99 與 C-13 的 相 對 應 距 離 而 會 生 成
protosta-12(13),24-dien-3ß-ol。最後當骨架重排形成 lanosteryl C-8/C-9 碳陽離子後則會因不同的脫氫作用進一步地產生羊毛 硬脂醇與parkeol。
（4） 若將 Trp587 突變成 Phe，同樣地會因為其仍然具有苯環的部 份，因而可以辨認受質，所以酵素不會失去活性。而 W587F 也會因為相似的原因而產生protosta-12(13),24-dien-3ß-ol、羊毛 硬脂醇與 parkeol。不過在 W587F 突變株中，Y99 改變的角度 更大，因而進一步影響到形成 C 環的 C-14 碳陽離子而生成依 反 瑪 可 尼 可 夫 法 則 的 6-6-5 圓 環 的 三 環 產 物 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。另外，W587F 突變株 中，Phe699 也會受到較大的影響，而改變其與 C-17 碳陽離子 的 角 度 與 距 離 因 而 影 響 骨 架 重 排 反 應 而 形 成 protosta-13(17),24-dien-3ß-ol。
（5） 綜合以上幾點，Trp587 在酵母菌 ERG7 中扮演著連接受質的重 要角色，它是利用其胺基酸側鏈上的苯環來辨認受質。而在環 化過程中，它也可能會利用碳陽離子-π電子的共振作用來穩定 A 環與 B 環的形成過程。另外，將 Trp587 突變成 Tyr 與 Phe 則 會造成附近的重要胺基酸如 Y99 與 F699 的空間結構產生改 變，進而影響整個環化與骨架重排過程，因而形成三環與四環 的產物。
4.3 酵母菌 ERG7
F528X功能性分析
（1） 在麥角固醇補充與反向篩選的結果中，只有 F528D、F528R 與 F528T 無法互補酵素正常功能，使酵素完全失去活性。其餘的 胺基酸都可以使酵素仍然具有正常的功能。
（2） 在 16 個可以互補酵素功能的胺基酸中，有六個胺基酸 F528G、
F528A、F528I、F528Q、F528M 與 F528Y 突變株會連帶產生單 環產物Achilleol A 與 Camelliol C，不過其產量都十分微量，推 測可能是因為突變過後些微影響整體空間結構所造成。
（3） 在突變株 F528D、F528R 與 F528T 中，從電腦模擬結果來看其 空間結構的改變並不是很大，但Asp 與 Arg 分別為最強的酸性 與鹼性胺基酸，所以我們推測可能是因此而影響受質通道的電 性與極性，所以造成受質無法進入酵素中而失去活性。至於 Thr 突變株，目前可能的原因尚不清楚，還需要進一步的實驗來證 明之。
（4） Phe528 這個胺基酸在酵素中所具有的功能，從我們的實驗結果 來看，應該與最後骨架重排或是脫氫反應較無關連。不過，
Phe528 位於假設受質通道的胺基酸上，所以可能可以影響整個 受質孔道的穩定。
第五章 未來展望
在我們的論文中，我們利用定點飽和突變的方式來研究酵母菌 ERG7 中其胺基酸 Trp390、Trp587 與 Phe528 在酵素中對於結構和催 化機制的影響，我們發現它們分別對於 A 環、C 環、骨架重排還有受 質通道具有一定的影響。其中，Trp587 與 Tyr99 和 Phe699 間的交互 作用也讓我們感到十分有趣，所以在未來我們會利用多點突變的實驗 方式進行三者的雙定點突變分析與三定點突變分析，來觀察其產物比 例與變化。
我們也正在努力建構 HEM1、ERG7 與 ERG1 基因缺陷的酵母菌 突變株，其中ERG1 為將鯊烯氧化生成氧化鯊烯的酵素。這個突變株 可以讓我們另外添加受質進行突變株的體外（in vitro）分析實驗，這 樣可以避免下游酵素的影響讓我們得到更多詳細的資訊。另外一個我 們一直努力的方向則是將氧化鯊烯環化酵素進行大量表現與純化，若 可以得到大量的蛋白質我們就可以進行酵素動力學的研究與蛋白質 X-ray 結晶結構的分析，這將使我們對於氧化鯊烯環化酵素有更進一 步的了解。
第六章 參考文獻
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