Trp390 與 A 環形成的關係

在 2004 年所發表的人類 OSC 結晶結構的論文中，曾經指出人類 OSC 的 Trp387 其立體空間位置可能可以透過碳陽離子與π電子的共 振作用對於 A 環或 B 環也就是 C-2、C-6 與 C-10 號上的碳陽離子具 有穩定的作用。經過我們利用人類 OSC 的結構為模版，模擬出的酵 母菌 ERG7 的結構後，我們發現 Trp390 剛好在在 C-2 號位置的上方 並與 A 環較為靠近，且其距離約為 4.1 Å《圖 3-3》，所以我們推測 Trp390 可能對於穩定 A 環形成具有較大的功能。

而在功能性篩選中會使酵素失去活性的幾個胺基酸取代中，

Trp390Gly 的突變株也是沒有得到任何的產物的突變點。我們繼而利 用電腦模擬建構了 ERG7^W390G 的蛋白質結構圖，並且與野生型的 ERG7 進行重疊觀察以了解其結構的變化。在《圖 3-5》中，黃色部 分為經由 Trp390Gly 突變過後的結構而灰色的則為野生型酵母菌的 ERG7，由比較圖中我們可以發現 Asp456 的角度有超過九十度的旋 轉，並且指向另外一側，經過我們比較其相對距離發現，雖然除了 Asp456 會與 Cys457 距離縮短且與 Cys540 的距離變遠之外，並沒有 太大改變《表3-3》，但 Asp456 的角度可能會是影響開環功能的因素。

Wild type ERG7 D456----> O 3.2Å Wild type ERG7 D456----> C457 6.9Å Wild type ERG7 D456----> C540 3.1Å Wild type ERG7 D456----> E460 6.1Å

ERG7^W390G D456----> O 3.3Å

ERG7^W390G D456----> C457 3.4Å ERG7^W390G D456----> C540 4.1Å ERG7^W390G D456----> E460 6.1Å

在《圖 3-5》中，另外一個較大的改變則是突變位置與 C-2 的距 離變化，在野生型ERG7 中 Trp390 與 C-2 的距離為 4.1Å，當突變成 Gly 以後距離增加到 7.6 Å。比較 Gly 與其他的胺基酸，Gly 不具有任 何側鏈且無法提供任何的立體空間障礙使得結構應較為鬆散，再加上 突變過後Gly 與 C-2 的距離變得相當的遠，所以無法提供對於形成 A 環時的C-2 碳陽離子的穩定作用而使得反應在開環以後隨即終止，才

會使得ERG7^W390G也沒有任何產物的生成。

《圖3-5》ERG7^W390G（黃色）與野生型的ERG7（灰色）空間結構比 較

4.1Å 7.6Å

W390G

W587 C540

C457

D456 E460

lanosterol

2

除了上述所討論的四個胺基酸以外，在其餘的胺基酸取代中，除 了羊毛硬脂醇以外，很多胺基酸的突變株中都附帶產生了單環的 Achilleol A 與 Camelliel C，其中在 Ile、Met 與 Pro 三個致死突變點中 則沒有羊毛硬脂醇生成。在這三個會使酵素失去活性的胺基酸突變點 中，ERG7^W390p的產物有 Achilleol A 與 Camelliel C，而 ERG7^W390M與 ERG7^W390I則只有 Achilleol A。

下面《圖 3-6》中顯示了這三個胺基酸突變點與其受質的空間相 對位置，其中ERG7^W390P因為同時有Achilleol A 與 Camelliel 的生成，

所以我們選用 C-6 碳陽離子中間物為其受質進行了電腦模擬，而

ERG7^W390M與ERG7^W390I突變株則以 Achilleol A 作為受質。從下圖中

我們可以發現突變過後的受質 C-6 碳陽離子與突變胺基酸 Pro390、

Ile390 和 Met390 的距離加長分別為 8.4Å、7.8Å 與 6.9Å。這些擴大的 距離可能會使得 C-6 碳陽離子中間物無法被穩定下來而促使其在 A 環形成以後直接進行脫氫終止反應，才會得到全部皆為單環的產物。

雖然在其餘的胺基酸突變株中，產物大部分是以羊毛硬脂醇為 主，但仍有許多會連帶生成單環產物Achilleol A 與 Camelliel C 的突 變株，可見Trp390 在酵母菌 ERG7 中對於 A 環的確具有重要的影響。

在這些其餘的胺基酸取代中，會產生單環產物的原因我們推測可能與 上述Pro、Ile 和 Met 的突變株類似，不過因為在這些胺基酸中可能可 以部分或者是全部互補野生型 ERG7^W390的功能，所以才會產生部分 羊毛硬脂醇的產物。

6

Achilleol A

6

Achilleol A

6

3.2 酵母菌 ERG7

^W587X

功能性分析

3.2.1 建構 ERG7

^W587

飽和定點突變株

為了建構酵母菌 ERG7 ^W587的飽和定點突變株，我們依照第 3.1.1 章節相同的方法，成功地利用QuikChange site-directed mutagenesis kit 建構另一胺基酸ERG7^W587X的定點飽和突變株質體DNA。

3.2.2 ERG7

^W587X

突變株功能性補充篩選

建構完飽和突變質體後，我們利用電穿孔的方式將質體轉植到宿 主細胞中，並依照第 3.1.2 章節所陳述相同的方式進行功能性篩選，

藉由這兩個功能性的篩選我們可以初步辨別經由突變後 Trp587 位置 對酵素環化機制是否具有重要的影響《表3-4》。由功能性篩選的結果 中可以發現除了芳香族性的胺基酸Tyr 與 Phe 外，所有的胺基酸取代 都會導致酵素的失活，所以我們認為 Trp587 其側鏈上的芳香環在環 化過程中一定扮演著十分重要的角色，這個結果令我們對於 Trp587 的功能更加感興趣。

Substitutions for

3.2.3 ERG7

^W587X

突變株產物分析

經過功能性篩選後，我們利用與第 3.1.3 章節相同的方法來進行

ERG7^W587X突變株的產物分析，並由GC-MS 來鑒定產物《圖 3-7》《圖

3-8》與分析產物的比例《表 3-5》。從《表 3-5》中我們可以發現所有 會使酵素失去活性的突變點都沒有得到任何的產物，而在 ERG7^W587Y

與 ERG7^W587F 的 突 變 株 中 產 物 則 是 以 羊 毛 硬 脂 醇 為 主 ， 另 外 在

ERG7^W587Y 的 突 變 株 中 還 產 生 了 少 量 的 四 環 產 物 如 parkeol 與

protosta-12(13),24-dien-3β-ol；而 ERG7^W587F的突變株則額外生成了四 環 的 protosta-13(17),24-dien-3β-ol 與 三 環 的 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。

Products percentages (%) Substitutions for

Trp390 1 2 3 4 5

containing Met(M) No product Tyr(Y) 89.7 4.1 6.2 0 0 Aromatic

Group Phe(F) 78.8 10.5 7.6 2.3 0.8 Imino Pro(P) No product

《表 3-5》酵母菌 ERG7^W587X 產物分析表，其中 1 為羊毛硬脂醇

（lanosterol）；2 為 protosta-12(13),24-dien-3ß-ol；3 為 protosta-13(17),24-dien-3ß-ol ； 4 則 為 (13αH)

《圖 3-7》酵母菌 ERG7^W587Y 與 ERG7^W587F 突變株產物相對應時間 圖 ， 其 中 LA 為 羊 毛 硬 脂 醇 ； 1 為 protosta-12(13),24-dien-3ß-ol ； 2 為 parkeol ； 3 為 protosta-13(17),24-dien-3ß-ol ； 4 為 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol

Trp587Tyr

LA

1 2

Trp587Phe

LA

1 2

4 3

《圖3-7》酵母菌 OSC ERG7^W587Y產物 MS 圖譜結構對照圖

《圖 3-8》酵母菌 ERG7^W587Y與 ERG7^W587F突變株產物質譜與結構對

Protosta-12(13),24-dien-3ß-ol

HO

H H

H H

Parkeol

HO H

H

H

(13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol

HO H

H H

Protosta-13(17),24-dien-3ß-ol

HO H

H

3.2.4 ERG7

^W587X

突變株電腦模擬分析

在 ERG7^W587X突變株的電腦模擬分析方面，我們使用與第 3.1.4 章節相同的方式，並利用國家高速網路中心的化學軟體資料庫與其應 用程式來進行野生型ERG7 與突變株的電腦模擬。

下圖顯示了在野生型的 ERG7 中，當我們以羊毛硬脂純為受質 時，Trp587 與其附近一些重要胺基酸的空間相對應位置《圖 3-9》。

在人類 OSC 中，相對應 ERG7 中 Trp587 位置的 Trp581 被認為會藉 由碳陽離子與π電子共振作用來穩定 A 環與 B 環在形成過程中所產 生的 C-6 和 C-10 的碳陽離子中間物；但由產物的分析結果中發現我 們在酵母菌ERG7^W587X的突變株中得到了三環與四環的產物，更令人 感到有趣的是除了芳香族胺基酸以外，其它的突變點都會使得酵素完 全失去活性，這也引起了我們對Trp587 極大的興趣。

《圖3-9》野生型酵母菌 ERG7^Trp587與附近胺基酸結構模擬圖

W390

H234

W587 F699

Y510

Lanosterol

4.4 Å

4.2 Å 4.1 Å 3.76 Å

2 6

10 17

Y99

3.2.4.1 Trp587 與受質間的關係

在先前細菌 SHC 的酵素動力學的研究中，曾經指出 Trp489（其 對應到酵母菌ERG7 為 Trp587）在環化酵素中可能扮演著辨認受質的 功用，因為若將其突變成Val 與 Leu 都會使酵素完全失去活性 ⁷³。而

在酵母菌ERG7^W587X突變株中，我們所得到的結果是除了芳香族性胺

基酸ERG7^W587Y與ERG7^W587F外，所有的突變株都會導致酵素失去活

性。

芳香族胺基酸的最大特點是在於其側鏈上所具有的芳香環，這些 芳香環在其環的上下方富含π電子雲，許多研究都曾指出這些芳香族 胺基酸會利用其π電子與受質的碳陽離子產生碳陽離子與π電子的 共振作用來穩定受質的環化過程，這也使得芳香族胺基酸在酵素內顯 得格外重要。另外，還有研究指出芳香族胺基酸可以利用其π電子與 受質的甲基形成 CH-π的交互作用或是與受質的π軌域互相堆疊形 成辨認受質的力量。這個特點在酵母菌 ERG7 的胺基酸 Trp587 中可 以十分明顯的被觀察到。因此我們將以不含有π電子的ERG7^W587V和

ERG7^W587L突變株與野生型 ERG7 的電腦模擬圖為例，加以比較並進

行說明。

從《圖 3-10A》中，我們可以發現在突變過後 Trp587 附近的胺 基酸空間位置幾乎沒有改變，但因為 Val 並不具有芳香族的π電子雲 來與受質交互作用，使得酵素無法辨認受質而失去活性；而在《圖 3-10B》中，雖然 Leu587 附近的胺基酸結構產生些許的改變，但 Leu 仍然因為不具有辨認受質的能力而會使酵素失去活性。同樣地，在其 他十五個非芳香族的胺基酸中我們都可以觀察到類似的現象，所以我 們可以推測Trp587 在酵母菌 ERG7 中具有辨認受質的重要功能。

《圖3-10》A. ERG7^W587V突變株（黃色）與野生型ERG7（灰色）其 空間結構的比較 B. ERG7^W587L 突變株（黃色）與野生型 ERG7（灰色）其空間結構的比較

W390

H234

W587V

F699 Y510

Lanosterol Y99

A

W390

H234

W587L

F699 Y510

Lanosterol Y99

B

3.2.4.2 Trp587 在環化過程所扮演的角色

從《圖 3-9》野生型酵母菌 ERG7 的結構模擬圖中，我們可以發

現 Trp587 位於 A 環與 B 環的下方，這也就是其在人類 OSC 中被認 為會藉由碳陽離子-π電子的共振作用來穩定 A 環與 B 環形成的理 由，不過在細菌 SHC 中曾經有較不一樣的實驗結果被提出。從細菌 SHC 的結晶結構中我們可以發現其 Trp489（對應到酵母菌 ERG7 為 Trp587）的空間位置也是位於 A 環與 B 環的下方，但是在 Trp489 的 定點突變實驗中卻會使產物除了得到五圓環的蛇麻烯和蛇麻醇之 外，還會生成6-6-6-5 圓環的四環新產物。這個實驗結果顯示 Trp587 可能不是直接影響 A 環與 B 環的形成，而是透過與其他附近胺基酸 的交互作用來影響接下來的環化反應。

從我們的產物分析結果中《表 3-5》，我們可以發現在 ERG7^W587Y 的 突 變 株 中 我 們 得 到 了 一 個 四 環 的 產 物 protosta-12(13),24-dien-3β-ol，而在 ERG7^W587F的突變株中還額外多得 到了四環的 protosta-13(17),24-dien-3β-ol 與 6-6-5 圓環的三環產物 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。這個結果除了再度證 明酵母菌 ERG7 需要 Trp587 提供芳香環來辨認受質外，也說明了 Trp587 可能會間接地影響 C-14 與 C-17 的碳陽離子附近的胺基酸，才 會得到三環與在不同位置行脫氫反應的四環產物。

在下圖《圖 3-11》的兩張結構模擬圖中，

《圖3-11A》是 ERG7^Trp587Tyr 突變株的結構模擬圖，因為在 ERG7^Trp587Tyr的突變株中，我們得到了 protosta-12(13),24-dien-3β-ol，所以我們選用 C-13 的碳陽離子作為受 質進行入塢（docking）電腦模擬；《圖 3-11B》則是 ERG7^W587F突變 株 的 結 構 模 擬 圖 ， 因 為 其 得 到 了 三 環 的 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol，所以我們選用 C-14 的碳陽離 子中間物為受質進行入塢電腦模擬。從圖A 中，我們可以發現將 Trp

《圖3-11》A. 在 ERG7^W587Y突變株中，我們以C-13 的碳陽離子中間 物 為 受 質 進 行 入 塢 （docking ） 的 結 構 模 擬 圖 B. 在

ERG7^W587F突變株中，我們以 C-14 的碳陽離子中間物為受

質進行入塢的結構模擬圖 Y99

W587Y

Y707

F699

C-13 cation +

A

13

5.9 Å

W587F

Y707 Y99

F699

C-14 cation +1

B

4.8 Å

與Tyr707 等），總是指向以受質提供一個立體空間障礙，反而是以它 的芳香環來面對受質，這個特性使得Tyr 也可以提供它的苯環來辨認 受質，並且可以利用它的π電子雲來穩定 C-6 與 C-10 的碳陽離子，

與Tyr707 等），總是指向以受質提供一個立體空間障礙，反而是以它 的芳香環來面對受質，這個特性使得Tyr 也可以提供它的苯環來辨認 受質，並且可以利用它的π電子雲來穩定 C-6 與 C-10 的碳陽離子，

在文檔中 利用定點飽和突變的方法針對酵母菌中氧化鯊烯環化酵素內高度保留之芳香族胺基酸進行功能性的分析 (頁 82-0)