Trp587 在環化過程所扮演的角色

從《圖 3-9》野生型酵母菌 ERG7 的結構模擬圖中，我們可以發

現 Trp587 位於 A 環與 B 環的下方，這也就是其在人類 OSC 中被認 為會藉由碳陽離子-π電子的共振作用來穩定 A 環與 B 環形成的理 由，不過在細菌 SHC 中曾經有較不一樣的實驗結果被提出。從細菌 SHC 的結晶結構中我們可以發現其 Trp489（對應到酵母菌 ERG7 為 Trp587）的空間位置也是位於 A 環與 B 環的下方，但是在 Trp489 的 定點突變實驗中卻會使產物除了得到五圓環的蛇麻烯和蛇麻醇之 外，還會生成6-6-6-5 圓環的四環新產物。這個實驗結果顯示 Trp587 可能不是直接影響 A 環與 B 環的形成，而是透過與其他附近胺基酸 的交互作用來影響接下來的環化反應。

從我們的產物分析結果中《表 3-5》，我們可以發現在 ERG7^W587Y 的 突 變 株 中 我 們 得 到 了 一 個 四 環 的 產 物 protosta-12(13),24-dien-3β-ol，而在 ERG7^W587F的突變株中還額外多得 到了四環的 protosta-13(17),24-dien-3β-ol 與 6-6-5 圓環的三環產物 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。這個結果除了再度證 明酵母菌 ERG7 需要 Trp587 提供芳香環來辨認受質外，也說明了 Trp587 可能會間接地影響 C-14 與 C-17 的碳陽離子附近的胺基酸，才 會得到三環與在不同位置行脫氫反應的四環產物。

在下圖《圖 3-11》的兩張結構模擬圖中，

《圖3-11A》是 ERG7^Trp587Tyr 突變株的結構模擬圖，因為在 ERG7^Trp587Tyr的突變株中，我們得到了 protosta-12(13),24-dien-3β-ol，所以我們選用 C-13 的碳陽離子作為受 質進行入塢（docking）電腦模擬；《圖 3-11B》則是 ERG7^W587F突變 株 的 結 構 模 擬 圖 ， 因 為 其 得 到 了 三 環 的 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol，所以我們選用 C-14 的碳陽離 子中間物為受質進行入塢電腦模擬。從圖A 中，我們可以發現將 Trp

《圖3-11》A. 在 ERG7^W587Y突變株中，我們以C-13 的碳陽離子中間 物 為 受 質 進 行 入 塢 （docking ） 的 結 構 模 擬 圖 B. 在

ERG7^W587F突變株中，我們以 C-14 的碳陽離子中間物為受

質進行入塢的結構模擬圖 Y99

W587Y

Y707

F699

C-13 cation +

A

13

5.9 Å

W587F

Y707 Y99

F699

C-14 cation +1

B

4.8 Å

與Tyr707 等），總是指向以受質提供一個立體空間障礙，反而是以它 的芳香環來面對受質，這個特性使得Tyr 也可以提供它的苯環來辨認 受質，並且可以利用它的π電子雲來穩定 C-6 與 C-10 的碳陽離子，

因此可以部分互補了原本 Trp587 的功能，所以整個環化反應才沒有 在 A 環或是 B 環形成之後就被迫終止。而在整個環化反應結束後，

酵素開始進行去質子化的脫氫作用，不過由於突變過後的 Tyr587 影 響到整體的空間結構，使得 Tyr99 對於 C-13 的距離由在野生型酵母 菌ERG7 中的 5.2Å 加長到 5.9 Å，這個改變使得 C-13 的碳陽離子較 不 穩 定 ， 而 在 此 步 驟 變 形 脫 氫 反 應 而 形 成 雙 鍵 才 會 產 生 protosta-12(13),24-dien-3β-ol。

在《圖 3-11B》的 ERG7^W587F突變株結構模擬圖中，同樣地我們 可以發現Phe 可以提供其苯環來辨認受質與穩定 A 環與 B 環的形成，

因此可以部分互補 Trp587 的功能。與 ERG7^W587Y突變株結果不同的 地方，在於它產生了在 C-14 號碳陽離子終止的 6-6-5 圓環的三環產 物(13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。我們推測這是由於 在突變成 Phe 之後改變了 Tyr99 對於 C-14 碳陽離子的距離，從原本 的 3.8Å 增加為 4.8Å 因而使 C-14 碳陽離子不夠穩定，因而造成部分 受質在此便行終止反應而形成三環的產物。另一部分的受質在完成環 化反應以後，則依照與ERG7^W587Y突變株中相似的機制而同樣形成四 環的 protosta-12(13),24-dien-3β-ol。另外，還有一部分受質則因為 Phe699 的角度與距離的改變，因而影響 C-17 碳陽離子的穩定而生成 protosta-13(17),24-dien-3β-ol《圖 3-12》。

在《圖 3-12》中，我們將野生型的酵母菌 ERG7（綠色）與

ERG7^W587Y（紅色）與 ERG7^W587Y（藍色）突變株的結構進行重疊，

來觀察其空間相對應位置的變化，並且標示出重要胺基酸與受質羊毛 硬脂醇間的距離《表3-6》。從圖中我們可以發現在ERG7^W587Y的突變

環產物；同樣地，ERG7^W587F的 Phe699 與其在另外兩個突變環化酵素 中，其角度相差較大進而影響在 C-17 位置的脫氫反應因而形成產物。

《圖3-12》ERG7^W587Y（紅色）ERG7^W587F（藍色）與野生型ERG7（綠 色）的空間結構比較圖

《表3-6》ERG7^W587Y、ERG7^W587F和野生型ERG7 胺基酸與受質相對 應的距離比較表

ERG7^W587 Y99----> C-13 5.2 Å ERG7^W587 Y99----> C-14 3.9 Å ERG7^W587 F699---> C-17 3.8 Å ERG7^W587Y Y99----> C-13 4.9 Å ERG7^W587Y Y99----> C-14 3.6 Å ERG7^W587Y F699---> C-17 3.8 Å ERG7^W587F Y99----> C-13 5.6 Å ERG7^W587F Y99----> C-14 4.2 Å ERG7^W587F F699---> C-17 3.4 Å W587F/Y

Lanosterol

Y99

F699

Y707

14

17

3.2.5 ERG7

^W587X

產物生成途徑推測

《圖 3-13》為酵母菌 ERG7^W587X其定點飽和突變的產物生成途徑 推測圖。在所有突變點中只有 ERG7^W587F與ERG7^W587Y不會使酵素失 去活性而有產物的生成。在這兩個突變株中，受質氧化鯊烯會依照椅 型-船型-椅型（chair-boat-chair）的結構排列，當環化反應進行到欲行 C 環擴環之前的依反馬可尼可夫法則形成的 6-6-5 碳-14 碳陽離子中 間 物 時 ， 有 一 部 分 受 質 會 在 此 行 終 止 反 應 而 形 成 (13αH) isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol。

接著 C 環會進行擴環而形成六圓環，等到 D 環形成以後，環化 反應便告一段落而形成 prosteryl C-20 的碳陽離子中間物。再來便開 始行骨架重排的反應，C-17 上的氫基會轉移到 C-20 而形成 prosteryl C-17 的碳陽離子中間物，由於突變株影響了附近胺基酸 Phe699 而使 得部分受質在此終止反應而形成 protosta-13(17),24-dien-3β-ol。然後 C-13 的氫基再轉移到 C-17 而形成 prosteryl C-13 碳陽離子中間物，又 因為突變後影響 Tyr99 的距離與角度使得一部分受質在此形成 protosta-12(13),24-dien-3β-ol。最後，經過一連串的氫基與甲基轉移形 成最終的lanosteryl C-8/C-9 cation，由於在不同的位置行脫氫反應進 而生成parkeol 與 lanosterol。

《圖3-13》ERG7^W587X產物假設生成路徑推測圖 protosteryl C-13 cation

O

protosta-13(17), 24-dien-3β-ol

HO

lanosteryl C-8/C-9 cation

ERG7^W587X HO

H

H H

protosteryl C-17 cation

HO

C-14 cation

3.3 酵母菌 ERG7

^F528X

功能性分析

3.3.1 建構 ERG7

^F528

飽和定點突變株

建構酵母菌 ERG7^F528的定點飽和突變株，我們是比照與第 3.1.1 章節相同的方法，利用QuikChange site-directed mutagenesis kit 建構

胺基酸ERG7 ^F528X的定點飽和突變株質體DNA。

3.3.2 ERG7

^F528X

突變株功能性補充篩選

建構完飽和突變質體後，我們利用電穿孔的方式並依照第 3.1.2 章節所述相同的條件以進行功能性篩選，我們藉由這兩個功能性篩選 可以初步辨別經突變後的 Phe 取代胺基酸對酵素環化機制上是否具 有重要的影響《表3-7》。從下表中可以發現除了 Asp、Arg 與 Thr 以 外，大部分的胺基酸突變株都可以互補或是部分互補原本 Phe528 的 功能，並不會使酵素失去活性。

Substitutions for

3.3.3 ERG7

^F528X

突變株產物分析

經過功能性篩選後，我們利用與第 3.1.3 章節相同的方法來進行

ERG7 ^F528X突變株的產物分析，並由 GC-MS 來鑒定產物《圖 3-14》

與分析產物的比例《表3-8》。

從這張表看起來，大部分的產物都是以羊毛硬脂醇為主，另外還 有幾個胺基酸會產生少量的單環產物Achilleol A 與 Camelliol C。另 外，在三個會使酵素失去活性的胺基酸則是都沒有產物的生成。

Products percentages (%) Substitutions for

Phe528 lanosterol Achilleol A Camelliol C Gly(G) 73.7 19.7 6.6

《圖3-14》酵母菌 ERG7^F528X產物質譜與其結構對照圖

Lanosterol

HO

H

H

lanosterol

Achilleol A

HO H

Achilleol A

Camelliol C

HO H

Camelliol C

3.3.4 ERG7

^F528X

突變株電腦模擬分析

在 ERG7 ^F528X突變株電腦模擬分析方面，我們使用與第 3.1.4 章 節中所述的相同的方式，並利用國家高速網路中心的化學軟體資料庫 與其應用程式來進行野生型酵母菌ERG7 與其突變株的電腦模擬。在 先前細菌SHC 與人類 OSC 的結晶結構中，Phe528 都被認為可能會影 響最後骨架重排與脫氫作用的過程，不過在我們的產物中並沒有發現 類似的生成物。另外，在人類OSC 中，Phe528 還被認為是總成受質 進入酵素的環狀通道胺基酸之一，這也將會是接下來我們討論的重 點。

下圖為野生型酵母菌 ERG7 的空間結構模擬圖，這張圖列出了假 設受質孔道（紫色）附近的一些胺基酸，這些胺基酸被認為是構成受 質進入酵素的通道，所以若在Phe528 進行突變可能會改變通道構型 而影響受質進入酵素。

lanosterol F528

W194

Y239

I531

T235

H234

W232

3.3.4.1 Phe528 在受質通道扮演的角色

在酵母菌 ERG7 的假設活性區域的尾端部分，所具有的芳香族性 胺基酸相對地較為稀少，在加上之前研究認為Phe528 對於骨架重排 與脫氫作用可能會有影響，所以我們本來推測若在這個胺基酸進上行 突變可能可以得到類似的產物，不過從我們的產物分析結果看來似乎 並非如此，所以我們認位為Phe528 的功能可能與受質通道有關。

在下面三張圖中分別顯示了在三個會使酵素失去活性的突變株

ERG7^F528D、ERG7^F528R與 ERG7 ^F528T中其在假設受質孔洞附近的胺基

酸之空間相對位置《圖 3-16》《圖 3-17》。從結構上來看，這三個突 變株與野生型酵母菌 ERG7 並沒有太大的改變；若從胺基酸特性來 看，Asp 與 Arg 分別為最強的酸性與鹼性胺基酸。在受質的通道中，

最重要的是維持一個穩定的狀態，所以當裡面的胺基酸突變成為強酸 或強鹼時可能會改變通道的pH 值或是極性，進而使受質無法進入酵 素活性區域中，才會沒有任何產物生成。

《圖3-16》酵母菌突變株 ERG7^F528D與附近胺基酸結構模擬圖 T235

lanosterol

F528D

W194

Y239

I531

H234

W232

《圖3-17》A. 酵母菌突變株 ERG7^F528R與附近胺基酸結構模擬圖 B. 酵母菌突變株 ERG7^F528T與附近胺基酸結構模擬圖

lanosterol

F528T

W194

Y239

I531

T235

H234

W232 lanosterol

F528R

W194

Y239

I531

T235

H234 W232

另外，在 ERG7 ^F528T的突變株中，由於Thr 並非強酸或強鹼性胺 基酸，而與其同類型的胺基酸也不會使酵素失去活性，我們從《圖 3-17》的電腦模擬圖中也沒有發現太大的結構改變，所以目前 ERG7

F528T會使酵素失去活性的原因尚不清楚。而 Phe528 的空間位置位於

受質尾部下端，在其他的胺基酸突變點中卻會得到少許單環產物 Achilleol A 與 Camelliol C 的原因，我們推測可能是因為突變過後會 些微影響了整個酵素的結構而導致有少許的受質行成單環的產物。我 們也期待未來，酵母菌 ERG7 環化酵素可以被大量表現純化，進而進 行X-ray 結晶結構與酵素動力學的實驗分析，將可以對整個酵素有更 進一步的了解。

第四章 結 論

在整個論文研究中，我們主要是利用定點飽和突變的技術來進行 酵母菌具ERG7 中其活性區域的假設活性胺基酸的功能性研究。透過 QuikChange PCR 我們得以建構 ERG7^W390X、ERG7^W587X與 ERG7^W528X 的三個胺基酸的定點飽和突變株，進而進行突變產物的分析。

這三個胺基酸都對酵素具有特殊的功能，特別是 Trp390 與 Trp587 更是酵母菌 ERG7 中不可或缺的重要胺基酸。它們影響受質進 入酵素的通道與整個催化過程中，包括 A 環與 C 環的形成，還有藉 由與胺基酸的交互作用來影響骨架重排與脫氫步驟。以下將對本篇研 究作一個整理與總結。

4.1 酵母菌 ERG7

^W390X

功能性分析

（1） 在酵母菌 ERG7^W390X的功能性篩選中，除了W390G、W390I、

（1） 在酵母菌 ERG7^W390X的功能性篩選中，除了W390G、W390I、

在文檔中 利用定點飽和突變的方法針對酵母菌中氧化鯊烯環化酵素內高度保留之芳香族胺基酸進行功能性的分析 (頁 94-0)