細菌與真菌濃度定量方法

根據生物微粒的特性及採用的採樣器類型，空氣中微生物定量方法可分 為 culturable 與 nonculturable，分別敘述如下：

1. Culturable

傳統上微生物培養通常使用於菌種鑑定，根據不同微生物所需的營養素 與生長環境，將其培養在半固體培養基 (agar) 上，應用於室內空氣品質測 量時，可藉由採樣後經培養計算菌落數，得到空氣中微生物濃度，但也由於

培養上的限制，經常會出現可培養微生物濃度低估情形，且不適用於病毒、

傳染性微生物或病原體。然而因為各種微生物的需求不同，目前尚無任何全 面性培養基可培養所有的微生物，故在量測空氣中可培養微生物濃度時，僅 選擇無篩選性的培養基如培養真菌的 dichloran glycerol 18 (DG18) agar、rose bengal agar (RBA)、malt extract agar (MEA)、培養細菌的 R2A agar、trypitcase soy agar (TSA)、casein soy peptone agar (CSPA)、nutrient agar (NA)等。除了 菌種與菌種之間的相互作用可能抑制或促進微生物生長，為使這些培養基僅 生長所期望的微生物，可額外添加除必需營養素外的化學藥劑以達到目的，

如 在 培 養 真 菌 的 培 養 基 中 會 增 添 氯 四 環 素 (chlortetracycline) 、 鏈 黴 素 (streptomycin)、氯黴素 (chloramphenicol)、等抗生素以抑制細菌生長，在培 養細菌的培養基中則會添加環己醯亞胺 (cycloheximide) 以抑制真菌生長，

另外有些真菌培養基為限制生長快速的菌種如 Mucor 或 Rhizopus，也會添 加 減 緩 其 生 長 速 度 的 藥 劑 (Eduard and Heederik, 1998; Lonon, 1998;

Martinez et al., 2004)。

當微生物採樣至適合的培養基上，需根據微生物種類予以適當的溫度與 時間培養，如大部分真菌於室溫下培養 3-7 天、細菌於 25-30℃下培養 7 天，

高溫放射菌則於 45-56℃下培養 7 天以上，培養後便可透過肉眼計算培養基 上菌落數，同時也可根據觀察或特定方式鑑定部分菌種，如真菌方面可透過 菌落的生長情形與感官感覺 (如顏色、外表、氣味、構造)，細菌方面則可 透過菌落型態、產生的代謝物、格蘭氏染色、培養於特殊生長條件或特殊基 質篩選等方式。計數時，通常以 colony forming units (CFU) 做為菌落數的單 位，其除以採樣器進流的空氣體積便是生物氣膠的濃度單位，常用單位為 CFU/m³，通常一個培養皿內推薦的菌落數範圍在 30-300 CFU 之間，但菌落 大小與菌落在培養基上的密集度也會影響計數的準確性，例如當菌落數過於

密集或集中生長於某區塊，菌落與菌落間可能會互相融合，造成低估情形 (Eduard and Heederik, 1998; Lonon, 1998; Martinez et al., 2004)。

當採樣器的衝擊目標為培養基時，可直接將培養基置於適當條件下進行 培養，而當採樣器的衝擊目標為 impinger 的收集液、filter 的萃取液、明膠 或纖維素膜濾紙時，除了可直接置於培養基中培養，還可進行一系列各種倍 率的稀釋步驟，再利用平板稀釋 (dilution plating) 法培養，使用此方法的優 點為可避免培養皿菌落生長超載、可在最適菌落密集度下計數、以及可在多 種培養基、溫度與時間條件下培養，使不同生長環境的微生物皆得以計數，

缺點為微生物收集液、萃取液以及稀釋液的成分會影響所收集微生物的培養 率，另外由於這些液體可能會使原本為聚合狀態的微生物分散或被切斷，導 致計數結果經常高於直接採樣於培養基上後培養 (Eduard and Heederik, 1998; Martinez et al., 2004)。

2. Nonculturable

使用非培養方法定量微生物的主要工具為顯微鏡，根據顯微鏡的原理可 分 為 光 學 顯 微 鏡 技 術 (light microscopy, LM) 、 發 射 螢 光 顯 微 鏡 技 術 (fluorescence microscopy, FM) 以 及 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 技 術 (scanning electron microscopy, SEM)，當直接以顯微鏡計算氣膠顆粒數量時，尚需參考 顯微鏡計數範圍面積、樣品沉澱範圍面積、採樣器空氣進流量來計算，才能 得到生物氣膠濃度的測量值，其優點為可同時計算 culturable 與 nonculturable 生物微粒，缺點則是若生物氣膠若聚合成團，易影響顆粒計數的準確性。然 而隨著顯微鏡技術的發展與結合其他科技技術，近年來也有人使用可自動計 數的流式細胞技術 (flow cytometry) (Martinez et al., 2004)，其與前述三個顯 微鏡技術各有其優劣與適用時機，茲分別敘述如下：

(1) Light microscopy

光學顯微鏡技術可根據生物氣膠的大小、形狀、顏色或構造，用來直接 計算如真菌、細菌、孢子、花粉、塵 螨等顆粒之數量，尤其特別適用於孢子 計數，而採樣器方面則可應用於以載玻片為衝擊目標的 impactor、採用聚碳 酸酯或纖維素酯濾紙的過濾式採樣器。除了生物氣膠顆粒定量方面的運用，

光學顯微鏡技術也可用來分析微生物種類或特性，例如透過格蘭氏染色法，

可分辨細菌為格蘭氏陽性或陰性菌，此兩類細菌各有其特性與構造，但由於 光學顯微鏡解析度不足，無法由細菌的外觀型態鑑定其種類；而對於真菌孢 子，則可透過顯微鏡觀察其外型，比對文獻記錄的外觀形態，分析出真菌種 類，但針對粒徑較小的真菌孢子，依然存在辨識上的困難度 (Eduard and Heederik, 1998; Martinez et al., 2004)。

(2) Fluorescence microscopy

螢光顯微技術是以螢光染料染色微生物，利用紫外光射在螢光物質上會 激發出可見光的特性，採用波長較短的紫外光為光源，藉以標定目標微生物，

可達較光學顯微技術高的解析度，但其缺點為設備昂貴、操作複雜且標本事 前準備費時。不同的螢光染料可用來標定某些特定的微生物或微生物的不同 部 位 ， 如 6-diamidino-2-phenyl-indole (DAPI) 可 用 來 標 定 細 胞 DNA 、 fluorescein isothiocyanate (FITC) 可用來標定蛋白質、fluorescein diacetate (FDA) 可用來標記 viable 真菌、而 Acridine orange 則是最常被使用的螢光 染料，可用來分辨細胞是否具有生命現象，使生物微粒計數工作較為容易，

避免環境中其他無生命微粒干擾。然而螢光染料也有其適用範圍，例如真菌 孢子便難以被螢光染料染色，或染色後可能會色素沉澱失去螢光，易造成視 覺上的誤判；而樣品的複雜的事前準備工作及微生物聚合成較大顆粒，也可 能造成計數時的數量低估。在採樣器方面螢光顯微技術可應用於使用毛細管

膜濾紙的過濾式採樣器、nonculturable impactor的後續定量或鑑定工作上 (Eduard and Heederik, 1998; Martinez et al., 2004)。

(3) Scanning electron microscopy

掃描式電子顯微鏡技術與LM及FM相較起來，擁有較高的解析度、視野 深度與放大倍率，但設備更為昂貴且需專人技術處理，為國家貴重儀器之一。

其原理係利用一波長極短的電子束為光源，照射在樣品標本表面後激發第二 次電子束反射，反射的電子束為電子接收器接收後，經一 連串影像放大，會 在螢幕上呈現3-D的物體外表影像結構，優點為可根據黴菌孢子外觀鑑定菌 種，如Rhizopus與Aspergillus，也可偵測到粒徑微小的病毒與真菌孢子，如 放射菌類 (actinomycete)，但習慣上SEM極少應用於生物氣膠菌種鑑定工作 上。在生物氣膠的採樣工作中，使用毛細管膜濾紙的過濾式採樣器，其後續 可運用SEM進行定量或鑑定 (Eduard and Heederik, 1998; Martinez et al., 2004)。

(4) Flow cytometry

流式細胞儀為一種可自動計算細胞顆粒數的技術，其使用液體水柱使細 胞或顆粒可均勻散布水中，一顆接一顆通過雷射光源，當細胞被雷射激發後 會產生散射光，或是照射到帶有螢光物質的顆粒 (自然或染色) 時會產生螢 光，這些散射光或螢光被偵測器所接收後，藉由光照射前後波長及強度變化，

經一連串電子訊號轉換及電腦分析，便可得到自動化分析結果。流式細胞儀 在生物氣膠濃度量測方面，可應用於 impinger 或過濾式採樣器的後續定量 工作上，雖然定量上極為方便，但分析過程中有可能因為螢光染色關係，將 環境中無生命的有機顆粒也納入計數，如動植物掉落的碎屑組織等，造成其 計數結果為使用螢光顯微技術的 1.5-2 倍 (Eduard and Heederik, 1998)。