Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4321

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(1)臺北醫學大學生藥學研究所 Graduate Institute of Pharmacognosy Taipei Medical University. 碩士論文. 指導教授 徐鳳麟博士 Adviser Feng-Lin Hsu, Ph.D.. 台灣栽培白英活性成分之研究 Studies of the bioactive constitutents of solanum lyratum Thunb. cultivated in Taiwan.. 研究生 古惇文 Graduate student Tun-Wen Ku 中華民國九十六年七月 July, 2007.

(2) 致謝首先誠摯的感謝恩師徐鳳麟博士的指導，老師悉心的教導使我得以一窺天然物化學的深奧，不時的討論並指點我正確的方向，使我在這些年中獲益匪淺。老師對學問的嚴謹更是我輩學習的典範。本論文的完成另外亦得感謝北醫共儀中心的王淑慧老師及台大共儀中心黃守齡小姐大力協助、生藥所李美賢博士、李慶國博士、李宗徽博士、王靜瓊博士、陳彥洲博士、侯文琪博士、梁文俐博士對我研究上的指教評點。生藥所佩琪學姊及大師兄在硬體及軟體上的支援，因為有你們的體諒及幫忙，使得本論文能夠更完整而嚴謹。三年裡的日子，實驗室裡共同的生活點滴，學術上的討論、言不及義的閒扯、讓人又愛又怕的宵夜、趕作業的革命情感、因為睡太晚而遮遮掩掩閃進實驗室........，感謝眾位學長姐、同學、學弟妹的共同砥礪，你/妳們的陪伴讓這些年的研究生活變得絢麗多彩。感謝柏宏、怡沛、政緯、光全學長、雅琪、靜慧學姐們不厭其煩的指出我研究中的缺失，且總能在我迷惘時為我解惑，也感謝同學的幫忙，恭喜我們順利走過這些日子。實驗室的秀蓉、麗雯、碧玉、筱婷、毛毛、玉英、宴玲、翊弘、信哥及一直在實驗桌旁陪伴我的鄰居 tamama 二等兵當然也不能忘記，妳/你們的幫忙及搞笑我銘感在心。最後，謹以此論文獻給一直在背後默默支持我的雙親。.

(3) 中文摘要台灣栽培茄科(Solanaceae)植物白英 solanum lyratum Thunb.之甲醇萃取物，經由各種層析管柱及不同溶媒系統層析後，共分離出十八個化合物，其結構根據物理數據、核磁共振光譜分析後，共分為五大類：五個黃酮類化合物 1 (3,3',4',7-tetramethoxymyricetin)、2 (3,3',7- trimet hoxyquercertin)、3 (3,4'-dimethoxyfkampferol)、4 (3,3',7-trimethoxymyri cetin)、5 (3-methoxykampferol)；四個酚類化合物 6 (Scopoletin)以及 7 (Methylcaffeate)、8 (Vanillin)、9 (p-Hydroxybezaldehyde)，一個 amide 類化合物 10 (N-(trans-Feruloyl)tyramine)，兩個 indole 類化合物 11 (indole-3-carboxaldehyde), 12 (indole-3-carboxylic acid) 以及五個固醇類化合物：13, 14 (β-Sitosterol 3-O-β-D-g l uc o py r a no s i dea n dβ-Stigma sterol 3-O-β-D-glucopyranoside), 15 (Soladulcine B), 16 (Tigogenin 3O-lycotetraoside), 17 (Tigogenin 3-O-lucotrioside)，18(Proto-desgalacto tigonin)，以上述化合物針對 MCF-7 及 HepG2 試驗其細胞毒性效力，初步發現化合物 15、16 於 10μg/ ml濃度下對 MCF-7 具有明顯毒殺活性，化合物 15、17 具對於 HepG2 於低濃度 10μg / ml有相當程度之毒殺活性。本研究首次發現化合物 15 (Soladulcine B) 對於 MCF-7 及 Hep G2 具有明顯毒殺活性。. i.

(4) 關鍵字：白英、細胞毒性、乳癌、肝癌. Abstract The whole plants of Solanum lyratum Thunb. were extracted with methanol. By means of various column chromatographies, eightteen compounds were isolated and purified. The structure of these compounds were elucidated including five flavonoids: 1 (3,3',4',7-tetramethoxymyri cetin), 2 (3,3',7- trimethoxyquercertin), 3(3,4'-dimethoxyfkampferol), 4 (3,3',7-trimethoxymyricetin), 5 (3-methoxykampferol); four phenolics: 6 (Scopoletin), 7 (Methylcaffeate), 8 (Vanillin) and 9 (p-Hydroxybezalde hyde); one amide: 10 (N-(trans-Feruloyl)tyramine);two indoles: 11 (indole-3-carboxaldehyde), 12 (indole-3-carboxylic acid); five steroidal glycosides 13 and 14 (β-Sitosterol 3-O-β-D-gl uc o py r a no s i dea ndβ-Stig masterol 3-O-β-D- glucopyranoside), 15 (Soladulcine B), 16 (Tigogenin 3-O-lycotetraoside), 17 (Tigogenin 3-O-lucotrioside) and 18 (Protodesgalactotigonin). In addition, the cytotoxic activity of the isolated constituents against MCF-7 and HepG2 was evaluated. Results show that compound 15 and 16 have cytotoxicity in the concentration 10 μg/ ml against MCF-7, compound 15 and 17 have potent cytotoxicity in 10 μg / mlagainst HepG2. Compound 15 were first evaluated the potent. ii.

(5) cytotoxicity to the literatures.. Key words: Solanum lyratum.THUNB, , MCF-7, HepG2, cytotoxicity.. iii.

(6) 總目錄中文摘要…………………………………………………………….. i. 英文摘要…………………………………………………………….. ii. 總目錄……………………………………………………………….. iv. 表目錄……………………………………………………………….. vi. 圖目錄……………………………………………………………….. vii. 縮寫表……………………………………………………………….. x. 第一章緒論……………………..……………………………….... 1. 一、研究背景…………………………………...……………….. 1. 二、白英之文獻回顧....……………………………….………... 2. 三、白英成份研究之回顧………………………………………. 7. 第二章實驗方法與材料……………………..………………….... 13. 一、抽提及分離………………………………...……………….. 13. 二、細胞毒殺試驗 (MTT cytotoxicity assay).....……..………... 15. 三、實驗材料……………………………………………………. 17. 第三章結果與討論………………………………..……………. . .. 21. 一、結構解析………. . ……………………………………...…. . .. 21. 化合物 1 (3,4',5',7-tetramethoxymyricetin) 之結構解析........ 22. 化合物 2 (3,3’ ,7-trimethoxyquercertin) 之結構解析.............. 28. 化合物 3 (3,4'-dimethoxykampferol) 之結構解析................. 34. 化合物 4 (3, 3',7- trimethoxymyricetin) 之結構解析……..... 40. 化合物 5 (3-methoxykampferol) 之結構解析….................... 45. 化合物 6 (Scopoletin) 之結構解析…........………………..... 50. 化合物 7 (Methyl caffeate) 之結構解析.................................. 53. 化合物 8 (Vanillin) 之結構解析.............................................. 55. iv.

(7) 化合物 9 (p-Hydroxybezaldehyde) 之結構解析...................... 58. 化合物 10 (N-(trans-Feruloyl)tyramine) 之結構解析............. 60. 化合物 11 (indole-3-carboxaldehyde) 結構解析…................. 65. 化合物 12 (indole-3-carboxylic acid) 之結構解析…….......... 71. 化合物 13, 14 (β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside and β-Stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside) 之結構解析........... 75. 化合物 15 (Soladulcine B) 之結構解析………....................... 81. 化合物 16 (Tigogenin 3-O-lycotetraoside) 之結構解析.......... 91. 化合物 17 (Tigogenin 3-O-lucotrioside) 之結構解析…...….. 102. 化合物 18 (Proto-desgalactotigonin)………............................. 112. 化合物 1-18 整理回顧.............................................................. 122. 二、化合物細胞毒殺效力評估……………........................……. 126. 二、細胞毒殺試驗之結果………………………………………. 127. 三、討論……………………………...………………………….. 130. 四、各成分物理數據………........…...………………………….. 133. 參考文獻………………………………….......................................... v. 143.

(8) 表目錄表 1、白英(solanum lyratum Thunb.)成份研究回顧。.….....……….. 7. 表 2、1H- and 13C-NMR data of 1。. . …. . . ……………. . . …………. . …. 24. 表 3、1H- and 13C-NMR data of 2。…. ………………. . . …………. . …. 30. 表 4、1H- and 13C-NMR data of 3。. . ………. . . ………. . . ………. . …. 36. 表 5、1H- and 13C-NMR data of 4。. . …………………. . ………. . …. 42. 表 6、1H- and 13C-NMR data of 5。. . ……………. . . …. . . ………. . …. 47. 表 7、1H- and 13C-NMR data of 6。. . ……. . . ……………. . . ……. . …. 51. 表 8、1H- and 13C-NMR data of 7。. . ……. . . ……………. . . ……. . …. 54. 表 9、1H- and 13C-NMR data of 8。…. …………………. . . ……. . …. 56. 表 10、1H- and 13C-NMR data of 9。. . ……. . . ………............. . . ……. . …. 58. 表 11、1H- and 13C-NMR data of 10。………. ……………. . . ……. . …. 62. 表 12、1H- and 13C-NMR data of 11。………. ……………. . . ……. . …. 67. 表 13、1H- and 13C-NMR data of 12。………. ……………. . . ……. . …. 72. 表 14、13C-NMR data of 13, 14。………. ……………. . . ….....…. . …. 77. 表 15、1H-NMR data of 13, 14。………. ……………. . . …......…. . …. 78. 表 16、13C NMR data of compound 15 and reference。.......…. . ..…. 84. 表 17、1H- and 13C-NMR data of 15。………..…………. . . ……. . …. 85. 表 18、13C NMR data of compound 16 and reference。......…......…. 94. 表 19、1H- and 13C-NMR data of 16。………..…………. . . ……. . …. 95. 表 20、1H- and 13C-NMR data of 17。………..…………. . . ……. . …. 105. 表 21、1H- and 13C-NMR data of 18。………..…………. . . ……. . …. 115. 表 22、濃度 5 0μg/ ml 、10μg / ml下化合物對於 MCF-7 及 HepG2 之細胞毒性。........................................................................... vi. 127.

(9) 圖目錄圖 1、茄科白英 solanum lyratum T.外部型態。..….....................…. 3. 圖 2、白英之分配萃取流程圖。..………....…………...................... 14. 圖 3、乙酸乙酯層之分離流程圖。..……........………….................. 14. 圖 4、化合物 1 之氫譜。. ………. …………. . . …………………….. 25. 圖 5、化合物 1 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 26. 圖 6、化合物 1 之 HMBC。. . …...…………...................................... 27. 圖 7、化合物 2 之氫譜。. ………. …………. . . …………………….. 31. 圖 8、化合物 2 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 32. 圖 9、化合物 2 之 HMBC。. . …...…………...................................... 33. 圖 10、化合物 3 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 37 圖 11、化合物 3 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........................ 38. 圖 12、化合物 3 之 HMBC。. . …...…………...................................... 39. 圖 13、化合物 4 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 43 圖 14、化合物 4 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 44. 圖 15、化合物 5 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 48 圖 16、化合物 5 之碳譜。..…………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 49. 圖 17、化合物 6 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 52 圖 18、化合物 7 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 54 圖 19、化合物 8 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 57 圖 20、化合物 9 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 59 圖 21、化合物 10 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 63 圖 22、化合物 10 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 64. 圖 23、化合物 11 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 68 圖 24、化合物 11 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................... vii. 69.

(10) 圖 25、化合物 11 之 HMBC。. . …...…………...................................... 70. 圖 26、化合物 12 之氫譜。. ………. …………. . . ……………………. 73 圖 27、化合物 12 之碳譜。. . …………. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................... 74. 圖 28、化合物 13, 14 之氫譜。. ………. …………. . .............………. 79 圖 29、化合物 13, 14 之碳譜。. ………. …………. . .............………. 80 圖 30、化合物 15 之氫譜。. ………………..........................………. 86 圖 31、化合物 15 之碳譜。. . ………….............................................. 87. 圖 32、化合物 15 之 HSQC。. . …………............................................ 88. 圖 33、化合物 15 之 HMBC。. . …………............................................ 89. 圖 34、化合物 15 之 COSY。. . …………............................................ 90. 圖 35、化合物 16 之氫譜。. ………………..........................………. 96 圖 36、化合物 16 之碳譜。. . ………….............................................. 97. 圖 37、化合物 16 之 DEPT。. . …………............................................ 98. 圖 38、化合物 16 之 HSQC。. . …………............................................ 99. 圖 39、化合物 16 之 HMBC。. . …………............................................ 100. 圖 40、化合物 16 之 COSY。. . …………............................................ 101. 圖 41、化合物 17 之氫譜。. ………………..........................………. 106 圖 42、化合物 17 之碳譜。. . ………….............................................. 107. 圖 43、化合物 17 之 DEPT。. . …………............................................ 108. 圖 44、化合物 17 之 HSQC。. . …………............................................ 109. 圖 45、化合物 17 之 HMBC。. . …………............................................ 110. 圖 46、化合物 17 之 COSY。. . …………............................................ 111. 圖 47、化合物 18 之氫譜。. ………………..........................………. 116 圖 48、化合物 18 之碳譜。. . ………….............................................. 117. 圖 49、化合物 18 之 DEPT。. . …………............................................ 118. 圖 50、化合物 18 之 HSQC。. . …………............................................ 119. viii.

(11) 圖 51、化合物 18 之 HMBC。. . …………............................................ 120. 圖 52、化合物 18 之 COSY。. . …………............................................ 121. 圖 53、濃度 5 0μg/mL 下化合物對於 MCF-7 之細胞毒性。.......... 128. 圖 54、濃度 10μg/mL 下化合物對於 MCF-7 之細胞毒性。…....... 128. 圖 55、濃度 5 0μg/mL 下化合物對於 HepG2 之細胞毒性。........... 129. 圖 56、濃度 10μg/mL 下化合物對於 HepG2 之細胞毒性。........... 129. ix.

(12) 縮寫表 COSY. Correlation Spectroscopy. 13. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum. C-NMR. DEPT. Distortionless Enhancement via Polarization Transfer. HMBC. 1. H-Detected Heteronuclear Mutiple-Bond Coherence. HSQC. 1. H-Detected Heteronuclear Single-Quantum. Coherence 1. H-NMR. Proton nuclear magnetic resonance spectrum. x.

(13) 第一章緒論一、研究背景癌症為全球主要死亡原因。據世界衛生組織統計，2005 年癌症死亡人數七百六十萬人，佔全球總死亡人數 13%，預估 2015 年將有九百萬人死於癌症 1。行政院衛生署癌症相關登記資料亦顯示，自民國七十一年起，癌症即躍居國民十大死因之首 2，迄今逾二十年。此期間民眾癌症發生率及死亡率均呈現上升趨勢，年齡標準化死亡成長率更高達 129% 3，可見癌症問題於國人健康影響的嚴重性。故癌症藥物的篩選開發實為藥物研究的當務之急。傳統臨床上最常使用於抗癌之方法有：化學藥物療法、放射性療法、外科手術切除，治療同時均對病患健康造成很大的傷害。近年國內醫藥研究發展日趨進步，受到歐美各國倡導「替代醫學（alternative medicine）」影響4，國內學者開始致力於植物藥的研發，植物中所含的二次代謝物有效成分諸如太平洋紫杉中的taxol5、喜樹. 中的camptothecin6、長春花中的vincristine 及vinblastine7 均是由天然物中分離純化而得到抗癌成分的最佳例證。我國應用中草藥治病已有數千年歷史，為使用中草藥的發源地，無論在使用經驗或栽培環境上均優於歐美各國，因此自 1995 年行政院「加強生物技術產業推動方案」明列「科學化中草藥」於其中 8，. 1.

(14) 至 2000 年經濟部技術處提出「中草藥產業技術發展五年計畫」協同多部會五年投入五十億新臺幣資金。足見政府對推動新興中草藥產業的重視。本論文以開發中草藥有效成分為目標，以傳統抗癌中草藥茄科植物白英 Solanum lyratum Thunb.為研究材料，以各種層析方法反覆分離精製出活性成分，並佐以初步的活性測試。. 二、白英之文獻回顧白英，為茄科植物 solanum lyratum Thunb.，俗名穀菜、白草 9、鬼目，鬼目草，排風子 10、酸尖菜 11。性味甘、寒 9，功能清熱利濕、解毒消腫、抗癌、主治溼熱黃疸、膽囊炎、膽石症、腎炎水腫、風濕關節痛、婦女溼熱帶下、小兒高熱驚搐、濕疹搔癢，帶狀疱疹、及多種癌症 12。多以全草入藥 13。另一異名白毛籐，所屬植物據近代本草學家考據並非白英 14，唯延用者仍眾 15 16。『神農本草經』內始錄白英為上品：「味甘寒，主寒熱，八疽，消渴，補中益氣，久服輕身延年。一名谷菜 9。」『本草經集注』：「無毒，一名白草，生益州。白英無毒。春採葉，夏採莖，秋採花，冬採根 17。」，『本草綱目』：「白英，俗名排風子是也，正月生苗，白色，可食，秋開小白花，子如龍葵子，熟食紫赤色，吳誌云：孫浩時有鬼目菜，緣棗樹，長丈逾，葉廣四吋，厚三分，人皆異之。即此物也 18。」，『本草綱目拾遺』：「莖、葉皆有白毛，八九月開花藕合色，結子生青. 2.

(15) 熟紅，鳥雀喜食之 19。」其植物型態為多年生蔓性亞藤木，老莖木質化，上部莖葉被有軟毛。葉互生，提琴形，卵形至卵狀長橢圓形，先端銳，基部心形，常作戟狀三裂或羽狀多裂，長 4-9 公分，寬 2-5 公分。夏秋開花，二歧聚繖花序，頂生或腋外生。萼 5 裂，杯狀，裂片基部有色斑點，花冠藍紫色或白色，雄蕊五枚，雌蕊一枚，子房卵形，花柱細長，柱頭半球形。漿果球形，幼時綠，熟時紅黑，徑 0.8 公分 12 20. 。分布於大陸東南沿海、東南亞諸國、日本、韓國及台灣低海拔. 地區 21，台灣亦有實驗室內組織培養之研究 22。. Fig 1 白英之植物構造圖 12，右下為花朵構造。. 白英為神農本草經之上品藥，治療多種疾病功效顯著，近代學者. 3.

(16) 亦積極研究白英之藥理作用，今整理摘要如下。 1.臨床治療研究 1.1 白英全株煎汁去渣，每日 60 ~ 120g，用於治療傳染性肝炎 23，三十六例中除一例因併發病轉院治療，其餘三十五例全部痊癒，治療過程中並無不良反應及副作用。 1.2 以乾燥白英、全當歸以 10 : 3 配置治療婦女白帶 24，煎煮取汁製為糖漿，每日早晚給藥一次，每次 25ml，四十例中三十七例痊癒，三例顯效。 2、藥理活性研究 2.1 抗癌作用 2.1.1 自 1989 年學者發現白英之乾燥葉部熱水萃取物有抗癌作用 25. 起，各方均積極投入白英抗癌的研究中，成果豐碩。. 2.1.2 白英乙酸乙酯萃取物對人肝癌 BEL-7404 有誘導細胞凋亡作用，光學顯微鏡觀察及凝膠電泳均有細胞凋亡的特徵 26。 2.1.3 白英的熱水粗抽物、50%乙醇粗抽物及正丁層粗抽物均有抑制人類大腸腺癌細胞 Colo 205 生長作用，50%乙醇粗抽物及 n-butanol 層粗抽物早期具有細胞毒殺作用，晚期可誘導細胞產生凋亡作用。50%乙醇粗抽物抗癌作用可能為抑制 topoisomerase Ⅱ α及誘導細胞凋亡產生 13。. 4.

(17) 2.1.4 白英以乙醇萃取，分別經乙酸乙酯、正丁醇、水分層萃取，乙醇粗萃物、乙酸乙酯層、正丁醇層對人類黑色素瘤細胞 A375 及人類子宮頸癌 Hela 細胞有不同的細胞毒殺作用，其中乙酸乙酯層效果最佳、正丁醇層次之 27。 2.1.5 白英之熱水粗萃物對人類白血病 HL-60 細胞非但有早期毒殺作用、亦有長期抑制增值的效果，觀察得知有阻礙細胞 DNA 複製之現象 28。 2.2 抗過敏作用 2.2.1 白英水粗萃物具有顯著抗過敏作用。白英水粗萃物可抑制由 compound 48/80 誘導的過敏性休克，使血漿中的組織胺濃度減低且有濃度相依性現象，口服白英水抽物可抑制表皮過敏免疫反應；機轉可能和同時觀察到的 cAMP 表現量增加有關 29。 2.3 協同促 NO 合成作用 2.3.1 白英熱水粗萃物與 interferon –γ共同投予小鼠可促進小鼠 NO 合成，但單獨投予白英熱水粗萃物卻無效，可視為白英可協同誘導 NO 合成，其機轉可能與誘導 TNF-α生成有關 30。 3、分離成分之藥理活性研究 3.1 白英的特徵成分固醇皂素類 sl-b、固醇生物鹼類 SL-c, d 對人子宮頸癌 JTC 26 細胞有明顯抑制作用 31，solamagine 對於 Hep 3B 具. 5.

(18) 有細胞毒殺及誘導細胞凋亡的作用，其機轉可能與 TNF receptor 有關表現有關 32，不同的糖基其影響 TNFR 的表現量都不同，推測 2' rhamnose 是決定細胞凋亡作用的要素 33。白英地上部分離出的成分中，Rutin 經實驗證明有體外抗氧化活性 34， scopoletin 對大鼠肝細胞初代培養有抑制四氯化碳誘導的肝損傷效果 35。白英全草部分分離出的兩個多醣，SL-1 跟 SL-2 可提高小鼠胸腺淋巴細胞初代培養的免疫活性，尤以 SL-2 效果最佳 15。綜合以上，白英臨床用於治療傳染性肝炎、婦女白帶，均具有優異療效。藥理作用方面，白英之乙醇及水的粗萃液對不同癌細胞有抗腫瘤活性，機制不只為細胞毒性。水粗萃液亦具有抗過敏作用、協同誘導 NO 合成等作用。被證實之成分活性有抗氧化、抗肝損傷、誘導細胞凋亡、細胞毒性、調節淋巴細胞增殖等作用。足見以白英為目標開發藥物之潛力。近代對白英化學成分的研究中，主要著重於白英內固醇生物鹼類（Steridal alkaloids）以及固醇類（Steroids）配糖體，另有少數萜類（Terpenoids）多醣類（Polysaccharides）及黃酮類（Flavonoids）被發現，目前已知白英內成分約有 31 種，茲詳列表如下頁。. 6.

(19) Table 1 白英(solanum lyratum Thunb.)成份研究回顧 Class. Compound ( 25ξ ) -solanidan-3β, 23β-diol-3-O-β-D- glucopyranosyl SL-c ( 1→2) -β-D-g l uc opy r a nos y l(1→4) -β-D-galactopyranoside (2 components) ( 25ξ )-⊿5- solaniden-3β, 23β-diol-3-O-β-D- glucopyranosyl. No.Ref. (1)3. ( 1→2) -β-D-g l uc opy r a nos y l(1→4) -β-D-galactopyranoside ( 25ξ ) -solanidan-3β, 23β-diol-3-O-β-D- glucopyranosyl ( 1→2) -[ β-D-xy l opy r a nos y l( 1→3) ] -β-D-glucopyranosyl Steridal SL-d (1→4) -β-D-galactopyranoside alkaloids (2 components) ( 25ξ )-⊿5- solaniden-3β, 23β-diol-3-O-β-D- glucopyranosyl. (2)36. ( 1→2) -[ β-D-xy l opy r a nos y l( 1→3) ] -β-D-glucopyranosyl (1→4) -β-D-galactopyranoside solalyratine A solalyratine B. spirosolane-3-O-β-D-xylopyranosyl ( 1→3) -β-D-galactoopyranoside spirosolane-3-O-β-D-xylopyranosyl ( 1→2) -β-D-glucopyranosyl-( 1→4) β-D-galactoopyranoside. (3)37 (4)37. ( 5α, 25β) -furostan-3,22,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl (1→2 )-β-Dglucopyranosyl ( 1→4 )-β-D-galactopyranoside-26-O-β-D-glucopyranoside. Steroids. SL-a (4 components). ( 5α, 25α) -furostan-3,22,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl ( 1→2) -β-Dglucopyranosyl (1→4) -β-D-galactopyranoside-26-O-β-D-glucopyranoside ( 25β) -furost-5-en-3,22,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl ( 1→2) -β-Dglucopyranosyl (1→4) -β-D-galactopyranoside-26-O-β-D-glucopyranoside. (5)38. ( 25α) -furost-5-en-3,22,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl ( 1→2) -β-Dglucopyranosyl (1→4) -β-D-galactopyranoside-26-O-β-D-glucopyranoside tigogenin-3-O-β-D-g l uc opy r a nos y l( 1→2) -β-D-glucopyranosyl (1→4) -β-D-galacto-pyranoside neotigogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl SL-b ( 1→2) -β-D-g l uc opy r a nos y l(1→4) -β-D-galacto-pyranoside (4 components) diosgenin-3-O-β-D-g l uc opy r a nos y l( 1→2) -β-D-glucopyranosyl (1→4) -β-D-galacto-pyranoside. (6)38. yamogenin-3-O-β-D-g l uc opy r a nos y l( 1→2) -β-D-glucopyranosyl (1→4) -β-D-galacto-pyranoside (7)39. Aspidistrin 7.

(20) (8)39. methyl proto-aspidistrin. 26-O-β-D- glucopyranosyl( 22ξ , 25R) -3β, 22, 26-trihydroxy-furost-5-ene-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2 )-[ β-D (9)39 -glucopyranosyl( 1→3 )]-β-D-glucuronopyranoside (10)40. tigogenin-3-O-β-D-glucopyranoside 3-O-a-L-rhamnopyranosyl ( 1→2) -β-D-glucuronopyranosyl-3β-hydroxy-(25R)-spirost-5-ene. mixture (2 components) 3-O-a-L-rhamnopyranosyl ( 1→2) -β-D-glucuronopyranosyl-3β-hydroxy-(25S)-spirost-5-ene. (11)40. 26-O-βD-glucopyranosyl-( 22ξ , 25R) -3β, 26-dihydroxy-furost-5-ene-3-O-αL-rhamnopyranosyl-(1→2 )-β-D-glucuronopyranoside. mixture (12)40 (2 components) 26-O-βD-glucopyranosyl-( 22ξ , 25S) -3β, 26-dihydroxy-furost-5-ene-3-O-αL-rhamnopyranosyl-( 1→2) -β-D-glucuronopyranoside ( 22R) 3β, 16β, 22, 26-tetrahydroxycholest-5-ene-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2 )-β(13)41 D-glucuronopyranoside D3,5-deoxytigogenin. (14)42. diosgenin. (15)42. ergosterol peroxide. (16)43. 9,11-dehydroergosterol peroxide. (17)43. Stigmasterol. (18)34. β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside. (19)34. diosgenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucuronopyranoside. (20)34 (21)44. Flavonoids Rutin Terpenoids. atractylenolide I. (22)43. Dehydrocarissone. (23)43. Poly polysaccharide SL-1(structure not defined) saccharide polysaccharide SL-2(structure not defined). Others. (24)15 (25)15. caffeic acid. (26)44. vanillic acid. (27)44. N(p-hydropheneethyl) p-coumaramide. (28)44. 2-hydroxy-3-methoxybenzoic acid glucose ester. (29)42. Scopoletin. (30)35. hexacosanoic acid Me ester. (31)34. 8.

(21) OH OH. N N OH OH. O O. HO. O O. O. HO O. HO. O. +. OH. O. O. O OH. HO. +. OH. O. OH. OH. HO. OH. HO. HO. OH. HO. O. HO O. O. HO HO. N. HO HO N. HO HO. OH OH. O O. O HO HO. O OH. HO. HO. OH. HO HO. OH. HO. OH. O. OH. O. O. O. HO O. O HO. O. HO. O. O. HO O. HO HO HO HO. (1). (2) H. H. N. N. O. O. O. HO HO. O. O. O. HO O. O. HO OH. OH O. O. O. HO. HO HO. OH HO. O. OH. HO. HO OH. (3). (4) O. O H O. O. O OH O OH. OH. O. O HO HO. O. O. HO O O. HO. +. OH. O HO. HO HO. O. O. HO O O. OH. +. OH. O O H. HO. OH. OH. O. HO. OH. HO O. O. HO HO. O. HO HO. OH O OH. OH O HO HO. O. HO HO O. O. OH. O. O. OH. HO HO. OH. O. O OH. O. O HO. HO O O. OH HO. HO. OH. HO. HO HO. HO HO. (5). (6). 9.

(22) O. O HO O. O. O OH. OH. HO. O. OH. O O. HO. HO O. O HO. O OH. HO. O. O. OH OH. O. O HO. OH. HO. O. HO O. OH. HO. HO HO. O. O. HO O. O HO. OH. O HO. OH. HO. HO HO. (7). (8) O HO OH. O OH. O. OH. HO. O. O. HOOC HO. O. O. O. O HO. O O. OH. O O. HO. HO. OH. OH. HO. HO HO OH. OH. (9). (10) O HO O. H3CO. O OH. O O O. HOOC. O. HOOC HO. O. HO. O. HO. O. HO. O. O O OH HO. OH HO. OH. OH. (12). (11). 10. HO. OH.

(23) OH OH. OH. O O. O. HOOC. O. HO. O. HO. O. O. O. HO. OH HO OH. (13). O. (14). (15). H. O. O. H. O. HO HO. HO. (16). (17). (18). O. O. HO O O HO. HO. O. HOOC. OH HO. O. HO. O. O. OH HO OH. (19). (20) OH. HO. O. O OH. O. O OH. O. O. O. O. H. (22). OH. (23). O O. O OH. HO. HO OH. OH. HO OH OH. HO. (21). O. HO. 11. (26). H3CO. (27).

(24) O. OH O O HO. N H. OH O OCH3. H. (28). OH HO. OH. (29) H3CO. O. O O. HO. (30). O. (31). 12.

(25) 第二章實驗方法與材料一、抽提及分離目標植物白英 solanum lyratum Thunb.溫室栽培暨鑑定自台中中國醫藥大學郭昭麟教授，五月栽種，十一月採收全草 40.5 公斤，於室溫下以甲醇溶液萃取三次，萃取液過濾後於 40℃下以減壓濃縮之方法除去有機溶媒，將剩餘之水分以冷凍乾燥之方法除去後，得到粗萃物 622 g。粗萃物接著以正己烷、乙酸乙酯依序與水作分配萃取，依序劃分為正已烷層、乙酸乙酯層和水層(圖 1) ，以乙酸乙酯層作為研究目標。乙酸乙酯層以 Sephadex LH-20 / EtOH 進行管柱層析，以 10 % H2SO4 為呈色劑，劃分為 fraction 1 - 5 五個部分。Fr. 1 - 5 分別由各種層析管柱，以不同比例之溶媒系統反覆分離純化後，得到 SL-1 ~ SL-18 共十八個化合物。以上各層萃出物之分離、純化流程，分別如下頁圖 2 所示。. 13.

(26) Solanum lyratum thumb. Whole fresh plants 40.5 kg Extraxted wtih MeOH 120 L 3 times MeOH extract 622 g Patition with hexane. Hex layer (217.3 g). water layer. Patition with Ethyl acetate. Water layer (356.1 g). EA layer (48.6 g). 圖 2 白英之萃取分配流程圖 EA Layer ( 48.6 g ) Sephadex LH-20 EtOH. Fr.1 (1.211g). Fr.2 (24.304g). Fr.3 (12.121g). Fr.4 (3.793g). MCI CHP-20P H2O-MeOH. MCI CHP-20P H2O-MeOH. Silica Gel CHCl3 : MeOH : H2O. Sephadex LH-20 H2O-MeOH. C18-OPN H2O-MeOH. Silica Gel CHCl3 : MeOH Benzene : Acetone Hexane : EA. HPLC-C18 H2 O-MeCN SL-13,14 (384 mg) SL-15 (22 mg) SL-16 (2 mg) SL-17 (12 mg) SL-18 (2 mg). Recrystallization SL-1 SL-6 (481 mg ) (20 mg) SL-2 SL-7 (11 mg) (328 mg) SL-3 SL-8 (29 mg ) (5 mg) SL-4 SL-9 (48 mg ) (15 mg) SL-5 SL-10 (21 mg ) (64 mg). SL-11 (5 mg) SL-12 (55 mg) SL-13 (16 mg). 圖 3 白英乙酸乙酯層之管柱分離流程圖. 14. Fr.5 (1.623g).

(27) 二、細胞毒殺試驗 (MTT cytotoxicity assay) 本實驗利用 colorimetric MTT cytotoxicity assay 來評估由白英中所分離純化之化合物之是否具抗癌藥物潛力。MTT 是一種四唑鹽類 (tetrazolium salt)，全名是[3-(4,5dimethylthialzol-2-yl)-2,5-diphenyltetra zolium]bromide。於 1983 年首次被使用於檢測細胞存活及增生作用， 45. 為一簡易且不需放射線的檢測方法，目前已廣泛作為各種細胞存活. 程度的基本試驗。其檢測原理為 MTT 溶於水後呈現淡黃色，會被活細胞胞飲 (pinocytosis)而進入細胞內；活細胞內的粒腺體(mitochondria)含有各種脫氫酵素(dehydrogenase)，一般認知粒線體特有的琥珀酸脫氫酵素 (succinatedehydrogenase)會以 MTT 為受質，將 MTT 結構中四唑環 (tetrazolium ring)切斷而形成不可溶的 MTT formazan 結晶，並由細胞內胞吐(exocytosis)排出到細胞表面，此時肉眼觀察原本為淡黃色的 medium 轉為暗紫色 (即生成之 formazan 顏色)，顯微鏡下亦可觀察到 formazan 針狀結晶，同時其吸光值亦會改變；反之若細胞已死，其脫氫酵素已失去功能，故 MTT 仍維持淡黃色。因此此方法可用來測試化學樣品加入細胞後細胞的存活率。本實驗是利用酵素連結免疫吸附分析儀 (ELISA reader) 於螢光波長 600 nm 下，測其吸光強度 (Optical density: O.D)，並計算藥物之細胞毒性強度。. 15.

(28) 實驗方法 1. 癌細胞培養 (cancer cell line culture) 將 MCF-7 cells (human breast cancer cells, 人乳腺癌細胞)及 Hep G2 cells (human hepatoblastoma), 人類肝癌細胞，培養在含有 10 % FBS (fetal bovine serum) 及含 100 units/ml penicillin 和 10 0μg / ml streptomycin 之 RPMI-1640 培養基中，放置 95 % O2、5 % CO2 (37˚ C) 之恆溫箱中培養。 2. 檢品濃度配製：將 sample 以 100 % DMSO 溶解成 10 與 50 mg/ml，其最終實驗濃度為 10 與 50 μg /ml。 3. 實驗步驟: 取 1×105 cells/well 的細胞，將其植入 24 well plate 中 (此時含細胞的溶液為 500 μL/well)，經過 24 小時後，加入檢品培養 24 小時，於每個 well 加入 MTT 20 μl (1 mg/mL)，於二氧化碳細胞培養箱 (37 °C) 中培養 4 小時，除去所有液體，再加 0.4 ml DMSO 到每個 well 溶解 formazan 結晶，並振盪 10 分鐘。然後以酵素連結免疫吸附分析儀於螢光波長 600 nm 下，測定其吸光值並計算出檢測藥物之細胞毒性。. 16.

(29) 抑制百分比(%)＝. 對照組 (600 nm 吸光值)-實驗組 (600 nm 吸光值) ────────────────────── × 100% 對照組 (600 nm 吸光值). 三、實驗材料一、儀器：化學成分之物性測定儀器：核磁共振儀 (NMR) Bruker AM-500 FT-NMR Spectrometer (500 MHz) 質譜分析儀 (MS) Applied Biosystems MDS Sciex API 2000 MS System (CA, USA) 旋光度測定儀 (Optical Rotation) Jasco P-1020 digital polarimeter (Tokyo, Japan) 紫外光譜儀 (UV-VIS) Hitachi U-2800 spectrophotomater (Tokyo, Japen) 高效能液相層析系統：紫外光偵檢器 Hitachi UV detector L-7400 (Tokyo, Japen) 折射率偵檢器 Biscoff RI detector (Leonberg, Germany) 幫浦： Hitachi pump L-7100 (Tokyo, Japen) Hitachi pump L-2130 (Tokyo, Japen) 層析管柱： Biosil 5 ODS-W 10mm I.D x 250mm (Biotic Chemical) 17.

(30) 其他儀器：減壓濃縮機 Rotary evaporator n-1000 & Water bath sb-1000 (Eyela) 冷卻循環機 Refrigerated circulation BL-20 (YIHDER) 冷凍乾燥機 FD-1, FD-5 (Eyela) 純水製造器 Milli-Q (Millipore) 超音波震盪器 Ultrasonic Cleaner D2000 (Delta) 紫外光－可見光分光光度計 UV-1601 (Shimadzu) 二、層析法：管柱層析： MCI-gel CHP20P ( 75-150 μm, Mitsubishi Chemicial Industrie ) Sephadex LH-20 ( 20-100 μm, Pharmacia Fine Chemicals ) Cosmosil C18-OPN ( 75 μm, Nacalai Tesque, INC. ) Silica gel 60 ( 70-230 mesh, E. Merck ) 薄層層析板： Kiesel gel 60 F254 ( 0.2 mm, E. Merck ) 薄層層析之展開溶媒： Benzene : Acetone ( 85:25, 85:15, 65:35, v/v ) Chloroform : Methanol ( 8:1, 5:1, v/v ) Chloroform : Methanol : H2O ( 7:3:0.5, 8:2:0.2, 9:1:0.1, v/v/v ) TLC 檢測法： 18.

(31) UV lamp 254 nm H2SO4 Spray reagent ( 10% v/v in EtOH，噴霧後加熱。) FeCl3 spray reagent : (5% FeCl3 in H2O) Dragendorff spray reagent : (A 液: 0.17 g bismuuth subnitrate + 2 ml acetic acid in 8 ml water B 液: 4 g potassium iodide in 10 ml water 1:1 v/v 混合: 1 ml A + 1 ml B +2 ml Acetic acid + 7 ml water 可保持一個月。) 三、一般化學溶媒及試藥： Acetonenitrile, Acetic Acid, Benzene, Chloroform, Dichloro methane, Ethyl acetate, Ethyl formate, Formic acid, Hexane, Pyridine (ACS Grade; Fisher Scientific) Acetone-d6, Chloroform-d, Methanol-d4 (Deuteration, Cambridge Isotope) Acetone (A.R. Grade; E. Merck), Methanol (A.R. Grade; E. Merck) Ethanol (Ultra Pure; Alps Chem Co., LTD) Methanol (HPLC Grade; Mallinckrodt) Pyridine-d5 (Deuteration, Aldrich). 19.

(32) 四、抗癌活性分析：細胞株： MCF-7 人乳腺癌細胞 Source: Food Industry Research and Development Institute BCRC Number: 60436 Type: Human breast adenocarcinoma Species: Homo Sapiens (Human) Tissue: mammary gland, breast Growth property: Adherent Morphology: Epithelial Incubation Condition: 37oC, 5% CO2 HepG2 人類肝癌細胞： Source: Food Industry Research and Development Institute BCRC Number: 60364 Type: human hepatoblastoma Species:Homo sapiens (human) Tissue: Liver; hepatocellular carcinoma Growth property: Adherent Morphology: Epithelial Incubation Condition: 37C, 5% CO2 細胞培養液： Minimum Essential Medium (Gibco) Fetal bovine serum (Gibco) Non-essential amino acids (Gibco) L-Glutamine (Gibco) Sodium-Pyruvate (Hyclone) 活性分析試藥與試劑： Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma) MTT ([3-(4,5dimethylthialzol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide (Sigma) Doxorubicin (Sigma). 20.

(33) 第三章. 化合物構造之結構鑑定. 本實驗中共從白英 solanum lyratum Thunb.分得十八個化合物，，化合物 1-18 上述化合物經解析各種光譜及物理數據，詳述決定構造如後。. 21.

(34) 化合物 1 (3,3',4',7-tetramethoxymyricetin) 之結構解析 OCH3 OCH3. H3CO. O OH. OCH3 OH. O. 化合物 1 為黃色針狀結晶，與 FeCl3 試劑呈藍黑色反應。氫譜 (DMSO-d6, 500 MHz) 顯示有四個甲氧基信號，分別於 δ H 3.75 (3H, s)、δ H 3.80 (3H, s)、δ H 3.82 (3H, s)、δ H 3.83 (3H, s)。在芳香區域中，有兩組間位偶合氫訊號；較高磁場的一組為 δ H 6.32 (1H, d, J = 2.0 Hz)、6.68 (1H, d, J = 2.0 Hz)，其化學位移符合黃酮類骨架 A 環 6、8 位置氫訊號之特徵值；較低磁場的一組間位偶合訊號 δ H 7.17 (1H, d, J = 1.9 Hz)及 δ H 7.24 (1H, d, J = 1.9 Hz)，化學位移近似 myricetin 骨架的 B 環氫譜位移值，推測應為 B 環上不對稱甲氧基取代造成兩氫化學不等位。依以上物理性質及氫譜特徵，推測本化合物為 Flavonol 類化合物。解析碳譜，1 具有四個甲氧基碳 (δ C 56.0、δ C 56.1、δ C 60.0、δ C 2 60.1)，尚有一個羰基吸收的碳 δ C 178.3 及十四個 SP 碳原子 (δ C 92.4 ~. δ C 161.0)。碳數符合黃酮類骨架類特徵，經由 HMBC 中 A、B 環芳香氫對此十四烯類碳之關聯訊號 (Table 2) 及各碳吸收大小相對關係，確認主骨架之連結方式。同時，B 環上之特徵訊號 δ C 104.0 及 δ C 22.

(35) 110.0 可確認化合物 1 為具有甲氧基取代之 myricetin 骨架。經解析甲氧基氫與芳香碳之 HMBC 關聯訊號：δ H 3.82 / δ C 165.5 (C-7) 可確認甲氧基 δ H 3.82 接於 C-7 位置、δ H 3.80 / δ C 138.8 (C-3) 可確認甲氧基 δ H 3.80 接於 C-3 位置、δ H 3.83 / δ C 150.6 (C-3') 可確認甲氧基 δ H 3.83 接於 C-3'位置、δ H 3.75 / δ C 139.0 (C-4') 可確認甲氧基 δ H 3.75 接於 C-4' 位置。綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對後，確認此化合物為 3,3',4',7- tetramethoxymyricetin (1)46。. 23.

(36) Table 2 NMR spectral data of compound 1 ( δva l ue s , i nDMSO-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-OMe 7-OMe 3'-OMe 4'-OMe. 13 δ ( C) 155.4 138.8 178.3 161.0 98.0 165.5 92.4 156.4 105.4 125.0 104.0 153.1 139.0 150.6 110.0 60.0 56.1 56.0 60.1. 1 δ H mult (J,Hz). HMBC. 12.53 (bs) 6.32 (d, 2.0 Hz). C-5, C-6, C-10 C-5, C-7, C-8, C-10. 6.68 (d, 2.0 Hz). C-6, C-7, C-9, C-10. 7.17 (d, 1.8 Hz). C-1', C-2', C-4', C-5', C-2. 9.68 (bs, OH) 7.24 (d, 1.8 Hz) 3.80 (3H, s) 3.82 (3H, s) 3.83 (3H, s) 3.75 (3H, s). C-2', C-3', C-4' C-1', C-3', C-4', C-5', C-2 C-3 C-7 C-3' C-4'. 24.

(37) 3.75 OCH3 OCH3 3.83. 7.17 3.82 H3CO. 6.68. O 7.24. OH 9.68. 6.32 OCH3 3.80 OH 12.53. O. 6'-H. 2'-H 8-H 6-H. Fig. 4 1H-NMR spectrum of 1. (DMSO-d6, 500 MHz) 25.

(38) OCH3 153.1 104.0 92.4. H3CO. 156.4. O. 125.4 155.4. 165.5 98.0 161.0 OH. 4. 105.4. 178.3. OCH3 139.0 150.6. 110.0. OH. 138.8 OCH3. O. 7 5. 3' 5' 92. 4' 3. 1'. 6'. 2' 6 10. 8. 3-OMe 4'-OMe 7-OMe 3'-OMe. Fig. 5 13C-NMR spectrum of 1. (DMSO-d6, 125 MHz) 26.

(39) 4'-OH. 5-OH. 6' 2'. 8. OCH3 OCH3. 3'-OMe 7-OMe 3-OMe 4'-OMe. H3CO. O OH. OCH3 OH. O. 8 6 2' 10 6' 1' 3 4' 5' 3'. 2 9 5 7 4. Fig. 6 HMBC spectrum of 1. (DMSO-d6) 27. 6.

(40) 化合物 2 (3, 3’ , 7 - trimethoxyquercertin)之結構解析 OCH3 OH. H3CO. O. OCH3 OH. O. 化合物 2 為黃色針狀結晶，與 FeCl3 試劑呈藍黑色反應。 2 之氫譜 (DMSO-d6, 500 MHz) 顯示有三甲氧基信號，分別為 δ H 3.79 (3H, s)、δ H 3.84 (3H, s)、δ H 3.94 (3H, s)。在芳香區域中，有一組間位偶合氫吸收訊號，為 δ H 6.34 (1H, d, J = 2.0 Hz)、6.42 (1H, d, J = 2.0 Hz)，其化學位移符合黃酮類骨架 A 環 6、8 位置氫位移特徵，另在較低磁場有一組 ABX 系統偶合氫之訊號，分別為 δ H 6.95 (1H, d, J = 8.4 Hz)、δ H 7.62 (1H, d, J = 8.4, 1.9 Hz)、δ H 7.65 (1H, d, J = 1.9 Hz)，化學位移符合 Quercertin 骨架的 B 環氫譜特徵。無 C 環氫訊號可推測此化合物為 Quercertin 的多甲氧基衍生物。碳譜中除去三甲氧基碳 δ C 55.9、δ C 56.0、δ C 59.9 後，餘下一羰基 2 碳(δ C 178.2)及十四個 sp 碳質子 (δ C 92.5 ~ δ C 165.3) 的 C3-C6-C3 黃酮. 類特徵。經由 HMBC 中各芳香氫對碳之關聯訊號 (Table 3) 及各碳碳譜吸收，推定主骨架之連結方式後，可確認此化合物為 trimethoxyquercertin。經解析甲氧基氫與芳香碳之 HMBC 由 δ H 3.79 / δ C 138.1 (C-3)、δ H 3.84 / δ C 165.3 (C-7)、δ H 3.84 / δ C 147.6 (C-3') 關聯 28.

(41) 訊號，確認甲氧基取代位置。綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對一致後，確認此化合物為 3,3’ ,7- trimethoxyquercertin (2)47。. 29.

(42) Table 3 NMR spectral data of compound 2 ( δva l ue s , i nDMSO-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-OMe 7-OMe 3'-OMe. 1 δ(13C) δ H mult (J, Hz). 155.9 138.1 178.2 161.0 97.9 165.3 92.5 156.4 105.3 122.5 112.2 147.6 150.0 115.8 120.8 59.9 55.9 56.2. HMBC (H→C). 12.63 (bs) 6.34 (d, 2.0 Hz). C-5, C-6, C-10 C-5, C-7, C-8, C-10. 6.76 (d, 2.0 Hz). C-6, C-7, C-9, C-10. 7.65 (d, 1.9 Hz). C-1', C-3', C-4', C-2. 9.99 (bs) 6.95(d, 8.4 Hz) 7.62 (dd, 8.4 Hz, 1.9 Hz) 3.79 (3H, s) 3.84 (3H, s) 3.84 (3H, s). C-3', C-4', C-5' C-2', C-4', C-6' C-2', C-4', C-2 C-3 C-7 C-3'. 30.

(43) 3.84 OCH3 9.99 OH 7.65 3.84 H3CO. 6.76. O. 6.95 7.62. 6.34 OCH3 3.78 OH 12.63. 3-OMe. O. 3'-OMe 7-OMe. 12-OH. 4'-OH. 2'-H6'-H 5'-H. 6-H 8-H. Fig. 7 1H-NMR spectrum of 2. (DMSO-d6, 500 MHz) 31.

(44) 56.2. OCH3 147.6 112.2 55.9. 92.5. H3CO. O. 122.5. 115.8. 155.9. 165.3. OH 150.0. 120.8. 138.1. 97.9 161.0. OCH3. 178.2. 59.9. OH. O. 4. 7. 5 92. 4' 3'. 3. 6' 5' 2' 1' 10. 6. 8. Fig. 8 13C-NMR spectrum of 2. (DMSO-d6, 125 MHz) 32. 3;-OMe 7-OMe 3-OMe.

(45) 7-OMe. OCH3 OH. 2'-H 6'-H H3CO. 12-OH. O. 4'-OH. 5'-H8-H6-H. OCH3 OH. O. 3;-OMe 7-OMe 3'-OMe. 8 6 10 2' 5' 1' 6' 3 3' 4' 2 9 5 7 4. Fig.9 HMBC spectrum of 2. (DMSO-d6) 33. 3'-OMe. 3-OMe.

(46) 化合物 3 (3,4'-dimethoxykampferol) 之結構解析 OCH3. HO. O. OCH3 OH. O. 化合物 3 為黃色無晶型粉末，與 FeCl3 試劑呈墨綠色反應。氫譜 (Acetone-d6, 500 MHz) 顯示有二個甲氧基訊號，分別呈現於δ H 3.84 (3H, s)、δ H 3.89 (3H, s)。在芳香區域中，偏高磁場有一組間位偶合氫吸收訊號，為 δ H 6.23 (1H, d, J = 2.0 Hz)、6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz)，化學位移符合黃酮類骨架 A 環 6、8 位置氫位移特徵，另在較低磁場有一組 A2X2 系統偶合氫訊號 δ H 7.09 (2H, d, J = 9.0 Hz)、8.07 (2H, d, J = 9.0 Hz)，化學位移符合 Kampferol 骨架的 B 環氫譜特徵。無 C 環氫訊號；推測此化合物為 dimethoxykampferol 骨架。碳譜中除去二甲氧基碳 δ C 55.8、δ C 60.2 後，餘下一羰基碳 (δ C 179.4) 及十四 sp2 碳 (δ C 105.6 ~ δ C 162.6) 的典型黃酮類特徵。經由 HMBC 中各芳香氫（Table 4）及各位置碳關聯訊號，確認 3 之骨架之連結方式後，B 環上之特徵吸收 δ C 114.8 (2C) 及 δ C 130.9 (2C) 可確認化合物 3 為 dimethoxyKampferol。經解析甲氧基氫與芳香碳之 HMBC 關聯訊號 δ H 3.84 / δ C 139.2 (C-3)、δ H 3.89 / δ C 162.6 (C-4')，確認甲氧基取代於 C-3、C-4'。. 34.

(47) 綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對一致後，確認此化合物為 3,4'-Dimethoxykampferol (3) 48。. 35.

(48) Table 4 NMR spectral data of compound 3 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-OMe 4'-OMe. δ(13C) 156.4 139.2 179.4 163.0 99.4 165.1 94.5 157.7 105.6 123.5 130.9 114.8 162.6 114.8 130.9 60.2 55.8. 1 δ H mult (J, Hz). HMBC. 12.72 (br s) 6.23 (d, 2.0 Hz). C-5, C-6, C-10 C-5, C-7, C-8, C-10. 6.47 (d, 2.0 Hz). C-9, C-7, C-6, C-10. 8.07 (d, 9.0 Hz) 7.09 (d, 9.0 Hz). C-1', C-3', C-4', C-6' C-2, C-2', C-4', C-5'. 7.09 (d, 9.0 Hz) 8.07 (d, 9.0 Hz) 3.84 (3H, s) 3.89 (3H, s). C-2, C-2', C-3', C-4' C-1', C-2', C-3', C-4' C-3 C-4'. 36.

(49) 3.89 OCH3. 7.09 8.07 6.47. HO. O. 7.09 8.07. 6.23 OCH3 3.85 OH 12.72. 3-OMe 4'-OMe. O. 5-OH. 2'6'-H. 1. 3'5'-H. 8-H 6-H. 37. Fig. 10 H-NMR spectrum of compound 3. (Acetone-d6, 500 MHz).

(50) 114.8 130.9 94.5. HO 165.1. 55.8 OCH3 162.6 114.8. 157.7 O 156.4. 123.5 130.9. 139.2. 99.4 163.0. 105.6. OCH3 60.2. 179.7. OH. O. 2'6'. 3'5' 7-OMe3-OMe. 4 7. 5 4' 9. 2. 1'. 3. 13. 10 6. 8. 38. Fig. 11 C-NMR spectrum of compound 3. (Acetone-d6, 500 MHz).

(51) OCH3. HO. 3-OMe 4'-OMe. O. OCH3 OH. O. 3 4'. Fig. 12 HMBC spectrum of compound 3. (Acetone, 500 MHz) 39.

(52) 化合物 4 (3,3',7- trimethoxymyricetin)之結構解析 OCH3 OCH3. HO. O OH. OCH3 OH. O. 化合物 4 為黃色無晶型粉末，與 FeCl3 試劑呈藍綠色反應。氫譜 (DMSO-d6, 500 MHz) 顯示有三甲氧基氫訊號，分別為 δ H 3.75 (3H, s)、δ H 3.79 (3H, s)、δ H 3.82 (3H, s)。在芳香區域中，有兩組間位偶合氫之訊號，較高磁場的一組為 δ H 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz)、6.43 (1H, d, J = 2.0 Hz)，化學位移符合黃酮類骨架 A 環 6、8 位置氫訊號特徵，較低磁場的一組間位偶合氫 δ H 7.15 (1H, d, J = 2.0 Hz)及 δ H 7.20 (1H, d, J = 2.0 Hz)，偶合形式推測為間位取代，加上化學吸收近似 myricetin 骨架的 B 環氫譜位移值，推測應為 B 環上不對稱甲氧基取代，造成兩氫化學不等位。綜合以上物理性質及氫譜特徵，推測本化合物為 Flavonol 類化合物。解析碳譜，除三甲氧基碳外 (δ C 56.0、δ C 60.0、δ C 60.1)，尚有一 2 羰基碳 δ C 178.1 及十四個 sp 碳訊號 (δ C 93.9 ~ δ C 164.4) 可被觀察。. 碳數符合黃酮類骨架特徵。B 環上之特徵吸收 δ C 103.9 及 δ C 109.9 可確認化合物 4 為 trimethoxymyricetin 骨架。比對化合物 1 之碳譜可發現本化合物碳譜在 B 環的化學位移幾乎沒有改變，而在 A 環的位 40.

(53) 移出現微細差異 (C-6 = +0.8 ppm, C-7 = -1.1 ppm, C-8 = +1.5 ppm，δ C 化合物 4 減 δ C 化合物 1 )，且比對甲氧基的氫譜及碳譜可發現化合物 4 較化合物 1 少了 7-OMe (δ H 3.82 / δ C 56.0)，因此推論出本化合物的甲氧基連結於 C-3、C-3'及 C-4'。綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對一致後，確認此化合物為 3,3',4' –trimethoxymyricetin (4) 49。. 41.

(54) Table 5 NMR spectral data of compound 4 ( δva l ue s , i nDMSO-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-OMe 3'-OMe 4'-OMe. δ(13C) 156.5 138.6 178.2 161.3 98.8 164.4 93.9 156.5 106.3 125.1 103.9 153.1 139.0 150.6 109.9 60.0 56.0 60.1. 1 δ H mult (J, Hz). 12.54 (bs) 6.19 (d, 2.0 Hz) 6.43 (d, 2.0 Hz). 7.15 (d, 2.0 Hz). 7.20 (d, 2.0 Hz) 3.79 (3H, s) 3.82 (3H, s) 3.75 (3H, s). 42.

(55) 3.75 OCH3 3.82 OCH3 7.20 HO. 6.43. O OH 7.15. 6.19 OCH3 12.54 OH 12.54. O. 3'-H 2'-H 5-OH. 6-H 8-H. Fig. 13 1H-NMR spectrum of compound 4. (DMSO-d6, 500 MHz) 43.

(56) 56.0 OCH3 60.1 OCH3. 153.1. 93.9. HO. 156.5. 164.4 98.8. O. 103.9. 139.0. 125.1. 150.6. 156.5. 109.9. 3-OMe 4'-OMe 7-OMe. OH. 138.6 106.3 161.3 OH. 178.2. OCH3 60.0. 7. O. 4. 5. 5'. 6'. 3' 1'. 4' 3. 9. 8. 2' 6 10. 2. Fig. 14 13C-NMR spectrum of compound 4. (DMSO-d6, 125 MHz) 44.

(57) 化合物 5 (3-methoxykampferol) 之結構解析 OH. HO. O. OCH3 OH. O. 化合物 5 為黃色無晶型粉末，其之紅外線光譜顯示有羥基 ( 3208 cm-1) 、羰基 (1660 cm-1) 及苯環 (1602 cm-1, 1498 cm-1) 等官能基的存在。另外，紫外光譜在 268 nm (5.08) 及 350 nm (4.93) 有最大吸收 (λmaxMeOH (log ε ))，與 FeCl3 試劑呈墨綠色反應。氫譜 (DMSO-d6, 500 MHz) 顯示有一甲氧基信號 δ H 3.74 (3H, s )。高磁場位置 δ H 12.65 (1H, br s)為受氫鍵影響位移之羥基，據其特徵可推測為黃酮類 C-5 位置之羥基。在芳香區域中，於 δ H 6.17 (1H, d, J = 2.0 Hz)、6.42 (1H, d, J = 2.0 Hz) 有一組間位偶合質子吸收訊號，推測黃酮類骨架 A 環 6、8 位置氫，另在較低磁場有一組 AA'XX'系統偶合氫訊號 δ H 6.92 (2H, d, J = 9.0 Hz)、7.90 (2H, d, J = 9.0 Hz)，化學位移與 kampferol 骨架的 B 環氫譜特徵相似。可推測此化合物為 methoxy kampferol 骨架。於 5 之碳譜中呈現一甲氧基碳 δ C 59.8，一個羰基碳 (δ C 178.0) 及十四個 sp2 碳 (δ C 104.3 ~ δ C 161.3) 的黃酮類特徵。甲氧基之化學位移δ C 59.8 位移相對於一般黃酮類 AB 環上甲氧基取代之 δ C 55 處於較. 45.

(58) 低磁場，可推測此甲氧基為 C 環受羰基影響之 C-3 位置取代。綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對後，確認此化合物為 3-methoxykampferol (5) 50。. 46.

(59) Table 6 NMR spectral data of compound 5 ( δva l ue s , i nDMSO-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3-OMe. δ(13C) 155.7 137.7 178.0 160.2 98.6 164.2 93.8 156.4 104.3 120.6 130.2 115.7 161.3 115.7 130.2 59.8. 1 δ H mult (J, Hz). 12.65 (br s) 6.18 (d, 2.0 Hz) 6.42 (d, 2.0 Hz). 7.91 (d, 9.0 Hz) 6.91 (d, 9.0 Hz) 6.91 (d, 9.0 Hz) 7.91 (d, 9.0 Hz) 3.75 (s). 47.

(60) 6.91. OH. 7.91 6.42. HO. O. 6.91 7.91. 6.18 OCH3 3.71 OH 12.65. O. 3-OMe 5-OH. 2' 6'. 3' 5' 8 6. Fig. 15 1H-NMR spectrum of compound 5. (DMSO-d6, 400 MHz) 48.

(61) 55.8 OCH3. 115.7 130.2 93.8. HO 164.2. 156.4 O 155.7. 161.3 115.7. 120.6 130.2. 137.7. 98.6 160.2 OH. 104.3 178.0. OCH3 60.2. 2' 6'. 3' 5'. O. 3-OMe 74' 5 4. 92. 6 3. 1'. 8. 10. Fig. 16 13C-NMR spectrum of compound 5. (DMSO-d6, 100 MHz) 49.

(62) 化合物 6 (Scopoletin) 之結構解析 H3CO. HO. 8. 5. 9 O. 10. O 3. 4. 化合物 6 為白色針狀結晶，氫譜 (Acetone-d6, 500 MHz) 顯示有一組與羰基共振之環內雙鍵氫訊號，為 δ H 6.16 (1H, d, J = 9.3 Hz)、7.83 (1H, d, J = 9.3 Hz)，推測此化合物為 coumarin 類骨架。在芳香區域中，於δ H 6.78 (1H, s) 和 7.17 (1H, s)有兩單峰質子吸收訊號，化學位移符合香豆素類骨架 5、8 位置氫化學位移特徵，由以上氫位置可推測位於δ H 3.88 (3H, s) 為苯環上 C-6 或 C-7 之甲氧基質子吸收訊號。再比對文獻得知此化合物結構為已知物 Scopoletin (6) 51。. 50.

(63) Table 7 NMR spectral data of compound 6 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 2 3 4 5 6-OH 7-OCH3 8 9 10. 1 δ H mult (J, Hz). 6.16 (1H, d, 9.5 Hz) 7.83 (1H, d, 9.5 Hz) 6.78 (1H, s) 3.88 (3H, s) 7.17 (1H, s). 51.

(64) H3CO 3.88 HO. 7.17. O. O 6.16. 6.18. OMe. 7.83. 8-H 5-H 4-H. 3-H. Fig. 17 1H-NMR spectrum of compound 6. (Acetone-d6, 500 MHz) 52.

(65) 化合物 7 (Methyl caffeate) 之結構解析 O 2'. HO. 3 3'. HO. 1'. 1 2. OCH3. 6'. 4' 5'. 化合物 7 為白色無晶型粉末，氫譜 (Acetone-d6, 500 MHz) 於為 δ H 6.26 (1H, d, J = 15.8 Hz)、7.52 (1H, d, J = 15.8 Hz)顯示有一組反式雙鍵上之氫訊號，在芳香區域中，有一組 ABX 系統之氫偶合訊號，分別於 δ H 7.15 (1H, d, J = 1.9 Hz)、6.85 (1H, d, J = 8.2 Hz) 和 7.01 (1H, dd, J = 1.9, 8.2 Hz)，此外位於 δ H 3.70 (3H, s) 的單峰推測為羰基旁之甲氧基吸收訊號。再比對文獻得知此化合物結構為已知物 Methyl caffeate(7) 52。. 53.

(66) Table 8 NMR spectral data of compound 7 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 1 2 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' OCH3. 1 δ H mult (J, Hz). 7.52 (d, 15.9 Hz) 6.26 (d, 15.9 Hz) 7.15 (d, 1.9 Hz). 6.85 (d, 8.2 Hz) 7.01 (dd, 1.9 Hz, 8.16 Hz) 3.70 (s). 54.

(67) O HO. 7.15. 6.26 7.52. OCH3 3.70. OMe. 7.01 HO. 6.85. 6'-H 2-H 2'-H 5'-H 3-H. Fig. 18 1H-NMR spectrum of compound 7. (Acetone-d6, 500 MHz) 55.

(68) 化合物 8 (Vanillin) 之結構解析 OCH3 H OH O. 化合物 8 為白色粉末，其之氫譜 (CDCl3, 500 MHz) 於 δ H 7.41 (1H, s)、7.04 (1H, d, J = 8.5 Hz) 和 7.42 (1H, d, J = 8.5 Hz)呈現有一組 ABX 系統之質子偶合訊號，此外位於 δ H 9.81 (1H, s)的單峰為醛基之氫吸收訊號。另有一甲氧基出現於 δ H 3.96 (3H, s)，故可推測此化合物為 benzaldehyde 類 3、4 位置接氧原子之結構，經比對文獻得知此化合物結構為 Vanilin53。. 55.

(69) Table 9 NMR spectral data of compound 8 ( δva l u e s , i nCDCl3, J in Hz) Position 1-CHO 2 3-OCH3 4-OH 5 6. 1 δ H mult (J,Hz) 9.82 (s) 7.41 (s) 3.96 (3H, s) 6.21 (br s) 7.04 (d, 8.5 Hz) 7.42 (d, 8.5 Hz). 56.

(70) H 9.82. O. 1-CHO. 7.42. 6-H. 7.41. 5-H 2-H 3-OMe. 7.04. OCH3. 3.96 OH. 6.21. 4-OH. Fig. 35 1H-NMR spectrum of compound 8. (CDCl3, 500 MHz) 57.

(71) 化合物 9 (p-Hydroxybezaldehyde)之結構解析 H HO O. 化合物 9 為白色粉末，氫譜 (CDCl3, 500 MHz) 顯示有一組 AA'XX'系統之質子偶合訊號，分別為 6.98 (2H, d, J = 8.4 Hz) 和 7.81 (2H, d, J =8.4 Hz)，此外位於 δ H 9.82 (1H, s) 的單峰可解析為醛基之氫訊號。可推測此化合物為 benzaldehyde 類 4 位置接含氧取代基之結構，經比對文獻得知此化合物結構為已知物 p-Hydroxybezaldehyde (9) 51. 。. Table 10 NMR spectral data of compound 9 ( δv a l ue s ,i nCDCl3, J in Hz) Position 1-CHO 2 3 4 5 6. δ H mult (J,Hz) 9.85 (s) 7.81 (d, 8.4 Hz) 6.98 (d, 8.4 Hz) 6.98 (d, 8.4 Hz) 7.81 (d, 8.4 Hz) 58.

(72) H 9.85. O. 7.81. 7.81. 6.98. 6.98. 1-CHO 3,5-H. 2,6-H. OH. Fig.38 1H-NMR spectrum of compound 9. (CDCl3, 500 MHz) 59.

(73) 化合物 10 (N-(trans-Feruloyl)tyramine)之結構解析 3' 2'. O H3CO. 7. 2. HO. 8'. 3 1. OH 4'. N H. 8. 5'. 1' 7'. 6'. 6. 4 5. 化合物 10 為淡黃色固體，氫譜 (Acetone-d6, 500 MHz) 在 δ H 6.54 (1H, d, J = 15.6 Hz)、7.49 (1H, d, J = 15.6 Hz)顯示有一組與羰基共振之反式雙鍵上質子吸收訊號，及於 δ H 7.12 (1H, d, J = 1.5 Hz)、6.83 (1H, d, J = 8.2 Hz) 和 7.02 (1H, dd, J = 1.5, 8.2 Hz)一組芳香區域中 ABX 系統之質子偶合訊號，此五質子之化學位移特徵及光譜訊號類似 Caffeoyl 之化學位移，可推測此化合物有一類似 Caffeoyl 之片段。芳香區域另有一組 AA'XX'偶合系統之氫訊號呈現於 δ H 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz)及 δ H 7.04 (2H, d, J = 8.5 Hz)。另外，尚有一甲氧基訊號 δ H 3.82 (3H, s)，兩個相互偶合亞甲基訊號 δ H 2.75 (2H, t, J = 7.4 Hz)及 δ H 3.47 (2H, m)，並推測 δ H 3.47 之亞甲基尚與另一氫有偶合。並由其化學位移傾向低磁場的程度，推測此質子另與 NH 質子偶合。而其中 δ H 2.75 的氫訊號可能歸屬苯環旁之亞甲基。 2 另於 10 之碳譜，顯示一個醯胺碳 δ C 167.1，及十四 sp 碳 (δ C. 111.3 ~ δ C 156.6)之存在，其中 δ C 116.0 (2C) 及 δ C 130.0 (2C) 為 AA'XX'苯環之特徵，經由化學位移相對關係確認此苯環其餘碳對應. 60.

(74) 訊號，另八個芳香碳質子亦可整理出一 ABX 之系統苯環及一組雙鍵碳。脂氫區於 δ C 35.5 及 δ C 41.8 顯示兩個亞甲基碳，其化學位移特徵亦可證實由氫譜推測的 C-7'、C-8'連結位置。一甲氧基碳 δ C 56.1，經比對文獻後確認其屬 Feruloyl 上之甲氧基。綜合以上物理數據及圖譜解析，並與文獻資料比對一致，確認此化合物為 N-(trans-Feruloyl)tyramine 54。. 61.

(75) Table 11 NMR spectral data of compound 10 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 5-OCH3. δ(13C) 127.9 111.3 149.2 148.5 116.1 122.5 140.8 119.4 167.1 130.7 130.3 116.0 156.6 116.0 130.3 35.5 41.8 56.1. 1 δ H mult (J, Hz). 7.12 (d, 1.5 Hz). 6.83 (d, 8.2 Hz) 7.02 (dd, 8.2 Hz, 1.5 Hz) 7.49 (d, 15.6 Hz) 6.54 (d, 15.6 Hz). 7.04 (d, 8.5 Hz) 6.76 (d, 8.5 Hz) 6.76 (d, 8.5 Hz) 7.04 (d, 8.5 Hz) 2.75 (2H , t, 7.4 Hz) 3.50 (2H, m) 3.82 (3H, s). 62.

(76) 7.09 OCH3. HO. 2'6'-H 6.83. 5-OMe. 3'5'-H. 7.12. 7-H. 7.02 7.49. 6-H. 3-H. 8-H. 2-H. 6.54 O HN 3.50 2.75 7.04 7.04. 1''-H. 2''-H. 6.76 6.76 OH. Fig. 21 1H-NMR spectrum of compound 10. (Acetone-d6, 500 MHz) 63.

(77) 116.0. O 56.1. H3CO. 111.3. 149.2. HO. 140.8. 127.9. 148.5. 130.3. OH 156.6. 41.8 167.1 119.4. 116.0. 130.7. N H. 35.5. 130.3. 122.5 116.1. 2'5'. 3'4' 6 7 9. 4' 3 4. 1' 2. 5-OMe. 2. 7' 8'. 8 5. Fig. 22 13C-NMR spectrum of compound 10. (Acetone-d6, 125 MHz) 64.

(78) 化合物 11 (indole-3-carboxaldehyde) 之結構解析 7. H N. 8. 6. 2 5. 9. 3. 4. 10 H O. 化合物 11 為紅色無晶型粉末，11 之氫譜 (Acetone-d6, 500 MHz) 顯示一個醛基氫訊號 δ H 10.01 (1H, s)，在芳香區域顯示有兩個二重峰，分別為 δ H 7.53 (1H, d, J = 7.8 Hz)及 δ H 8.21 (1H, d, J = 7.8 Hz)，此二重峰左低右高樣式指出其與偏高磁場區質子偶合而非相互偶合，偏高磁場芳香區域亦顯示兩個三重峰 δ H 7.22 (2H, t, J = 7.8 Hz)及 δ H 7.25 (2H, t, J = 7.8 Hz)，推測以上四個氫訊號為苯環上各自鄰位關係的四個氫取代。另有一單峰質子吸收位於 δ H 8.17 (1H, s)，可推測此化合物尚有另一不飽合鍵上之氫，由其化學位移傾向低場的程度，推定可能連接於氮原子旁之碳上。解析碳譜，除一個醛基碳δ C 185.44外，11 尚有八個芳香環碳，碳數不尚足以構成由氫譜資訊推測的芳香環數目，推定此化合物為其中一環具異原子氮的indole類骨架，解析單峰芳香氫δ H 8.17 (1H, s) 在 HMBC中的關聯訊號δ H 8.17 (1H, s) / δ C 119.9、δ H 8.17 (1H, s) / δ C 138.1 與δ H 8.17 (1H, s) / δ C 125.4可推測此單峰芳香氫位於indole骨架C-2位置，而醛基δ H 10.01 (1H, s)在HMBC中的關聯訊號δ H 10.01 (1H, s) / δ C. 65.

(79) 119.9、δ H 10.01 (1H, s) / δ C 125.4可推定其連接於C-3位置。最後經由四個互鄰位氫與各芳香碳之間的關聯訊號決定苯環碳連結關係 (Table 12)。經比對文獻得知此化合物結構為已知物 indole-3-carbox aldehyde (11) 55。. 66.

(80) Table 12 NMR spectral data of compound 11 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10. δ(13C) 137.9 119.9 122.1 122.9 124.4 112.9 138.1 125.4 185.44. 1 δ H mult (J, Hz) HMBC 11.38 (1H, bs, NH) 8.17 (1H, s) C-3, C-10, C-8, C-9. 8.21 (1H, d, 7.8 Hz) 7.22 (1H, t, 7.8 Hz) 7.25 (1H, t, 7.8 Hz) 7.53 (1H, d, 7.8 Hz). C-5, C-9 C-7, C-9 C-4, C-8 C-6, C-8. 10.01 (1H, s). C-3, C-9. 67.

(81) 11.38 H N. 7.53 7.25. 5-H 6-H. 8.17 7.22 8.21 H 10.01. O. 10-H. 2-H. 4-H. 7-H. 1-NH. Fig.23 1H-NMR spectrum of compound 11. (Acetone-d6, 500 MHz) 68.

(82) 112.9 138.1 124.4. H N 137.9. 122.9 125.4. 119.9. 122.1 185.44 H O. 5 6. 10. 4 7. 82. 9. 3. Fig.24 13C-NMR spectrum of compound 11. (Acetone-d6, 125 MHz) 69.

(83) H N. H O. 3 9 2 8. 10. Fig.25 HMBC spectrum of compound 11. (Acetone-d6) 70.

(84) 化合物 12 (indole-3-carboxylic acid) 之結構解析 H N. OH O. 化合物 12 為紅褐色無晶型粉末，於其之氫譜 (Acetone-d6,500 MHz) 在芳香區域 δ H 7.49 (1H, d, J = 8.4 Hz) 以及 δ H 8.13 (1H, d, J = 8.4 Hz)顯示有兩二重峰質子訊號，此二重峰均呈現左低右高，指出其與偏高磁場區之氫偶合而非相互偶合，偏高磁場芳香區域亦顯示兩個重疊質子吸收 δ H 7.15 - 7.20 (2H, m)，與化合物 11 氫譜特徵相當類似，可推測以上四個氫訊號可歸屬為苯環上各自鄰位的四個氫質子取代。另有一單峰質子吸收位於 δ H 8.01 (1H, s)，可推測其位於含氮環上，由其化學位移傾向低場的程度猜測可能連接於氮旁碳上。 2 解析碳譜，除羰基碳δ C 166.5外，尚有八個sp 碳質子，碳數不足. 以構成由氫譜資訊推測的芳香環數目，推測此化合物是雜環結構的 indole類骨架，偏高磁場的羰基碳訊號δ C 166.5可能是與雙鍵共振之羰酸基所影響。最後經由比對文獻得知此化合物結構為已知物 indole-3-carboxlic acid(12) 56。. 71.

(85) Table 13 NMR spectral data of compound 12 ( δva l ue s , i nAcetone-d6, J in Hz) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10. δ(13C) 132.9 108.5 121.8 121.9 123.1 112.8 137.7 127.3 166.5. 1 δ H mult (J, Hz) 11.05 (1H, bs, NH) 8.01 (1H, s). 8.13 (1H, d, 8.4 Hz) 7.15 - 7.20 (2H, m) 7.15 - 7.20 (2H, m) 7.49 (1H, d, 8.4 Hz). 72.

(86) 7.49 7.15 - 7.20 m. 11.05 H N 8.01. 7.15 - 7.20 m 8.13 OH O. 2-H 6-H 5-H. 4-H. 1-NH. 7-H. 73 1. Fig.26 H-NMR spectrum of compound 12. (Acetone-d6, 500 MHz).

(87) 112.8 137.7. 123.1. H N 132.9. 121.9. 127.3 121.8. 108.5. 6. 166.5 H O. 5. 4 7. 2 10 9 8. 3. Fig.27 13C-NMR spectrum of compound 12. (Acetone-d6, 125 MHz) 74.

(88) 化合物 13, 14 (β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside and β-Stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside) 之結構解析 29 21. 28. 22 20 18 19. 14 10. O. HO. 26 25. 17. 11. 1 3. 24 23. 15. 27. 8. 5. O. 6'. 1' OH. HO HO. 化合物 13, 14 為白色無晶型粉末。比旋光度 [α]27D -63.4˚( c 1.0, Pyridine)。以 10 % H2SO4 噴灑加熱呈色，顏色由淡紅轉變為紫黑，推測其為固醇類化合物。氫譜 (Pyridine-d5, 500 MHz) 顯示於 δ H 0.65 至 δ H 0.99 間有許多複雜甲基重合之質子偶合訊號，其中 δ H 0.65 (3H, s) / δ H 0.66 (3H, s) 以及 δ H 0.92 (3H, s)分別為固醇類化合物 C-18 以及 C-19 之特徵訊號，且可由 δ H 0.65 (3H, s) / δ H 0.66 (3H, s) 兩訊號以及一個積分較小的環外反式雙鍵訊號 δ H 5.21 (1H, dd, J = 8.8, 15.2 Hz) 推測此化合物為混合物。而同時也因 δ H 5.21 (1H, dd, J = 8.8, 15.2 Hz) 此環外反式雙鍵訊號及於 δ H 0.84 附近多數雙重峰甲基重合推測此混合物為具有支 Δ 鏈之植物固醇類骨架。另於 δ H 5.34 (1H, br s) 亦顯示固醇類骨架 5-. 雙鍵之特徵吸收訊號。於 δ H 3.95 至 δ H 5.05 有一組糖基特徵訊號，積分相當於七個氫，由 anomeric 氫訊號 δ H 5.05 (1H, d, 7.7Hz, H-1') 可 75.

(89) 推測其為 β位向的六碳糖。碳譜 (Pyridine-d5, 125 MHz) 可發現 δ C 140.0 及 δ C 121.9 為標準固醇類骨架Δ5-雙鍵之特徵訊號，δ C 138.9 及 δ C 129.6 為固醇類支鏈 22(E)之特徵訊號，可進一步確認此混合物屬於含有支鏈之固醇類，碳譜總共有 51 個碳訊號，扣除六碳醣後餘下 45 個碳訊號，且具有明顯的混合物特徵（如：δ C 56.3 / δ C 56.1，訊號強度 2 : 1。δ C 56.9 / δ C 57.0，訊號強度 2 : 1）。利用訊號強度比例，並配合文獻比對可整理出混合物之重複訊號如下頁表格。最後比對文獻得知此混合物結構為自然界常見混合形式存在 β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside and β-Stigma sterol 3-O -β-D-glucopyranoside 57。. 76.

(90) Table 14 13C NMR Chemical shifts of compound 13, 14 ( δva l ue s ,i n Pyridine-d5) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29. 13. δ(13C). 14. Position δ(13C) Glu 1' 2' 3' 4' 5' 6'. 37.5 30.3 78.2 39.4 141.0 121.9 32.2 32.1 50.4 37.0 21.4 40.0 42.6 56.9 24.6 28.6 56.3 12.0. 39.9 42.4 57.0 24.6* 29.4 56.1 12.2* 19.3. 36.5 19.1 34.3 26.5 46.1 29.6 19.5. 40.9 21.5 138.9 129.6 51.5 32.2 21.4 20.5. 23.5 12.2*. 25.7 12.6. *：重合碳譜訊號. 77. 102.6 75.4 78.7 71.7 78.5 62.9.

(91) Table 15 1H Chemical shifts of compound 13, 14 ( δva l ue s ,i nPyridine-d5, J in Hz) Position 3 4a 4b Me-18 Me-19 Me-21 Me-26 Me-27 Me-29 Glu 1' 2' 3' 4' 5' 6'a 6'b. 13. 1 δ ( H) mult (J, Hz). 14. 3.96 m 2.47 m 2.72 m 0.65 (3H, s). 0.66 (3H, s) 0.92 (3H, s). 0.99 (3H, d, 6.5 Hz) overlapped overlapped overlapped. 1.07 (3H, d, 6.5 Hz) overlapped overlapped overlapped 5.05 (d, 7.7 Hz) 4.06 (t, 8.0 Hz) 4.30 m 4.27 m 3.95 m 4.56 (dd, 11.7 Hz, 2.0 Hz) 4.41 (dd, 11.7 Hz, 5.2 Hz). 78.

(92) 5.21 0.94. 0.66 0.65. 3.96 HO 4.41 4.56 4.27 HO HO. O 3.95 4.06 OH. O 5.05. 2.72 2.47. 5.34. 4.30. Fig. 53 1H-NMR spectrum of compound 13, 14 (Pyridine-d5, 500 MHz) 79.

(93) 12.2 12.6. 19.1 21.5. 40.0 39.9 21.4. 12.0 12.2. 30.5. 37.0. 78.2. O. HO 62.9. 78.5. 71.7. HO HO. 37.5 141.0 O. 19.3 56.3 56.1 42.6 42.4. 50.4. 37.5. 34.3 36.5 138.9 40.9. 32.1. 56.9 57.0. 26.5 129.6. 28.6 29.4. 23.5 25.7 46.1 51.5. 29.6 32.2. 19.5 21.4. 20.5. 24.6 24.6. 32.2 121.9. 102.6 75.4 OH. 78.7. Fig. 54 13C-NMR spectrum of compound 13, 14. (Pyridine-d5, 125 MHz) 80.

(94) 化合物 15 (Soladulcine B) 之結構解析 H N. 21. 18. 19. 11. 23. 20 17. 27. O. 13. 1 10. OH O HO HO HO. 3. O O. OH 1'''' HO. O 1'' O. 1'''. OH. HO O. O. 5. O OH 1'. HO. HOHO. 化合物 15 為淺黃色無晶型粉末，比旋光度 [α]27D -61.3˚( c 1.0, Pyridine)。與 Dragendorff 試劑呈橘色反應，以 10 % H2SO4 噴灑加熱呈色，顏色由淡紅轉紫黑。 15 之氫譜 (Pyridine-d5, 500 MHz) 顯示有二個單峰甲基，分別為 δ H 0.85 (3H, s) 以及 δ H 0.62 (3H, s)，以及二個雙重峰甲基 δ H 0.79 (3H, d, J = 5.2 Hz)以及 δ H 1.09 (3H, d, J = 7.3 Hz)，符合 spirostanol 骨架化學位移特徵，另在 δ H 2.78 (2H, m) 有兩氫吸收，綜合 Dragendorff 試劑呈色及其氫訊號傾向低場的程度，可推斷為鄰異原子氮上的氫。另外在偏低場區有四雙重峰質子吸收訊號，分別為 δ H 4.87 (1H, d, J = 7.6 Hz)、δ H 5.17 (1H, d, J = 7.9 Hz)、δ H 5.22 (1H, d, J = 7.9 Hz)以及 δ H 5.56 (1H, d, J = 7.5 Hz)，可推測此四雙重峰分別為四個糖基上的 anomeric 氫訊號。結合碳譜及 HSQC 可發現本化合物共有五十個碳訊號，其中有四個甲基碳訊號 δ C 12.3、δ C 15.7、δ C 16.8、δ C 19.6。十五個亞甲基 δ C 21.4、 81.

(95) δ C 29.0、δ C 30.0、δ C 31.0、δ C 32.5、δ C 32.5、δ C 34.6、δ C 34.9、δ C 37.2、 δ C 40.4、δ C 48.0、δ C 60.7、δ C 62.3、δ C 63.0、δ C 67.3。二十八個次甲基訊號 δ C 31.7、δ C 35.3、δ C 41.7、δ C 44.7、δ C 54.5、δ C 56.5、δ C 63.6、δ C 70.5、δ C 70.8、δ C 71.0、δ C 73.2、δ C 75.1、δ C 75.4、δ C 75.6、δ C 76.2、δ C 77.5、δ C 77.7、δ C 77.8、δ C 78.7、δ C 78.8、δ C 78.8、δ C 79.9、δ C 81.4、δ C 86.8、δ C 102.5、δ C 104.9、δ C 105.0、δ C 105.2，三個四級碳 δ C 35.9、δ C 41.0，δ C 98.4。訊號全部在 δ C110 以下，無雙鍵碳訊號，指出本化合物非糖基為 spirostanol 骨架。非糖基結構的碳除了 C-3、C-16 化學位移與糖基接近外，其餘碳均可經由文獻比對解析(Table 11)，並且以 HMBC 關聯氫訊號化學位移值確認。(Fig. 51)。經由 HMBC 上非糖基氫與接氧之碳原子之關聯訊號可推測出 C-3、C-16 接氧原子。觀察 HSQC 上 δ H 1.32, δ H 2.03 / δ C 30.0 (C-2)、δ H 1.34 , δ H 1.77 / δ C 34.9 (C-4) 可確認 C-2，C-4 上氫的化學位移，再以 HMBC 上 δ H 1.32 (H-2) / δ C 77.5、δ H 1.34, 1.77 (H-4) / δ C 77.5 可推定 δ C 77.5 為 C-3 訊號。觀察 HMQC 訊號 δ H 1.53, δ H 2.16 / δ C 32.5、δ H 1.79 m / δ C 63.6 可確認 C-15，C-17 上氫訊號，再以 δ H 1.53, δ H 2.16 (H-15) / δ C 78.7、δ H 1.79 (H-17) / δ C 78.7 可確認 δ C 79.1 為 C-16 之訊號。非糖基之碳化學位移可利用文獻比對確定該位置之立體架構 (Table 11)。扣除 C27 之標準 soladulcidine 骨架後剩餘 23 個碳，可推測為三個六碳糖及一個五碳. 82.