行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
藉表面電漿共振效應之顯微生物感測
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2736-L-110-001- 執行期間： 91 年 11 月 01 日至 92 年 10 月 31 日 執行單位： 國立中山大學物理學系(所) 計畫主持人： 高甫仁 報告類型： 精簡報告 報告附件： 國外研究心得報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 11 月 30 日
利用局部表面電漿共振效應的顯微生物反應偵測
Microscopic Bio-sensing based on Localized Surface Plasmon Resonance洪昕、高甫仁
Xin Hong and Fu-Jen Kao
國立中山大學光電所
Institute of Optoelectronics, National Sun Yat-Sen University, Kaohsiung 80424, Taiwan
中文摘要：
在這個計劃中，我們利用一特殊、基於局部表面電漿共振效應(Surface Plasmon Resonance, SPR)的奈米半球面型金粒子薄膜以行高空間解析度的生物感測。此奈 米金粒子薄膜獨特的光學性質，使得具有大數值孔徑的顯微物鏡的應用成為可 能，容許高空間解析度的生物反應感測。利用 SPR 效應的生物感測器可即時量 測兩種分子間的反應，不需以螢光染料或放射性同位元素做標定，如此特性可廣 泛利用於藥物反應和各種生物反應的偵測上，且可達成即時生物感測，同時提昇 空間解析度與靈敏度。這樣的應用顯示了奈米科技的發展與應用為生物反應偵測 器的發展展開了新的一頁。 Abstract：In this project we employ nanoparticle based gold films for high spatial resolution biosensing that relies on localized surface plasmon resonance. In contrast with
conventional planar SPR sensing film, the unique optical properties exhibited by these films allow biosensing with absorption spectroscopy and integration with high
numerical aperture optics. In addition, these sensors are able to detect bio-interactions in real-time without labeling. These characteristics greatly facilitate some highly significant applications, for example, in pharmaceutical researches. The developments and applications of these films also exemplify the potential utilization of
nanotechnology in bio-sensing.
關鍵字：奈米金粒子、表面電漿共振效應、生物反應偵測
Keywords: gold nanoparticle, surface plasmon resonance (SPR), biosensing
生命現象即是由眾多不同的生物反應所構成，一般而言，生物上之重要反應約有 如下數項:
1. 細胞對細胞之傳訊(Cell-to-Cell Signaling): legend/receptor 反應
2. 免疫系統(Immune System): 抗原-抗体反應(antigen-antibody interactions) 3. 基因之表現(Expression of Genes) : DNA/調制蛋白反應(DNA/regulator
protein interactions)
4. 新陳代謝(Metabolism): 酶的複合
5. 細胞分裂(Cell Division): DNA hybridization 檢測上述反應之方法可略分為
1. 標定(Labeling)偵測：
如螢光染料染色，並觀測螢光去極化(fluorescence depolarization)或螢光共 振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer)等現象。此法之特點為(a) 高靈敏度(b)使用方便。但螢光染色之標定偵測卻不免有以下之缺點：
1. 染色過程稍一不慎，即可能污染樣品。
2. 常發生非特定之染色與標定(non-specific labeling or staining)。 3. 在聚焦高強度雷射的照射下，螢光染料極易被光漂白。 4. 染料本身之毒性或化學活性可能影響活體樣品的狀態。 也因此，若能不藉染色而標定樣品將是一大進展。 2. 非標定偵測： 此方式一般藉觀測物理性質的變化以行反應偵測，這包括 SPR、石英晶体 檢測。特點為(a)可觀測動力學現象。(b)應用於未知分子的篩選。另一方 面，早在 1991 年(Jönsson et al)[1]，表面電漿共振效應(Surface Plasmon Resonance, SPR) 即已被利用來進行即時生物特定反應(real-time bio-specific interaction)之標定，並展現極高之應用潛力；特別在製藥工業 的研發上。按平均每一新藥之發展往往長達 12 年至 15 年，研發費用高達 數億美金。因此製藥公司莫不盡力尋找或發展各種科技或方法，期以降低 成本。植基於表面電漿共振效應(SPR)的生物感測器或探測晶片即可用於 製藥過程中不同之階段，不僅可增加產出(throughput)亦可大幅降低成本。 [2-7] 上述的偵測能力可用於 1. 藥物設計。 2. 抗原藥物之最佳化。 3. 尋找 DNA bonding 之調制蛋白。 4. 篩選 ligands of orphan receptors。 5. 重構蛋白酶複合物。
如圖一所示，在介電常數符號相反的兩種物質的介面（例如金屬和電介質）存在
一層表面電荷密度波（Surface Plasmon Wave, SPW），該 SPW 波在介面的電場最
強，在介面兩側隨著深度的增加成指數衰減。當入射光波和 SPW 滿足共振匹配 條件的時候，將產生表面電漿共振效應（SPR）。此時入射光波能量與 SPW 波產 生強烈藕合，並將能量傳遞給 SPW 波，且共振的 SPW 將吸收所有該入射波能 量而產生一種在特定角度光強度衰逝現象。 metal film prism sample evanescent wave SPW
incident beam reflected beam
metal film prism
sample
evanescent wave
SPW
incident beam reflected beam
圖一 傳統 SPR 原理圖 Kreschman 和 Otto 在 60 年代後期率先證實了可由漸逝全反射的光學方法 （ATR）激發表面電漿共振效應。該效應對周圍環境折射率的變化十分敏感，可 在無須對生物分子做任何標記的情況下，即時量測生物分子在固體/液體、固體/ 氣體介面發生交互作用時，所造成的介電常數的微小改變，從而即時分析生物分 子間的交互作用。正是由於這一光學特性，使得 SPR 技術得以成爲即時偵測生 物分子反應強有力的工具。過去十餘年以來，商用 SPR 生物感測器的引入，使 得 SPR 技術在生物/化學，醫學/製藥，農業/食品等領域得到了長足的發展和應 用。基於 Kreschman 的傳統的三菱鏡結構的 SPR 生物偵測器基本可分為角度型 和光譜型。角度型是以單色光入射，改變其入射角來量測其 SPR 共振效應；光 譜型則固定入射角度於全反射臨界角後，改變入射光束波長來量測其吸收光譜的 波長法。傳統的 SPR 生物偵測器，需要精確的角度控制機制（角度精準度要佳 於 0.0001 度）與溫度控制系統(變動小於 0.1 度)，因此通常體積較大。目前，較 重要之傳統 SPR 偵測儀相關廠商為下列五家，分別是：
1. Biacore AB (Uppsala, Sweden)，於 1990 推出第一台商用 SPR 儀器。 在 1998 及 1999 年，幾乎 90%之商用 SPR 生物感測器都是出自於 Biacore。Biacore 的儀器已成為公認之標準。
2. Affinity Sensors (Franklin, Massachusetts, USA)，Iasys 系列的儀器製 造商。其特點是利用以一比色容器(cuvette)和漸逝場(evanescent field) 作為 SPR 效應量測的方式。
利用流通容器(flow cell)或比色容器來量測 SPR 效應。
4. Nippon Laser & Electronics Lab, Hokkaido, Japan: SPR-Cellia system 5. Texas Instruments, Dallas, Texas, USA: Spreeta
二、奈米金粒子薄膜 另一方面，貴金屬奈米粒子（如金、銀、鉑等）的光學特性越來越受到關注。這 類金屬的奈米粒子在紫外－可見光波段展現出很強的光譜吸收，這是大體積 (bulk)金屬所沒有的光譜特性。如此吸收是由入射光子的頻率與導電電子的集合 振動(collective oscillation)共振所引起的，該效應稱之為局部表面電漿共振 （LSPR）。這些金屬粒子吸收譜的峰值吸收波長取決於粒子的大小、形狀、間距 和粒子本身及周圍環境的介電性質[12-14]。例如周圍環境折射率的變化則會引起 峰值吸收波長的移動。如圖二所示，教堂彩色玻璃之繽紛色彩即肇因於奈米金屬 粒子的光吸收與散射。這些粒子的吸收光譜與周遭折射係數之變化息息相關，即 是 Localized SPR 效應的結果，也是奈米粒子生物感測(Bio-sensing)所依賴之基礎 原理。 圖二、Localized SPR 效應簡介。 基本上 LSPR 效應偵測儀即為一反射吸收光譜儀。如前所述之生物反應若發生在 Polystyrene Spheres (110nm) Gold Particles Evaporated Gold Polymer Substrate Polystyrene Spheres (110nm) Gold Particles Evaporated Gold Polymer Substrate Polystyrene Spheres (110nm) Gold Particles Evaporated Gold Polymer Substrate Gold Particles Evaporated Gold Polymer Substrate 200 300 400 500 600 700 800 900 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 55nm 79nm 110nm 136nm 152nm Opt ica l D ens it y Wavelength (nm) 200 300 400 500 600 700 800 900 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 55nm 79nm 110nm 136nm 152nm Opt ica l D ens it y Wavelength (nm) 圖三、半球面形奈米金粒子膜。 圖四、半球面形奈米金粒子膜的光學特性。 彩色玻璃的顏色係來自嵌 於其中之細微金屬顆粒對 光之吸收或散射所造成。 金屬顆粒之吸收光譜取決於其 周圍之折射率， 這亦是生物感 測(biosensing)之基礎原理。 吸附之金粒子
鍍金的薄膜上，將會改變薄膜對光的吸收光譜。一般而言，LSPR 偵測儀使用波 長範圍在 400-700 nm 的光源。基此原理的 LSPR 光譜型生物反應偵測器正向著 小型化、攜帶型、光纖式、顯微式、高靈敏度等方向發展。如圖三所示，通過化 學的自排列單層膜（self-assembly membrane, SAM）技術，將聚氯乙烯
（polystyrene）奈米球排列成單層膜，然後在其上鍍上一定厚度的金膜，便形成 半球面形的奈米金粒子膜[15]。它的光學密度（O.D.）譜如圖四所示，可見峰值 吸收波長隨著粒子顆粒的增大發生紅移。圖五顯示了大入射角度對於峰值吸收波 長的影響。利用顯微物鏡進行量測，可見隨著顯微物鏡數值孔徑的增大，峰值吸 收波長紅移。半球面形金粒子膜可在大入射角的範圍內激發 LSPR 效應，即該 薄膜對入射角度不敏感，正是這一特點使得高數值孔徑顯微物鏡的使用成為可 能，從而實現高空間解析度的偵測。 三、顯微 LSPR 生物偵測系統 圖六所示為我們架設在顯微鏡(Olympus BX-50) 上的基於半球面形奈米金粒子 膜的生物反應偵測器。白光光源（LS-1, Ocean Optics）通過光纖耦合到準直物鏡 (collimation objective)，經過分光鏡轉向後，由顯微物鏡 2(Objective 2)會聚到待 測樣品上。物鏡 2 同時用來收集反射光譜，經物鏡 3(Objective 3)會聚到光纖上， 最後耦合到光譜儀（USB2000, Ocean Optics）。當生物/化學反應發生在金粒子膜 表面時，金粒子周圍的介電常數發生變化，從而峰值吸收波長將產生移動。為此， 通過監測吸收譜的峰值吸收波長來實現生物反應的即時量測。
大量的實驗結果表明 pseudo-Voigt 函數可精確地擬和半球面形金粒子膜的 吸收譜，其他函數如 Lorentzian, Gaussian 或者 Voigt 都沒有達到理想的擬和效果。
(
)
− − × − + + − + + = 2 2 2 2 exp 4ln2 2 ln 4 ) 1 ( 4 2 ) ( G c G L c L m m C B A f ω λ λ πω ω λ λ ω π λ λ µ µ （1）這裏，A, B, C 是偏移量和縮放係數, mu是平衡 Lorentzian 和 Gaussian 的權重因
數，λc 是中心波長。ωL and ωG 分別是 Lorentzian and Gaussian 帶寬。通過
Lev-Mar 非線性擬和演算法擬和λc實現峰值吸收波長的即時量測。
四、Streptavidin 和 anti-strepavidin 結合反應的即時量測
Streptavidin 為一 60,000 分子量的蛋白質，由 4 個相同的 subunits 組成。其相對 的抗體 anti-streptavidin 可藉由山羊體內的免疫反應生成。Anti-streptavidin 可用 來 固 定 streptavidin 或 放 大 由 streptavidin conjugates 產 生 的 信 號 (http://www.vectorlabs.com)。兩者結合反應的量測如圖七所示。(a) 0.1M 的 PBS 緩 衝溶液(buffer)首先加入到奈米金粒子膜上得到基線（baseline），(b)然後加入 10µl 濃度為 1mg/ml 的 streptavidin，2.5 nm 的光譜移動意味著 streptavidin 分子吸附到 金粒子的表面。(c)注入 PBS buffer 清洗掉多餘的未吸附的 streptavidin 分子後， (d)加入 10μl 濃度為 1mg/ml 的 anti-strepavidin。大約 5nm 的快速曲線上升，是 兩者結合反應的結果。反應趨於飽和後，(e)注入 PBS buffer 進行清洗後加入 (f)10mg/ml 的 NaOH, 快速的曲線下降顯示兩者的分解。以上的過程可以多次重 複。 五、結語 應用SPR偵測的廠商或研究團隊已不勝枚舉，預期與製藥或生技相關之研發，將 構成最大之使用群。廣義而言，針對生物反應偵測的發展正方興未艾，而奈米材 圖七、Streptavidin 和 anti-strepavidin 結合反應的即時
料與科技的應用恰是如此發展極佳之推手，應用奈米金粒子之局部SPR效應以行 生物感測，可謂是結合奈米科技與生物科技中極佳的範例之一。
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