豬泡疹病毒一型基因體重組機制之研究(2/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

豬泡疹病毒一型基因體重組機制之研究(2/2)

中 華 民 國 92 年 10 月 29 日

中 文 摘 要

在筆者以往的研究中，證實豬 疹病毒一型（suid herpesvirus 1, SHV-1）去 氧核糖核酸分解 （deoxyribonuclease；DNase）具有類似 RecBCD 的切割活性， 同時定義出 SHV-1 DNase 負責酵素活性及 DNA 結合能力的功能區和關鍵胺基 酸，其次也發現 SHV-1 DNA 結合蛋白質（DNA-binding protein, DBP）具有類似 RecA 促進同源 DNA 配對及兩股交換的能力，這些結果顯示 疹病毒基因體的 重組機制可能是以類似於大腸桿菌 RecBCD pathway 的重組機制進行。因此，本 計畫藉由試管內及細胞內重組模式的建立，探究 DBP 及 DNase 在 疹病毒基因 體重組及複製現象上所扮演的角色。本計畫已完成下列三部分實驗：（一）分析 SHV-1 DBP 及 DNase 在重組過程中參與的角色。我們已建立 helix unwinding 及 homologous pairing 的試管內模式，並發現 DBP 確實具有 helix unwinding 及 homologous paring 這兩項功能，此外，這兩項能力會隨濃度增加而上升。在最佳 反應條件的測試下，發現 SHV-1 DBP 進行 homolo gous pairing 的最佳反應條件為 80 mM NaCl、20 mM MgCl2、pH 7.0~7.8，且過程中不需 ATP 的存在。至於 helix

unwinding 方面，SHV-1 DBP 進行 helix unwinding 時需要鎂離子的存在，但不需 NaCl 與 ATP。進一步探討 DBP 對 DNase 功能的影響，發現 DBP 會促進 DNase 核酸外切 的活性，而且 DBP 是否具有結合 DNA 的能力，與是否會影響 DNase 的活性有關。（二）SHV-1 基因體細胞內重組模式的建立及分析。我們已建立細 胞內重組模式，並證實在單純 疹病毒一型及 SHV-1 感染後，可以成功地啟動 重組的進行，顯示 SHV-1 可辨認來自於單純 疹病毒一型的a 序列，誘發重組

的發生。（三）SHV-1 基因體重組複合物的分析。我們已利用 Biotinylated-ELISA 與 yeast two-hybrid system 求證 DNase 與 DBP 之間是否有直接作用。這兩項實驗 都得到正面的結果，顯示 DBP 確實會與 DNase 產生 physical interaction。因此， SHV-1 DBP 與 DNase會互相作用，以影響彼此的作用。在未來，由對SHV-1 DNase 及 DBP 在病毒重組的角色及功能上的了解，可使研究者對 疹病毒的重組現象 有更合理的推論及解釋，進而提供研究者從中尋求控制的方法。

Abstract

The suid herpesvirus 1 (SHV-1) DNase is an alkaline exonuclease and endonuclease, which exhibits an Escherichia coli RecBCD-like catalytic function. The SHV-1 DNA-binding protein (DBP) promotes the renaturation of complementary single strands of DNA, which is an essential function for recombinase. To investigate the functional and physical interactions between SHV-1 DBP and DNase, these proteins were purified to homogeneity. SHV-1 DBP stimulated the DNase activity, especially the exonuclease activity, in a dose-dependent fashion. Acetylation of DBP by acetic anhydride resulted in a loss of DNA-binding ability and a 60% inhibition on the DNase activity, suggested that DNA-binding ability of SHV-1 DBP was required for stimulating the DNase activity. SHV-1 DNase behaved in a processive mode; however, it was converted into a distributive mode in the presence of DBP, implied that SHV-1 DBP stimulated the dissociation of DNase from DNA substrates. The physical interaction between DBP and DNase was further analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay, and a significant interaction was observed. Thus, these results suggested that SHV-1 DBP interacted with SHV-1 DNase and regulated the DNase activity in vitro.

目 錄 中文摘要---I 英文摘要---II 前言---1 研究目的---2 文獻探討---3 研究方法---7 結果與討論---10 參考文獻---13 計畫成果自評---19 圖表---20

前 言

豬 疹 病 毒 一 型 （ suid herpesvirus 1, SHV-1 ）， 隸 屬 於 疹 病 毒 科 （Herpesviridae）、阿爾伐 疹 病 毒 亞 科 （Alphaherpesvirinae ）、水痘病毒屬

（Varicellavirus），為假性狂犬病（pseudorabies）的致病原（Roizman, 1996）。與

SHV-1同亞科的病毒，包括單純 疹病毒一型、二型（ herpes simplex virus 1、2）、 帶狀 疹病毒（varicella- zoster virus）、馬 疹病毒一型（equine herpesvirus 1）、 牛 疹病毒一型（bovine herpesvirus 1）等（Roizman, 1996）。這些阿爾伐 疹病 毒之間，在基因的種類、基因在基因體上的排列位置、基因的轉錄調節，以及病 毒DNA的複製機制都極為相似（Ben-Porat et al., 1983），因此筆者以SHV-1為模 式，研究阿爾伐 疹病毒核酸重組與複製現象的機轉及參與的蛋白質。

研 究 目 的

在筆者以往的研究中，證實SHV-1去氧核糖核酸分解 （deoxyribonuclease, DNase）具有類似RecBCD的切割活性（ Hsiang et al., 1998），隨後也定義出SHV-1 DNase負責酵素活性及DNA結合能力的功能區和關鍵胺基酸（Ho et al., 2000）， 同時也證實SHV-1 DNA結合蛋白質（DNA-binding protein, DBP）具有類似RecA 促進同源DNA配對及兩股交換的能力（Wu et al., 1998）。這些初步的結果顯示發 生在 疹病毒基因體的重組機制，可能是以類似於大腸桿菌RecBCD pathway的 重組機制進行。因此，本計畫擬藉由試管內及細胞內重組模式的建立，探究DBP 及DNase在 疹病毒基因體重組及複製現象上所扮演的角色。

文 獻 探 討

豬 疹 病 毒 一 型 （ suid herpesvirus 1, SHV-1 ）， 隸 屬 於 疹 病 毒 科 （Herpesviridae）、阿爾伐 疹 病 毒 亞 科 （Alphaherpesvirinae ）、水痘病毒屬

（Varicellavirus），為假性狂犬病（pseudorabies）的致病原（Roizman, 1996）。與

SHV-1同亞科的病毒，包括單純 疹病毒一型、二型（ herpes simplex virus 1、2）、 帶狀 疹病毒（varicella- zoster virus）、馬 疹病毒一型（equine herpesvirus 1）、 牛 疹病毒一型（bovine herpesvirus 1）等（Roizman, 1996）。這些阿爾伐 疹病 毒之間，在基因的種類、基因在基因體上的排列位置、基因的轉錄調節，以及病 毒DNA的複製機制都極為相似（Ben-Porat et al., 1983），因此筆者以SHV-1為模 式，研究阿爾伐 疹病毒核酸重組與複製現象的機轉及參與的蛋白質。在筆者以 往的研究中，證實SHV-1去氧核糖核酸分解 （deoxyribonuclease, DNase）具有 類似RecBCD的切割活性（Hsiang et al., 1998），隨後也定義出SHV-1 DNase負責 酵素活性及DNA結合能力的功能區和關鍵胺基酸（Ho et al., 2000）。同時也證實 SHV-1 DNA結合蛋白質（DNA-binding protein, DBP）具有類似RecA促進同源 DNA配對及兩股交換的能力（Wu et al., 1998；Ho et al., unpublished），這些初步

的結果顯示發生在 疹病毒基因體的重組機制，可能是以類似於大腸桿菌 RecBCD pathway的重組機制進行。因此，本計畫擬藉由試管內及細胞內重組模 式的建立，探究DBP及DNase在 疹病毒基因體重組及複製現象上所扮演的角 色。 基因重組是一個生物基本且必要的過程，所有生物體皆需依賴基因重組來 產生遺傳物質的多樣性、修復由外生性或內因性所造成損傷之 DNA 及確保在減 數分裂時同源染色體能做適當分離並維持染色體的完整性。而重組所造成遺傳物 質的交換，不僅發生在動、植物身上，在原核生物、病毒、質體甚至粒線體 DNA 均會發生。基本上，重組可分為非同源性重組及同源性重組，非同源性重組是指 不 同 源 的 DNA 產 生 的 重 組 行 為 ， 如 ： bacteriophage λ 的 site-specific recombination，為在 lysogenic cycle 時，使噬菌體 DNA 嵌入宿主 DNA 的一個主 要行為（Landy, 1989），或是在真核生物中，當末端 DNA 發生斷裂時，所利用 的 non-homologous end-joining 來修復 DNA（Paques and Haber, 1999）。而同源性 重組，目前在大腸桿菌的 RecBCD pathway 已被明確的證實，因此在探討其他物 種之重組機制時均以此作為模版。例如在真核生物方面，酵母菌與人類的重組蛋 白質已被證明與細菌的重組蛋白質具有同源性，如：酵母菌的 Rad51、人類的 hRad51 與大腸桿菌的 RecA 在 DNA 序列上及功能上具同源性（Aboussekhra et al., 1992；Basile et al., 1992；Shinohara et al., 1992；Ogawa et al., 1995；Park, 1995）。 目前認為，真核細胞之重組的起始，是在 DNA 上造成了一個雙股 DNA 斷 裂（double strand break, DSB）（Orr-Weaver et al., 1981；Resnisk and Martin, 1976） ，而使重組蛋白可以在 DSB 處開始進行重組。DSB 是時常發生的現象， 例如當細胞暴露在 DNA-damaging agents（e.g. ionizing radiation）、複製叉的突然

停止（Paques and Haber, 1999）、或是細胞遭遇到減數分裂欲發生重組時，會有 DSB 的發生。倘若 DSB 不修復，將會造成突變、基因移位及癌症，而同源染色 體的重組即是 DSB 的一個重要的修復方法。DSB 這重要的重組起點在原核生物 的大腸桿菌也是相同的，在 RecBCD enzyme 存在下，發生重組的機率在 DSB 處 高達 99%（Kowalczykowski and Eggleston., 1994；Arnold and Kowalczykowski, 1999），所以當 DSB 形成後，便正式展開重組。重組的機制可簡單的分為三個步 驟：在 presynaptic phase 時，是由 DSB 的產生而開始的。在 DSB 的末端會有核 酸分解 結合在上面，造成 5'→3'的水解而裸露出 3'端單股的 DNA（asymmetric nuclease activity）（Kowalczykowski, 2000）。之後進入 synaptic phase，由一個單 股 DNA 結合蛋白質結合在 3'端單股的 DNA 上，協助將單股 DNA 插入到同源 DNA 處（Kowalczykowski, 2000），形成 D-loop 的結構，即 Holliday junction structure。最後為 postsynaptic phase，Holliday junction structure 是一個四股 DNA 的結構，為重組過程的一個中間產物，可由 resolvasome complex(RuvA、RuvB and RuvC) 進行 branch migration 及 resolution（Hoess et al., 1987；Kitt and Nash, 1987；Nunes-Duby et al., 1987；Dressler and Potter, 1982；Kowalczykowski, 2000）， 以完成重組過程。

本計畫主要藉助試管內及細胞內重組模式的建立，尤其是 presynaptic phase 到 synaptic phase 的階段，探討 DNase 及 DBP 參與的角色。以大腸桿菌為例，參 與大腸桿菌重組的因子有χ site、single-stranded DNA-binding protein (SSB)、 RecA、RecBCD、RecE、RecF、RecG、RecJ、RecN、RecO、RecQ 等十餘種， 但對於重組最重要的因子為 RecA、RecBCD、SSB 和χsite。RecBCD 為一個 heterotrimer，由recB、recC、recD 基因的產物組成（Amundsen et al., 2000），是 一個多功能的酵素，具 3'→5'及 5'→3'外核酸分解 活性，可專一的辨認 DSB， 並緊密的結合在 dsDNA 的末端（Roman and Kowalczykowski, 1989a）。RecBCD 為負責重組起始的蛋白質，當辨認到χsite 時，會產生不對稱的核酸分解 活性， 且具單向雙股 DNA 解旋功能（ Telander-Muskavitch and Linn, 1981；Smith, 1988； Taylor, 1988）。RecA 為單股 DNA 結合蛋白，具同源 DNA 配對的功能且會促進 兩股的交換並形成 Holliday junction structure（Kowalczykowski and Eggleston, 1994；Roca and Cox, 1997；Bianco and Kowalczykowski, 1999）。在 ATP 存在下， RecA 會結合在單股 DNA 處，使被結合的那股插入到另一雙股 DNA 的同源區， 而產生 D-loop（Flory et al., 1984）。 當 疹病毒基因體經rolling circle模式複製、產生頭尾相連的concatemer的同 時，會發生高頻率的重組現象（Dutch et al., 1992）。基因體重組現象的發生在 疹病毒是相當常見的。在Kintner等（1995）的研究中，他們將兩株不具毒力的單 純 疹病毒一型同時進行角膜接種，之後再自三叉神經節中進行病毒分離，結果 發現74﹪的分離株都是重組株，而Nishiyama等（1991）發現單純 疹病毒一型 的重組株可能會有毒力增強的現象發生。另外在Glazenburg等（1994）的研究中 也發現，SHV-1突變株在接種到羊及豬之後，都有重組現象的發生。當 疹病毒

DNA複製時，其重組機率可增加高達十倍以上（Dutch et al., 1995；Weber et al., 1988），而且若病毒感染的細胞發生DSB，則會刺激重組的產生（Sarisky and Weber,

1994）。 疹病毒基因體發生高頻率重組現象的特性，對於臨床上，尤其是基因 工程減毒疫苗及基因治療病毒載體的使用上，會造成相當大的困擾及困難。因為 經過不同病毒株分子間或是分子內的重組作用，都有可能會發生基因置換的現 象，而使得不具毒力的疫苗株回復其毒力、增加抗原的變異性、或是 疹病毒載 體回復其致病性，而對患者造成危險性。因此，本計畫擬探討 疹病毒基因體重 組現象的機制、發生的時序性及參與的蛋白質，以便由對重組作用的了解，從中 尋求控制的方法。 在筆者以往的研究中證實，SHV-1 DNase 具有內核酸分解 、5'外核酸分解 及 3'外核酸分解 的活性，單股及雙股 DNA 都可以作為受質（Hsiang et al., 1998），此外利用一連串的系列缺損突變株及定點突變株，也定義出 SHV-1 DNase 負責酵素活性及 DNA 結合能力的功能區和關鍵胺基酸（ Ho et al., 2000）。若是將 SHV-1 DNase 與其它核酸分解 的受質及切割模式作一比較，可以發現 SHV-1 DNase 的切割活性與大腸桿菌的 RecBCD 及Neurospora crassa endo-exonuclease 相似，這兩種酵素都已被證實與重組作用有關（ Fraser et al., 1989；Smith, 1988）。 大腸桿菌 RecBCD 所主導的重組機制已被研究得很詳細（ Taylor et al., 1985），首 先 RecBCD 在接近χsite 時會對雙股 DNA 的一股進行切割及解旋而產生單股

DNA 的尾端，之後 RecA 會與單股 DNA 的尾端結合，形成 D- loop，而進行同源 性 DNA 的交換作用。在筆者的研究中證實 SHV-1 DNase 具有類似 RecBCD 的切 割活性（ Hsiang et al., 1998），同時也證實 SHV-1 DNA 結合蛋白質（ DNA-binding protein, DBP）具有類似 RecA 促進同源 DNA 配對及兩股交換的能力（Wu et al., 1998；Ho et al., unpublished），這些初步的結果顯示發生在 疹病毒基因體的重 組機制，可能是以類似於大腸桿菌 RecBCD pathway 的重組機制進行，其中 DBP 類似於 RecA，而 DNase 類似於 RecBCD 的角色。雖然如此，可能仍有其它蛋白 質也參與 疹病毒的重組作用，因為單純 疹病毒複製及重組的發生在時序及功 能上都有關連（Dutch et al., 1992），因此負責複製的蛋白質可能也參與重組反 應。所以，更進一步對 SHV-1 基因重組複合體的研究，將有助於了解病毒基因 體重組作用與複製發生的時序性及機制。

單純 疹病毒的 DBP，又名 infected-cell polypeptide 8（ICP8）或單股 DNA 結合蛋白質（ single-stranded DNA-binding protein）（Honess and Roizman, 1974）， 為 UL29 的基因產物（Weller et al., 1983）。DBP 最早是由 Bayliss 等（1975）以 DNA 親合性色層分析法，自病毒感染的細胞中分離出來。Littler 等（1981）及 Yeo 等（1981）利用胰蛋白 分解法及免疫沉澱法證實 疹病毒（包括單純 疹 病毒、馬 疹病毒、牛 疹病毒等）的 DBP 具有相似的抗原性及胺基酸序列。 由缺損 DBP 基因的單純 疹病毒突變株無法進行病毒 DNA 的複製顯示，DBP 為病毒複製所必須（Littler et al., 1983），此外 DBP 也是單純 疹病毒在 DNA 複 製時，主要的 DNA 結合蛋白，因此可以用它為標的，偵測細胞核內複製區間的

構造（Quinlan et al., 1984）。當單純 疹病毒的 DNA 開始進行複製前，DBP 是 分布在核內被稱為前複製區（prereplication sites）的區域，吸引其他參與 DNA 複製的蛋白，尤其是 DNA 聚合 ，進入到前複製區，並加以組織，為 DNA 複 製作準備（ Bush et al., 1991）。此外， DBP 可以藉由刺激 DNA 聚 合 、 helicase-primase complex 及起點結合蛋白質（origin-binding protein）的活性，而 促進病毒 DNA 的複製（Boehmer, 1998；LeGac et al., 1998；Lee and Lehman, 1999）。另外，DBP 也被發現可以降低寡核 酸的黏合溫度及促進兩個互補的單 股 DNA 重新黏合回來，顯示 DBP 可能與單純 疹病毒基因體的重組有關（Dutch and Lehman, 1993）。綜合這些研究指出，單純 疹病毒 DBP 應該類似大腸桿菌 的單股 DNA 結合蛋白質及噬菌體 T4 gene 32 蛋白，為一種典型的單股 DNA 結 合蛋白質（Chase and Williams, 1986）。在生物功能方面，單純 疹病毒 DBP 除 了為病毒複製所必須外，也參與病毒基因表現的調節，使晚期基因的表現量下降 （Chen and Knipe, 1996）。因此 Costa 等（1997）利用這些特性，進行單純 疹 病毒 DBP 缺損株的構築，同時將這種複製缺損株應用在疫苗的使用上。他們發 現，這種缺損株無法進行 DNA 的合成，所以在送到宿主體內後無法產生子代病 毒，但是卻可以表現與野外株等量的晚期蛋白質。進一步經由動物試驗，也證明 這種 DBP 缺損株可以成功地保護小白鼠免於受到單純 疹病毒的攻擊。由這些 結果，可以提供研究者對於單純 疹病毒 DBP 在應用方面的另一種思考方向。 除了單純 疹病毒外，帶狀 疹病毒、馬 疹病毒一型、牛 疹病毒一型

及人類巨細胞病毒等的 DBP 也陸續被證實（ Anders et al., 1986; Bell and Whalley, 1993; Davison and Scott, 1986; Hammerschmidt et al., 1988）。筆者在以往的研究 中，藉由 subtractive cDNA 基因庫的建立，定位出 SHV-1 DBP 的位置（ Ho et al., 1996a），進一步完成 SHV-1 DBP 的定序、表現及功能分析（ Wu et al., 1998）。由 這些 疹病毒及其它物種（包括大腸桿菌、噬菌體 T4、腺病毒）DBP 的胺基酸 序列比較中，可以發現這些 DBP 都含有一段具保留性的鹼性及環狀胺基酸（Wang and Hall, 1990），其中噬菌體 T4 及大腸桿菌的 tryptophan 及 tyrosine、腺病毒的 phenylalanine 及 lysine 為參與 DNA 結合的關鍵胺基酸（Doan et al., 1984; Khamis et al., 1987; Neale and Kitchingman, 1990）。至於 SHV-1 DBP 的功能區及關鍵胺基

酸種類是否也如推測的結果呢？除了參與 疹病毒複製上的角色外，DBP 是否

研 究 方 法

一、分析 SHV-1 DBP 及 DNase 在重組過程中參與的角色 （一）Homologous-pairing assay

將 pUC18 以EcoR Ⅰ切成線形當作受質，取 0.5 μg 的線形 DNA 於 100

℃變性成單股後立刻置於冰上，加入反應緩衝液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]， 5 mM DTT，10% Glycerol，0.05 μg/μl BSA）以及 10 pmol 的 DBP，其總 反應體積為 20 μl，混合均勻後，在 37℃下作用 5 分鐘，接著加入 2 μl 的 0.1 μg/μl protease K 於 37℃下作用 10 分鐘，以 stop solution（1.2% SDS， 2% Glycerol，0.05% Bromophenol blue）終止反應，以 1.5%瓊脂糖膠體進行 電泳，經定量分析，其同源性配對能力的計算方式為 ssDNA/dsDNA + ssDNA）。

（二）Helix- unwinding assay

將 M13 forward primer 之 5'端標記32

P 當探針，取 1 pmol 的探針與 0.25 pmol 的 M13 ssDNA 在 TES buffer（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM EDTA， 0.1 M NaCl）下總體積為 20μl，於 65℃反應 10 分鐘，待冷卻至 35℃以下， 使探針與 M13 ssDNA 雜合，接著用 centriflexT M

gel filtration 750 xg 2 分鐘移 除未黏合的探針，儲存於-20℃。將 0.0125 pmol 的雜合 DNA 加入 10 pmo l DBP 與緩衝液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5] ，5 mM DTT，10% Glycerol，0.1 μg/ μl BSA），總反應體積為 20 μl，在 37℃下反應 30 分鐘後，再加入 2 μl 的 0.1 μg/μl protease K 於 37℃下作用 10 分鐘，以 stop solution（18 mM EDTA [pH 8.0]，1.2 % SDS，6% Glycerol，0.05% Bromophenol blue）終止反應，以 1.0%瓊脂糖膠體進行電泳，經烘乾壓片後分析。

（三）離胺酸（Lysine）化學修飾法

將 0.5 ml 純化的 DBP 與等體積的飽和醋酸鈉（saturated sodium acetate） （15 M）混和，加入 10 μl 的無水醋酸（acetic anhydride）在 4℃反應 30 分 鐘，均分為五管，每管分別再加入第二次不同莫爾比（molar ratio）的無水醋 酸反應 30 分鐘（mol acetic anhydride/mol DBP = 0/1、5/1、10/1、20/1、50/1）， 以硝基纖維濾紙結合試驗分析。

（四）硝基纖維濾紙結合試驗（nitrocellulose filter binding assay）

取 10 pmol SHV-1 DBP 野生株或缺損株與 0.05 μg 以 nick translation 標記35

S 的 pUC18 單股線狀 DNA（Koch 1986；Rigby 1977）於 DNA 結合緩 衝液（20 mM Tris-HCl [pH 7.6]，1 mM EDTA，125 mM NaCl，1 mM DTT，5 ﹪Glycerol）中，總反應體積為 20 μl，在 25℃作用 20 分鐘，將反應混合物 滴至以 0.5 M KOH 處理過的硝基纖維濾紙上，以 DNA-binding buffer A（10 mM Tris HCl [pH 7.5]，1 mM EDTA，150 mM NaCl）沖洗 4 次，待乾後，利 用液態閃爍計數儀測定其 CPM 值。

將 0.5 μg 環形 pUC18 以EcoRⅠ切割成線型 pUC18 作為內切 與外切

的受質，加入純化的 DNase 與 DBP，在 DNase 緩衝液（50 mM Tris-HCl [pH9.0]，2 mM MgCl2，10 mM 2-Mercaptoethanol）下 37℃反應 5 分鐘，其總

反應體積為 10 μl，最後以 40﹪sucrose 與 Bromophenol blue 來終止反應，以 1.2 ﹪瓊脂糖膠體電泳分析。

（六）DNase processive mode 測試 利用標記35

S 的 DNA（hot DNA）與未標記的 DNA（cold DNA）當作 受質參與反應。首先將1 pmol DNase 與 hot DNA反應於 37℃ 2 分鐘，使 DNase 充分站在 DNA 上後，再加入 50 倍的 cold DNA，其總反應體積為 100 μl， 反應數分鐘後，利用 100 μl 的 5﹪TCA（trichloroacetic acid）與 10 μl 的 5 mg/ml BSA 在冰上反應 10 分鐘後，以 12000 xg 10 分鐘將大片段的 DNA 沉 澱下來，而被水解的 DNA 會懸浮於上清液中，此時將上清液取出以液態閃 爍計數儀分析結果。 二、SHV-1 基因體細胞內重組模式的建立及分析 （一）受質的構築 細胞內重組模式所使用之受質為具有a 序列之質體 DNA。其中 a 序列的 選殖方法為在病毒感染下，產生頭尾相連的基因體形式後，再利用聚合 連 鎖反應，增殖a 序列。之後在 a 序列兩端連結 BamHI linker，架接進入 pRD107 中，以形成重組用質體 pRD105。pRD105 的結構見圖一。 （二）細胞內重組模式的建立 細胞內重組模式參考自 Dutch 等（1995）的方法。將上述 pRD105 送入 細胞中，以病毒感染後，抽取細胞內的質體 DNA，再送入E. coli 中，最後將 E. coli 塗抹於 X-gal agar 上，藉由計算藍白菌落的數量，以評估重組的效率。

pRD105 上含有兩個同方向的 a 序列，兩個 a 序列中含有一個完整的 lacZ 基 因作為 reporter，當重組發生時，會產生兩個新的質體形式，其中一個具有lacZ

基因但無複製起點ori，另一個不具 lacZ 基因但具有複製起點 ori（見圖一），

因此在送入E. coli 中，只有後者可以成功的複製，且在 X-gal agar 上出現白

色菌落。所以，當重組發生時，白色菌落數會顯著的增加，而我們可藉由計 算藍白菌落的數量，以評估重組的效率。 （三）重組過程與病毒感染的關連 為了探究病毒感染時是否會增加重組的發生，我們將 pRD105 送入細胞 後，再將細胞感染病毒，最後收集細胞內質體 DNA，利用上述方法計算重組 的發生率。 三、SHV-1 基因體重組複合物的分析 （ 一 ） 生 物 素 標 記 結 合 免 疫 吸 附 試 驗 （ Biotinylated enzyme-linked immunosorbent assay；Biotinylated-ELISA）

將 DNase 透析保存在 PBS 溶液中，取 20 倍 DNase 莫爾數比的生物素 （Sulfo-NHS-biotin）（1 μg/μl）加入 DNase 中，放置在冰上兩小時，以 centricon-10 在 2000 xg 離心 20 分鐘兩次，去除未結合的生物素，保存於 4℃， 以此標記生物素之 DNase 進行 結合免疫吸附試驗。首先將 0.5 μg DBP 附 著在孔上，接著以 100 μl 0.5 ﹪脫脂奶粉滴入孔中在 37℃下反應 30 分鐘， 洗淨，甩乾，保存於-20℃，接著再加入標記生物素之 DNase 與附著在孔上的 DBP 反應，在 37℃下 60 分鐘後，洗淨、甩乾，加入標記過氧化 的抗生物 素（avidin）與生物素結合，以受質 ABTS 予以呈色，15 分鐘後測其波長 405 nm 之吸光值。

（二）Yeast two-hybrid system

將筆者以往所架構之 DBP基因，殖入酵母菌表現載體中，利用 yeast two-hybrid system，探究與DBP結合的蛋白質。這一套系統是利用酵母菌為表 現宿主，使用兩種融合蛋白質，分別是與GAL4 DNA-binding domain融合的X 蛋白質及與GAL4 activation domain融合的Y蛋白質，以報導基因的活化與 否，判定X及Y蛋白質是否具有關連性。因此在這個實驗中，我們擬以DBP 基因為X基因，以SHV-1感染細胞後所建立的基因庫為Y基因，進行基因的搜 尋，以便了解DBP可以與那一些蛋白質作用。

結 果 與 討 論

一、分析 SHV-1 DBP 及 DNase 在重組過程中參與的角色

在E. coli 重組過程中，RecA 會造成雙股 DNA 的不穩定，使局部雙股分開

（helix unwinding），而使其他同源單股 DNA 插入進行同源配對（homologous pairing），因此我們建立這兩項重組過程的試管內模式，探討 DBP 是否具有這兩 項功能。圖二顯示 DBP 確實具有 helix unwinding 及 homologous paring 這兩項功 能，此外，這兩項能力會隨濃度增加而上升。在最佳條件的測試下，發現 SHV-1 DBP 進行 homologous pairing 的最佳反應條件為 80 mM NaCl、20 mM MgCl2、pH

7.0~7.8，且過程中不需 ATP 的存在。至於 helix unwinding 方面，SHV-1 DBP 進 行 helix unwinding 時需要鎂離子的存在，但不需 NaCl 與 ATP。

由於 SHV-1 的 DBP 與 DNase 可能參與 SHV-1 的重組過程，本實驗利用不 同濃度之 DBP 探討對 DNase 活性之影響。SHV-1 DNase 具有核酸外切 及核酸 內切 的功能，首先探討 SHV-1 DBP 是否對 DNase 的不同功能上有專一性的影 響，在 DNA 受質方面以 pUC18 超螺旋 DNA 作為核酸內切 功能測試之受質，

EcoRⅠ切成線型的 pUC18 作為核酸外切 功能測試之受質，將 0.5 pmol 的

DNase、0.5 μg 超螺旋或線型 DNA 加入不同濃度的 DBP，在 37℃下反應 5 分 鐘，分別進行核酸內切 與外切 之功能分析。圖三 A 為核酸內切 ，三 B 為 核酸外切 的功能測試，DBP 的量依序為 0、1、5、10 pmol，以瓊脂糖膠體電 泳分析，經定量分析後，以 0.5 pmol DNase水解 DNA的量為 1 倍，結果顯示SHV-1 DBP 對 DNase 的核酸內切 活性並沒有顯著之影響，但對於 DNase 的核酸外切

表現出有促進之影響，活性增加至 3.27 倍。此實驗可明顯證明 SHV-1 DBP 可 專一性的促進 DNase 核酸外切 的活性比內切 高出 2.2 倍，故證實 DBP 會刺 激 DNase 核酸外切 的活性。

為了能顯著證實 DBP 對 DNase 核酸外切 的影響，在預行試驗時，已將 DNase 的量調整為 0.5 pmol 為進行 DNA 水解的閥值以下，表此濃度無法進行水 解。圖四 A 以單獨 0.5 pmol 的 DNase，圖四 B 0.5 pmol DNase 加上 10 pmol DBP， 以 0.5 μg 線型 pUC18 為受質，在 37℃反應 0、1、3、5、10、15 與 20 分鐘後 以電泳膠分析，經定量分析後，結果顯示當只有 DNase 時，水解 DNA 的量未有 所改變，但加入 DBP 後會顯著刺激 DNase 核酸外切 的活性，並證實 DBP 對 DNase 核酸外切 活性的動態影響會隨著反應時間增加而活性不斷上升，且未有 趨於緩和之現象。 SHV-1 DBP 為單股 DNA 結合蛋白質，而 DBP 會促進 DNase 之核酸外切 作用，所以我們進一步研究 DBP 之 DNA 結合功能與 DNase 之核酸外切 活性 有無關連。本項實驗是利用已喪失 DNA 結合功能之 DBP 與 DNase 做核酸外切 活性測試。將 SHV-1 DBP 以 acetic anhydrate 針對離胺酸進行化學修飾，結果 顯示當 DBP 在 5 倍莫爾比的無水醋酸修飾下損失約 90 ﹪的單股 DNA 結合功 能，且已達離胺酸被修飾的極限，故認為離胺酸對 DBP 之 DNA 結合能力有絕

對性的影響（圖五）。將 0.5 pmol DNase、0.05 μg 35

S 標記的線型 DNA、與 10 pmol 野生株 DBP 或已失去 DNA 結合能力之 DBP，於 37℃下作用 15 分鐘，切割下來 的 DNA 片段利用 TCA 沈澱後，經液態閃爍計數儀分析，以單獨 DNase 水解 DNA 反應的量為 1 倍，結果顯示加入野生株 DBP 的 DNase 水解 DNA 反應高達 5 倍， 但以 Lys- modified DBP 與 DNase 反應時其水解 DNA 的量降為 0.5 倍（圖六）。 因此此實驗證明當 DBP 失去 DNA 結合功能時，無法促進 DNase 核酸外切 的 功能，所以 DBP 的 DNA 結合能力對刺激 DNase 的核酸外切 的活性很重要。

進一步研究 DNase 在 DNA 上的移動模式，利用標記 35

S 與未標記的線型 pUC18 DNA 當作受質參與反應。首先將 DNase 與放射線標記的 hot DNA 反應於 37℃ 2 分鐘，使 DNase 充分站在 DNA 上，再加入 50 倍未標記的 cold DNA 做 競爭者，於 37℃反應數分鐘，被切割下來的 DNA 片段經 TCA 沈澱後，取上清 液利用液態閃爍計數儀分析被水解的 hot DNA，當 DNase 為 processive mode 時， 加入 50 倍 cold DNA 並不會改變其產生 CPM 值的速率，若為 nonprocessive mode，加入 50 倍 cold DNA 後 CPM 值速率會下降。在圖七 A 為測試 DNase 的 前進模式，2 分鐘後加入 cold DNA，反應時間為 0、2、5、10、20 分鐘，結果 顯示 cold DNA 加入後並沒有改變其速率，故證實 DNase 為 processive mode，圖 七 B 為 DNase、DBP 與 hot DNA 同時加入，2 分鐘後再加入 cold DNA，反應時 間為 0、2、10、20、40、60 分鐘，結果顯示在加入 50 倍 cold DNA 後 DNase 不 再水解 hot DNA，其水解速率下降，所以證實 DBP 會改變 DNase 的移動模式， 由 processive mode 變為 nonprocessive mode，而此行為會造成 DNase 對受質無法 一次水解完成，產生 DNA 斷端，因此推論此行為會造成高重組頻率的發生。 二、SHV-1 基因體細胞內重組模式的建立及分析

細胞內重組模式參考自 Dutch 等（1995）的方法。將 pRD105 送入 Vero 細 胞中，以 10 m.o.i.的病毒量感染細胞，於 8 小時後抽取細胞內的質體 DNA，再 送入E. coli 中，最後將 E. coli 塗抹於 X-gal agar 上，藉由計算藍白菌落的數量，

以評估重組的效率。pRD105 上含有兩個同方向的a 序列，兩個 a 序列中含有一

個完整的lacZ 基因作為 reporter，當重組發生時，會產生兩個新的質體形式，其

中一個具有 lacZ 基因但無複製起點 ori，另一個不具 lacZ 基因但具有複製起點 ori，因此在送入 E. coli 中，只有後者可以成功的複製，且在 X-gal agar 上出現白

色菌落。所以，當重組發生時，白色菌落數會顯著的增加，而我們可藉由計算藍 白菌落的數量，以評估重組的效率。由表一發現，單純 疹病毒一型如同 Dutch 等（1995）的結果一般，可以顯著地驅動重組的發生，而 SHV-1 也可以成功的 增加重組的機率，顯示 SHV-1 可辨認來自於單純 疹病毒一型的a 序列，誘發 重組的發生。 三、SHV-1 基因體重組複合物的分析 在 證 實 DBP 會 促 進 DNase 核 酸 外 切 的 功 能 後 ， 我 們 利 用

Biotinylated-ELISA 與 yeast two- hybrid system 求證 DNase 與 DBP 之間是否有直 接 作 用 。 在 biotinylated-ELISA 方 面 ， 首 先 將 Biotin 標 記 在 DNase 上 （biotinylated-DNase），充作為一次抗體，以過氧化 標記的 avidin 作為二次抗 體，來彌補先前 ELISA 過多蛋白質層的缺陷，圖八顯示，DNase 與 DBP 之間會 有直接的 physical interaction，且呈劑量反應作用。在 yeast two- hybrid system 方 面，也證實 DBP 確實會與 DNase 產生 physical interaction。因此，SHV-1 DBP 與 DNase 會互相作用，以影響彼此的作用。

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計 畫 成 果 自 評

本年度計畫進度符合預期，並已完成以下三部份實驗： 一、分析 SHV-1 DBP 及 DNase 在重組過程中參與的角色

我們已建立 helix unwinding 及 homologous pairing 的試管內模式，並發現 DBP 確實具有 helix unwinding 及 homologous paring 這兩項功能，此外，這兩項 能力會隨濃度增加而上升。在最佳反應條件的測試下，發現 SHV-1 DBP 進行 homologous pairing 的最佳反應條件為 80 mM NaCl、20 mM MgCl2、pH 7.0~7.8，

且過程中不需 ATP 的存在。至於 helix unwinding 方面，SHV-1 DBP 進行 helix unwinding 時需要鎂離子的存在，但不需 NaCl 與 ATP。進一步探討 DBP 對 DNase 功能的影響，發現 DBP 會促進 DNase 核酸外切 的活性，而且 DBP 是否具有 結合 DNA 的能力，與是否會影響 DNase 的活性有關。 二、SHV-1 基因體細胞內重組模式的建立及分析 我們已建立細胞內重組模式，並證實在單純 疹病毒一型及 SHV-1 感染 後，可以成功地啟動重組的進行，顯示 SHV-1 可辨認來自於單純 疹病毒一型 的a 序列，誘發重組的發生。 三、SHV-1 基因體重組複合物的分析

我們已利用 Biotinylated-ELISA與 yeast two-hybrid system求證 DNase 與 DBP 之間是否有直接作用。這兩項實驗都得到正面的結果，顯示 DBP 確實會與 DNase 產生 physical interaction。因此，SHV-1 DBP 與 DNase 會互相作用，以影響彼此 的作用。

表 一 細胞內重組模式。 Number of white colony Number of blue colony Number of total colony Recombination efficiency (%)c Controla 0 2 0 0 pRD105 783 17250 18033 4.34 pRD105/HSV-1b 1214 10590 11804 10.30 pRD105/SHV-1b 474 1858 2332 20.33 a Control 為細胞不經任何處理的陰性對照組。 b pRD105/HSV-1、pRD105/SHV-1 表示先將 pRD105 送到細胞後，再以 10 m.o.i. 的病毒量感染。 c Recombination efficiency 為白色菌落數除以總菌落數的百分比。

(A)

(B)

圖 一 細胞內重組的模式圖。(A)pRD105 質體的架構。(B)細胞內重組模式的實 驗流程。

Recombination

No recombination Blue colonies

(A)

(B)

100 13.9 28.6 32.4 40.5 48.2

圖 二 SHV-1 DBP 具有 helix unwinding 及 homologous pairing 的能力。（A） Helix unwinding。將不同濃度的 DBP 與 hybrid DNA 作用 30 分鐘後，以電泳分 析。Lane 1 為 M13 primer，lane 2 為 hybrid，lane 3 為 100℃變性的 hybrid，lanes 4~7 分別為 0、1、5、10 pmol 的 DBP。箭頭部份為 hybrid 及 primer 的位置。（B ） Homologous pairing。將 0.5 μg 的 ssDNA 分別與 0、1、5、10 pmol 的 DBP 混 合，於 37℃作用 5 分鐘後，以電泳分析。Lane 1 代表 dsDNA，lane 2 代表 ssDNA， 箭頭部份為 dsDNA 及 ssDNA 的位置。圖下方的數字代表同源性 DNA 配對的百 分比，計算方式以 ssDNA 除以 dsDNA 與 ssDNA 總量的百分比。

1 2 3 4 5 6 7

← Hybrid

← P r i m e r

dsDNA ssDNA 0 1 5 10 (pmol)

← d s D N A

← s s D N A

100℃

(A)

(B)

(C)

圖 三 SHV-1 DBP對DNase活性的影響。(A)SHV-1 DBP對DNase內切 及外切 活性的影響。Lanes 1~5為利用supercoiled pUC18 dsDNA為受質，lanes 6~10為利 用linear pUC18 dsDNA為受質。SHV-1 DNase (0.5 pmol)與0.5 µg dsDNA和0 (lanes 2, 7)、1 (lanes 3, 8)、5 (lanes 4, 9) 或10 (lanes 5, 10) pmol SHV-1 DBP混合後，於 370C作用5分鐘。(B)SHV-1 DBP內切 及外切 的活性。組別同(A)，但反應中 不加入DNase。(C)定量分析。 0 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 DBP concentration (pmol)

Relative DNase activity

Exo Endo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(A) (B)

(C)

圖 四 SHV-1 DBP 對 DNase 外切 活性的影響。將 SHV-1 DNase (0.5 pmol)與 0.5 µg linear pUC18 dsDNA 在不含(A)或含有(B) 10 pmol SHV-1 DBP 的情況下， 於 370

C 作用 0 (lane 1)、1 (lane 2)、3 (lane 3)、5 (lane 4)、10 (lane 5)、15 (lane 6) 或 20 (lane 7)分鐘，再以 1.2% agarose gels 分析。(C)定量分析。

0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 Time (min)

Relative DNase activity

DNase only DNase + DBP

圖 五 Acetic anhydrate 對 SHV-1 DBP 結合 DNA 能力的影響。將 SHV-1 DBP 與不同莫爾比例的 acetic anhydrate 混合後，於 40 C 作用 30 分鐘，再以硝基纖維 濾紙結合試驗分析。

0

0.3

0.6

0.9

1.2

0/1

1/1

2/1

5/1

10/1

mol of acetic anhydride / mol of DBP

圖 六 SHV-1 DBP DNA 結合能力對 DNase 活性的影響。將 DNase (0.5 pmol)與 50 ng 35S-labeled pUC18 dsDNA 及 10 pmol DBP 、 10 pmol acetic anhydride- modified DBP 或 10 pmol of acetic anhydride-treated E. coli SSB 混合 後，於 370 C 作用 15 分鐘，未切割的 DNA 以 TCA 沉澱後，再測定放射線強度。 0 1 2 3 4 5 6 7

DNase only DBP+DNase Acetic anhydride-treated DBP+DNase Acetic anhydride-treated E. coli SSB

(A)

(B)

圖 七 SHV-1 DBP 對 DNase processivity 的影響。將 SHV-1 DNase (0.75 pmol or 0.5 pmol)與 0.5 µg of 35S-labeled pUC18 dsDNA 在不含(A)或含有(B)10 pmol DBP 的條件下，作用 2 分鐘，再加入過量的 unlabeled pUC18 dsDNA，最後於 370

C 下作用 0、2、10、20、40 或 60 分鐘 (filled squares)。未切割的 DNA 以 TCA 沉 澱後，再測定放射線強度。Open squares 為不加入 unlabeled pUC18 dsDNA 的組 別。 0 100 200 300 400 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) cpm (x1000) 0 100 200 300 400 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) cpm (x1000)

First layer DNase D B P + + + + + + + + + + + + + + Second layer DNase (ìg) D B P (ìg ) 0 0 0 0 0 0.1 0 0.5 0 1 0 5 0 10 0 0 0 0 0.1 0 0.5 0 1 0 5 0 10 0 Third layer Anti-DNase Ab Anti-DBP Ab + + + + + + + + + + + + + +

圖 八 利用 ELISA 測定 SHV-1 DBP 與 DNase 之間的交互作用。SHV-1 DNase (open bar)或 DBP (close bar)先吸附於 ELISA 平盤上，再加入不同濃度的 DBP 或 DNase。陽性對照組(column 1)為吸附 DNase 或 DBP 的 well 加入相對應的抗體。 陰性對照組為吸附 DNase 或 DBP 的 well 加入對抗 DBP 或 DNase 的抗體。數值 為三次實驗的平均。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 2 3 4 5 6 7 Absorbance (405 nm)