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台灣地區土壤中木黴菌株對植物病原真菌拮抗能力之篩選

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Academic year: 2021

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 59(1):29–41 (2010). 木黴菌抗生作用之篩選. 29. 台灣地區土壤中木黴菌株對植物病原真菌拮抗能力 1 之篩選 倪蕙芳2 許淑麗2 陳瑞祥3 楊宏仁4,5 摘. 要. 倪蕙芳、許淑麗、陳瑞祥、楊宏仁。2010。台灣地區土壤中木黴菌株對植物病原真菌拮抗 能力之篩選。台灣農業研究 59:29–41。. 本研究自台灣田間作物土壤分離獲得 643 株木黴菌,利用玻璃紙抗生法篩選 對 百 合 灰 黴 病 菌 (Botrytis elliptica) 、 褐 根 病 菌 (Phellinus noxius) 及 疫 病 菌 (Phytophthora capsici) 等植物病原真菌生長具有拮抗性之木黴菌菌株;結果顯示 Tri-003 及 Tri-080 菌株對這 3 種病菌之菌絲生長抑制率皆可達 100%。另外,此 兩菌株對荔枝露疫病菌 (Peronophythora litchii) 及腐霉菌 (Pythium sp.) 之菌絲生 長亦具有 100%的抑制率。此兩菌株經由形態特徵及 rDNA ITS 序列比對後鑑定皆 為 Trichoderma virens。 關鍵詞︰木黴菌、拮抗性、植物病原真菌、生物防治。. 前. 言. 植物病害在農業生產中為一重要之限制因 子,截至目前為止,約有 30%之植物仍受到植 物病原菌之危害,而土傳性病原之危害更是造 成作物生產量降低之重要因素。雖然利用殺菌 劑防治植物病害一直是農民廣為使用的方法, 然而藥劑之不當使用常衍生出病原菌抗藥性增 加 及 環 境 污 染 等 問 題 (Kucuk & Kivanc 2003)。生物防治利用原本即存在於自然界之微 生物進行植物病害之防治,可以大幅度減少化 1. 2. 3. 4. 5.. 學藥劑之使用與其對環境之污染,已成為植物 病蟲害防治的新趨勢,因此拮抗微生物之篩選 與應用便成為開發植物病害防治用生物製劑的 首要目標。 木黴菌 (Trichoderma spp.) 為普遍存在於 自然界之土壤微生物,種類繁多,而最常用於 生 物 防 治 菌 之 木 黴 菌 種 類 有 T. virens von Arx.、T. viride Pers. 及 T. harzianum Rifai 等 (Benitez et al. 2004)。木黴菌之所以可以成功做 為生物防治菌乃因其具有繁殖容易、對環境耐 受性高、根圈纏據力佳、對許多植物病原真菌. 行政院農業委員會農業試驗所研究報告第 2396 號。接受日期:99 年 3 月 9 日。 本所嘉義農業試驗分所植物保護系副研究員兼系主任、研究助理。台灣 嘉義市。 國立嘉義大學生化科技學系副教授。台灣 嘉義市。 本所嘉義農業試驗分所研究員兼分所長。台灣 嘉義市。 通訊作者,電子郵件:yhr@dns.caes.gov.tw;傳真機:(05)2764525。.

(2) 30. 台灣農業研究. 生長有極佳之拮抗性以及具有促進植物生長及 誘導植物抗性等特點 (Benitez et al. 2004)。木 黴菌作為生物防治菌目前主要還是應用在防治 土 傳 性 病 害 (Monte 2001) , 例 如 由 鐮 胞 菌 [Fusarium oxysporum Schltdl.; F. solani (Mart.) Sacc.; F. colmorum (Wm. G. Sm.) Sacc.] 引起 之 萎 凋 及 根 腐 病 (Federico et al. 2007) 、 Rhizoctonia solani J. G. Kühn 所引起之莖腐病 (Bertagnolli et al. 1998; Jong et al. 1999)、 Pythium spp. 引 起 之 猝 倒 病 及 根 腐 病 以 及 Phytophthora 引 起 之 根 腐 病 等 (Sid et al. 1999)。Trichoderma 除了在真菌性病害防治之 應用外,在細菌性及病毒性病害之防治上亦有 成功之報告,如應用 Trichoderma GT3-2 菌株 可以誘導胡瓜對由 Pseudomonas syringae pv. lachrymans 造成之細菌性斑點病的抗性,使保 護率達 52% (Koike et al. 2001);T. harzianum T-1 & T-22 及 T. virens T-3 菌株可誘導胡瓜抗 病毒病害,能降低由病毒所造成胡瓜植株生長 抑制程度 (Lo et al. 2000)。目前國外已有多種 木 黴 菌 相 關 商 品 問 世 , 如 美 國 的 Topshield (T22) 及以色列的 Trichodex (T39) 均為實際 應用之商品 (Bhuyan 1994)。 有關木黴菌防治病害或抑制病原的主要機 制,已知有五大類,即產生抗生素、營養競爭、 超寄生、細胞壁分解酵素、以及誘導植物產生 抗性等 (Benitez et al. 2004)。木黴菌產生之抗 生物質以 gliotoxin、viridin 及 gliovirin 最廣 為人知。Gliotoxin 由 Weinding (1941) 首先發 現,其具有很強之抗生活性,包括能抑制細菌 繁殖、真菌孢子發芽及病毒之複製 (Rightsel et al. 1964)。T. virens 所產生之 gliotoxins 能有效抑制 Phytophthora spp. 菌絲之生長、產生孢子及游 走孢子之能力 (Wilcox et al. 1992)。另外 viridin 屬於 steroids 類抗生素,亦具有抑制 R. solani 與 Pythium spp. 生長,以及 Sclerotium rolfsii Sacc. 菌核發芽之能力 (Ghisalberti 2004)。. 第 59 卷. 第1期. 台灣位處熱帶與亞熱帶,擁有豐富之自然 資源,微生物相極具多樣化,亦有利於具有生 物防治效力拮抗微生物之篩選,因此本研究由 台灣各地之農田土壤分離收集木黴菌株,並測 試其對植物病原真菌的拮抗能力,篩選台灣本 土具生物防治潛力之木黴菌,供進一步作為開 發生物製劑之用。. 材料與方法 供試材料來源 木黴菌菌株之採集、分離及保存:採集彰 化、雲林、嘉義、台南、高雄、屏東及台東等 地區作物之根圈土壤,每份土樣之採集點皆以 GPS 衛星定位,利用土壤連續稀釋平板法分離 木黴菌。每一土壤採樣秤取 10 g 加入 100 mL 無菌水攪拌,靜置後再將上層液以無菌水進行 10 倍系列稀釋後,取 100 倍及 1000 倍之稀釋 液各 100 μL,以 L 型玻棒均勻塗抹於添加 0.25%乳酸 (lactic acid) 之 PDA 培養基 (Potato Dextrose Agar, Merck, USA) 平板上,於室溫 (25℃–28℃) 下培養。初步以培養基上菌落及 產孢形態為依據,挑取木黴菌絲尖端移至 PDA 平板上純化,待產孢後進行菌株編號及單孢純 化。純化後之菌株刮取孢子以無菌水製成懸浮 液,再與 25%甘油進行混合,分別置於-20℃及 -80℃下保存。於每次試驗前取出菌種保存液於 PDA 平板上進行更新,以恢復菌種之生長及活 力。 供試植物病原菌:本研究測試之植物病原 菌真菌包括 Phytophthora capsici Leonian 番 茄菌株 (Pc-T) 及辣椒菌株 (Pc-P)、Phellinus noxius (Corner) G. H. Cunn. (荔枝)、Pythium spp. (莧菜、甜瓜、蘭花、胡瓜)、 Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. ( 芒 果 ) 、 Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. ( 木 瓜 ) 、 Phomopsis sp. ( 芒 果 ) 、 Peronophythora litchii Chen ex Ko et al. (荔.

(3) 木黴菌抗生作用之篩選. 枝)、Botrytis elliptica (Berk.) Cooke (百合)、 Fusarium sp. (百合) 及 Rhizoctonia solani (百 合),其中 Phytophthora capsici、Phellinus noxius 及 Pythium sp. 分別由農業試驗所植物病理組 安寶貞博士、蔡志濃博士及黃晉興助理研究員 提供,其餘則為本實驗室保存之菌株。上述菌 株除 Peronophythora litchi 保存於 10% V-8 Agar 外,其餘菌株皆保存於 PDA 試管,於 25℃ 恆溫箱中培養,每次試驗前進行更新。. 木黴菌與植物病原真菌之抗生測定 將純化保存於-20℃甘油之木黴菌菌株,分 別吸取 10 μL 於 PDA 培養基活化後再以 PDA 於 25℃ 恆溫箱培養 3 天後所得之菌 落,以直徑 5 mm 打孔器切取菌絲邊緣製作菌 絲塊,移至已貼有滅菌之 3.5 cm × 3.5 cm 玻璃 紙之直徑 5.5 cm PDA 培養基中心點位置,在 25℃恆溫箱培養 16 小時後,將玻璃紙連同木黴 菌菌絲塊一起撕下。再將培養於 PDA 平板上之 B. elliptica 、 C. gloeosporioides 、 F. sp. 、 L. theobromae、Peronophythora litchii、Phellinus noxius、 Phomopsis sp.、 Phytophthora capsici (Pc-T & Pc-P)、Pythium sp.及 R. solani 等 植 物 病原真 菌,用直徑 5 mm 打孔器切取菌絲 邊緣得到之菌絲塊接種於前述 PDA 培養皿中 心點上。另設不接木黴菌之對照組,每處理 5 重複,置於 25℃恆溫箱培養,每天測量記錄菌 落大小至對照組菌絲長滿。以下列公式計算木 黴菌對植物病原真菌菌絲生長之抑制百分率, 藉以篩選對植物病原菌具拮抗能力之木黴菌菌 株。病原真菌菌絲生長抑制率計算公式如下: 病原真菌菌絲生長抑制率 (%)= [(對照 組培養平均直徑 − 處理組培養平均直 徑)/對照組培養平均直徑] × 100. 木黴菌之形態及分子鑑定 木黴菌之形態鑑定以掃描式電子顯微鏡及 光學顯微鏡進行觀察。於室溫 (25℃–28℃) 培 養於 PDA 平板 3 天之 Tri-003 及 Tri-080 菌. 31. 株,切取約 10 mm2 之菌絲塊,先以液態氮進行 固定後,再置於桌上型掃描式電子顯微鏡 (SEM, TM-1000, Hitachii, Japan) 之觀察載台上,立即以 SEM 進行觀察孢子梗之形態及構造並照相紀 錄。另於 PDA 培養基上挑取產生之孢子,以光 學顯微鏡觀察並記錄 50 個以上之孢子大小,並 進行平均值計算。木黴菌之分子鑑定則以分析 核糖體非轉錄區間序列 (ITS) 進行。將木黴菌 菌絲培養於裝有 15 mL PDB 之 50 mL 離心管, 置於 25℃定溫箱以 100 rpm 振盪培養,待菌絲 長至適當大小時,於預冷 4℃之離心機以 8000 rpm 離心 10 分鐘,倒掉上層液並以無菌水沖洗 3 次後冷凍乾燥。取 300 mg 冷凍乾燥之菌絲 體,以預冷的玻棒搗碎後,置於 1.5 mL 的離心 管中,加入 700 μL liysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.2; 50 mM EDTA, pH 7.2; 3% SDS; 1% mercaptoethanol),震盪混合均勻後置於 65℃乾 浴器中處理 1 小時,每隔 15 分鐘取出震盪 15 秒,以利菌絲體溶解。再加入比例為 25:24: 1 的 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (Amresco, USA) 700 μL,輕微翻轉數次,混合 均勻,於 4℃以 12,000 rpm 離心 10 分鐘。小心 吸取 600 μL 上層液至新的離心管中,加入 600 μL chloroform (Riedel-de Haen, Germany) 輕微翻 轉數次,於 4℃ 12,000 rpm 離心 10 分鐘。取 500 μL 上層液加 50 μL 3 M NaOAc (醋酸鈉)、500 μL 2-isopropanol (Fluka, Switzerland),置於冰上 20 分鐘後以 12,000 rpm 於 4℃離心 10 分鐘,倒掉 上層液,加入 500 μL70%冰冷酒精,於 4℃以 12,000 rpm 離心 5 分鐘,將酒精倒掉後烘乾,待 沉澱物變透明時,加入 80 μL 滅菌之超純水,置 於 65℃水浴槽 5 分鐘,即完成木黴菌 DNA 之萃 取 (Lai 2003)。取 30 ng 所得之 DNA 作為聚合酵 素連鎖反應 (PCR) 所需的模板 DNA (template DNA) 濃度,加入內含 10× Taq buffer 2.5 μL、 0.25 μL 10 mM dNTP、0.5 μL 10 mM ITS1 primer (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’)、0.5 μL 10 mM.

(4) 32. 台灣農業研究. ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) primer (White et al. 1990)、0.2 μL Taq (Protech, Taiwan) 反應液中,並於溫度循環控制反應器 (Applied Biosystems Gene Amp PCR System 2400, USA) 中進行聚合酵素連鎖反應,反應條件為以 94℃30 秒變性 (denaturing)、52℃ 30 秒黏合 (annealing)、72℃ 30 秒延長 (extension) 進行 3 個循環 (cycles),最後再以 72℃反應 7 分鐘後, 取 10 μL 產物以 1.5% Agarose 膠體於 0.5× TBE buffer (0.45 M Tris, 0.45 M Boric acid, 0.01 M EDTA, pH 8.0) 緩衝液下,以 100 V 電壓進行 電泳分離,並以 100 bp DNA Ladder (Protech, Taiwan) 作為分子量大小的標記。電泳完成 後,取出膠片,以溴化乙錠 (ethidium bromide) 染色 25 分鐘,再以影像分析系統 (Bio-Rad, Gel Doc 2000, USA) 觀察聚合酵素連鎖反應的結 果。另外所得 PCR 產物委託源資生物科技公司 以 ITS1 及 ITS4 為定序引子進行核酸定序。. 結. 果. 木黴菌菌株之採集與分離 於彰化、雲林、嘉義、台南、高雄、屏東 及台東等地採集 328 包作物之根圈土壤,土壤 pH 值由 3.3 至 8.5,作物相包括果樹、蔬菜、 花卉、特用作物、森林作物等 80 種以上之作 物,利用土壤連續稀釋平板法進行木黴菌之分 離,所分離之木黴菌培養形態具有多樣化 (圖 1),本研究目前於實驗室共低溫保存 643 株木 黴菌菌株於甘油中。. 玻璃紙抗生法篩選具拮抗性木黴菌菌株 本研究將所獲得之木黴菌菌株,取其中 301 株 以 玻 璃 紙 抗 生 法 與 Fusarium oxysporum、Phytophthora capasici、Phellinus noxius、Botrytis elliptica 等植物病原真菌分別 進行拮抗性初步篩選試驗 (圖 2),共篩選出 2 株對 P. noxius、B. elliptica 及 P. capacisi 等病 原真菌菌絲生長具有 100%抑制效果之木黴菌. 第 59 卷. 第1期. 菌株,分別為 Tri-003 及 Tri-080 (表 1)。其中 Tri-003 由台南縣白河鎮之木瓜園分離而得,另 外 Tri-080 則由台南縣東山鄉之香蕉園分離而 來。為進一步瞭解此兩株拮抗性木黴菌對其它 病原真菌菌絲之生長抑制效果,本研究另以 Colletotrichum gloeosporioides 、 Lasiodiplodia theobroma、Peronophythora litchii、Phomopsis sp. 、 Phytophthora capsici (Pc-T & Pc-P) 、 Pythium spp. 及 Rhizoctonia solani 等植物病原 菌進行拮抗試驗,結果發現兩株木黴菌對 Peronophythora litchii 、 P. capsici (Pc-T & Pc-P)、Pythium sp.-46、Pythium sp.-94、Pythium sp.-97 菌絲生長均可達 100%之抑制效果,而 Tri-003 及 Tri-080 對 Rhizoctonia solani 之菌絲 平均生長抑制率分別為 86%及 100% (表 2), 但對 Fusarium 屬之真菌之拮抗性則不明顯。. 木黴菌形態及分子鑑定 本研究所得之木黴菌 Tri-003 及 Tri-080 菌 株,其生長速度很快,約 3 天即可長滿直徑 9 cm 之 PDA 平板,菌落呈棉絮狀外觀,未產生分生 孢子時為白色,產生後為綠色,均會使培養基 呈黃色 (圖 3A–D),分生孢子梗直立或略微彎 曲,並可再形成次級分支,其瓶狀孢子梗略呈 圓錐狀,分生孢子圓形或橢圓形為單孢單室, 在瓶狀枝上連結成團 (圖 3E、F),測量 50 個 分生孢子後,Tri-003 及 Tri-080 分生孢子大小 分別為 (3.99 ± 0.40 × 4.02 ± 0.24) µm,長寬比平 均 1.14,以及 (4.02 ± 0.53 × 3.49 ± 0.40) µm,長 寬比平均 1.15 (圖 3G、H)。 在菌株的分子鑑定則以核糖體非轉錄區間 之序列與 NCBI 基因庫中已知之木黴菌同段序 列進行比對,結果發現 Tri-003 及 Tri-080 兩菌 株皆可產生大小為 614 bp 之 PCR 產物,經進 一步將 PCR 產物純化及核酸定序並以 Vector NTI 軟體 (Invitrogen Co., USA) 進行比對後, 發現此兩木黴菌菌株 ITS1 及 ITS2 之核酸序列 相同度均為 100%,而與基因庫中編號 EU280076.

(5) 木黴菌抗生作用之篩選. 33. 圖 1. 台灣地區土壤分離所得之不同木黴菌株在 PDA 培養基上之形態差異。 Fig. 1. Variations in culture morphology among different Trichoderma isolates collected from rhizosphere soils in Taiwan. (A) PDA cultures, top view; (B) PDA cultures, bottom view.. 僅 在 ITS1 序 列 有 一 個 鹼 基 之 差 異 , 而 與 EF442081 之 T. virens 同段核酸序列之相同度 達 100% (圖 4),Tri-003 與 Tri-080 之 ITS 序列 則 登 錄 於 NCBI 編 號 分 別 為 GU111538 及 GU111539。. 討. 論. 木黴菌為廣泛存在於土壤中之微生物,本 研究為收集存在於台灣彰化以南之農田根圈土 壤中之木黴菌菌株,用土壤稀釋平板法以含 2.5%之乳酸之 PDA 平板進行分離,以木黴菌.

(6) 34. 台灣農業研究. 第 59 卷. 第1期. 圖 2. 利用玻璃紙抗生法於 PDA 平板上測試木黴菌株對 Phellinux noxius (A)、Phytophthora capsici (B)、Botrytis ellipitica (C)、以及 Sclerotium rolfsii (D) 等植物病原真菌生長之拮抗作用。 Fig. 2. Antagonism of Trichoderma spp. on Phellinus noxius (A), Phytophthora capsici (B), Botrytis ellipitica (C), and Sclerotium rolfsii (D) using cellophane paper test. Trichoderma sp. isolate Tri-080 completely suppressed mycelial growth of all four plant pathogens (A–D).. 在 APDA 生長之型態及產孢之特性等,共分 離到 643 株木黴菌之菌株。所得之木黴菌移 至 PDA 純化,待其產孢後,利用單胞分離再 次純化,並將最後純化之木黴菌分別將孢子 懸浮於 25% glycerol 中,以-20 及-80℃進行 冷凍保存,本研究以此方法保存於-20℃冷凍. 2 年以上之菌株,經重新更新仍具有相當好之 活性。 本研究將所保存之木黴菌菌株先以玻璃紙 抗生法篩選對 Phytophthora 等四種重要植物 病原真菌生長具有抑制性之木黴菌菌株,經由 隨機挑選之 301 株木黴菌菌株中篩選到 Tri-003.

(7) 木黴菌抗生作用之篩選. 35. 表 1. 利用玻璃紙抗生法測定不同木黴菌株對 4 種植物病原真菌生長之抑制能力 Table 1. Antagonism of five isolates of Trichoderma spp. from Taiwan on four fungal plant pathogens, using cellophane paper test Growth inhibition of plant pathogens (%) Isolates of Trichoderma Tri-003 Tri-004 Tri-006. F. oxysporum 22.6 ± 1.3 z 0.0 31.8 ± 1.5. Tri-082. 31.8 ± 0.4. P. noxius 100.0. 78.0 ± 7.7. 0.0. Tri-080 z. P. capsici 100.0. 100.0. 0.0. 77.5 ± 8.9. 12.7 ± 2.4. 0.0. 100.0. 36.9 ± 3.1. 100.0. 16.5 ± 2.6. B. elliptica. 100.0. 0.0. 34.7 ± 15.2. Vaule of inhibition of mycelial growth (%) ± standard deviation; 4 replicates/treatment.. 表 2. 利用玻璃紙抗生法測試木黴菌 Tri-003 及 Tri-080 分離株對植物病原真菌生長之抑制 Table 2. Antagonism of Trichoderma isolates Tri-003 and Tri-080 from Taiwan on fungal plant pathogens, using cellophane paper test Growth inhibition (%) Fungal plant pathogens Colletotrichum gloeosporioides Lasiodipiodia theobromae Peronophythora litchi Phomopsis sp.. Tri-003 11.6 ± 3.4 24.2 ± 3.0 100.0 23.8 ± 5.5. Tri-080 z. 24.4 ± 8.9 40.4 ± 5.0 100.0 62.7 ± 13.8. Phytophthora capsici (Pc-T). 100.0. 100.0. Phytophthora capsici (Pc-P). 100.0. 100.0. Pythium sp.-13. 90.2 ± 6.0. 50.2 ± 11.5. Pythium sp.-46. 100.0. 100.0. Pythium sp.-94. 100.0. 100.0. Pythium sp.-97. 100.0. 100.0. Rhizoctonia solani-222. 58.6 ± 8.4. Rhizoctonia solani-227. 86.0 ± 4.5. Rhizoctonia solani-367. 59.3 ± 5.6. z. 79.6 ± 8.8 100.0 78.0 ± 4.9. Vaule of inhibition of mycelial growth (%) ± standard deviation; 4 replicates/treatment.. 及 Tri-080 對 Phytophthora capcisi、Rhizoctonia solani、Botrytis elliptica、Pythium spp. 及 Phellinus noxius 等植物病原真菌生長具有相當 顯著之抑制能力。此兩菌株分別由台南縣之木 瓜園及香蕉園之土壤獲得,此兩菌之抑菌範圍 相當廣泛,舉凡對屬於擔子菌之褐根病菌、屬 於卵菌綱之疫病菌、露疫病菌、腐黴菌及屬於. 不完全菌之灰黴病菌之生長都可以達到 100% 之抑制效果,為深具植物病害防治潛力之木黴 菌菌株,值得進一步開發利用。至於其抑菌機 制為何則值得進一步探討。已知測試病原菌菌 株中 Peronophythora litchii、Phytophthora spp. 及 Pythium spp.皆屬於卵菌綱 (Oomycetes),卵 菌綱之細胞壁以纖維素為主 (Gurr et al. 1992),.

(8) 36. 台灣農業研究. 顯示了本研究篩選得到之木黴菌菌株具拮抗性 或許與纖維素分解酵素之產生有關,有待進一 步測定纖維分解酵素之產量。已知木黴菌菌株. 第 59 卷. 第1期. 除具有纖維素分解酵素之能力外,其亦具有分 泌 chitinase (El-Katatny et al. 2001; de la Cruz et al. 1992; Nguyen et al. 2008)、ß-1,3-glucanases. 圖 3. 木黴菌 Tri-003 (A、B) 及 Tri-080 (C、D) 菌株培養在 PDA 培養基上之形態特徵。Tri-003 菌株產生 瓶狀分生胞子梗 (E) 及球形分生胞子 (G);Tri-080 菌株產生瓶狀分生胞子梗 (F) 及球形分生胞子 (H)。 Fig. 3. Morphological characteristics of Trichoderma Tri-003 and Tri-080 isolates cultured on PDA. Colony (A, B), conidiophores (E), and of conidia (G) of Tri-003, and colony (C, D) conidiophores (F) and of conidia (H) of Tri-080. (A) and (C), PDA cultures, top view; (B) and (D), PDA cultures, bottom view..

(9) 木黴菌抗生作用之篩選. 37. 圖 4. 木黴菌 EF442081、EU280076、Tri-003 及 Tri-080 等菌株 ITS1 (A) 及 ITS2 (B) 序列比對結果。 Fig. 4. The nucleotide sequence alignment of ITS1 and ITS2 regions among EF442081, EU280076, GU111538 (Tri-003), and GU111539 (Tri-080). All of accession numbers on DDBJ/NCBI/GenBank. (* indicated sequences unconsensus). (El-Katatny et al. 2001; Lorito et al. 1994)、 ß-1,6-glucanases (de la Cruz et al. 1995; Montero et al. 2005) 及 protease (Germia et al.. 1993; Pozo et al. 2004; Grinyer et al. 2007) 等 酵素之能力,此 3 種酵素之主要功能為分解 病 原 真 菌 細 胞 壁 的 chitin 、 ß-glucans 及.

(10) 38. 台灣農業研究. polysaccharides,造成細胞壁不完整,使病原 菌無法繼續生長而死亡,因此,在木黴菌的 拮抗機制中,上述水解酵素扮演極重要之角 色 (Yang et al. 2009)。 除真菌細胞壁分解酵素之作用外,已知 T. virens 尚 會 分 泌 多 種 二 次 代 謝 產 物 如 gliotoxin、glioviridin 及 viredin 等,抑制真菌孢 子 的 發 芽 (Wilcox et al. 1992) 。 Dennis & Webster (1971) 等人發現木黴菌分泌的酵素或 二次代謝產物會通過玻璃紙滲透於培養基中, 進而抑制病原真菌的生長。Wang (2006) 為了 解玻璃紙之通透性,利用 protein marker 進行測 試,發現處理組與對照組所得到的條帶是相同 的,顯示玻璃紙對 97 kDa 以下之蛋白並無阻 隔效果。本研究利用玻璃紙抗生法所篩選之 Tri-003 及 Tri-080 究竟是以產生細胞壁分解酵 素或抗生物質拮抗真菌病原之生長則有待進一 步闡明。另外在對 Fusarium 之生長抑制菌株篩 選上,過去雖已有報告顯示木黴菌對 Fusarium 之效果,然而本研究所篩選之木黴菌菌株,在 以玻璃紙抗生法做為篩選方法時,對 Fusarium 生長並未具有明顯之抑制效果,究其原因推測 木黴菌對 Fusarium 之防治機制可能並非透過 二次代謝物,而可能是利用營養競爭或微寄生 等機制達到抑菌作用,因此在本研究並無法以 玻璃紙抗生法篩選出來。 由本研究所獲得 Tri-003 及 Tri-080 均為 生長快速且產孢能力極佳之菌株,具有瓶狀 枝,產生黃色素之特性,為 T. virens 之特徵 之一。有關木黴菌之分類一直是極具複雜 性,ITS 區間 DNA 序列的親源性分析近年來 蔚為趨勢,本研究所探討之 Tri-003 及 Tri-080 由核糖體 ITS 序列得知與 NCBI 資料庫搜尋 所 獲 之 相 近 菌 株 T. virens EU280076 及 EF442081 之序列相同度達 100%,綜合形態 特 徵 與 分 子 鑑 定 資 料 顯 示 兩 菌 應 均 為 T. virens。因此藉由核糖體非轉錄區間序列進行. 第 59 卷. 第1期. 鑑定輔助形態分類,應不失為木黴菌方便而 準確之鑑定方式。 有關 T. virens 應用於植物病害防治之研 究,已有許多由台灣地區土壤上篩選所得之菌 株分別證實可以應用在防治水稻紋枯病 (Chu 2004)、甘藍立枯病 (Chen 1998) 與向日葵、菊 花菌核病 (Wu 1991) 等。有關本研究所收集之 木黴菌菌株 Tri-003 及 Tri-080,應具有植物病 害防治潛力,值得進一步研究開發作為生物防 治製劑。另外值得注意的是由於本研究為針對 木黴菌所分泌之物質是否具有抑制植物病原生 長之能力進行篩選;至於其它機制,如營養競 爭、微寄生或是誘導抗性等均有待進一步加以 評估。因此本研究中收集所得但未表現抗生作 用之木黴菌菌株,仍應加以保存並做為未來篩 選測試之用。. 誌. 謝. 本研究承農業試驗所安寶貞博士、蔡志濃 博士、黃晉興助理研究員提供植物病原菌菌 株;柯文琪、蔡秀慧、曾怡婷、鄭淑芳、蔡姿 瑩及田蕙萍等助理協助本研究中木黴菌之收 集、菌株單孢純化及更新工作,謹此致謝。. 引用文獻 (Literature cited) Benitez, T., A. M. Rincon, and A. C. Codon. 2004. Biocontrol mechanism of Trichoderma strains. Int. Microbiol. 7:249–260. Bertagnolli, B. L., S. Daly, and J. B. Singlair. 1998. Antimycotic compounds from the plant pathogen Rhizoctonia solani and its antagonist Trichoderma harzianum. J. Phytopathol. 88:131–135. Bhuyan, S. A. 1994. Antagonistic effect of T. viride, T. harzianum and Asperigillus terrus on Rhizoctonia solani causing sheath blight of rice. J. Agric. Sci. 7:125–128. Chen, C. Y. 1998. Biological Control of Soilborne Disease by Trichoderma spp. and Gliocladium spp. Master Thesis. Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University. 109 pp. (in Chinese with English abstract).

(11) 木黴菌抗生作用之篩選. Chu, S. C. 2004. Biological Characteristics of Gliocladium virens WJGV2, TLGV22 and the Mass Production of Chlamydospore Formulation for Disease Control. Master Thesis. Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University. 93 pp. (in Chinese with English abstract) de la Cruz, J., A. Hidalgo-Gallego, J. M., Lora, T. Benitez, J. A. Pintor-Toro, and A. Llobell. 1992. Isolation and Characterization of three chitinases from Trichoderma harzianum. Eur. J. Biochem. 206: 859–867. de la Cruz, J., J. Pintor-Toro, T. Benitez, and A. Llobell. 1995. Purification and characterization of an endo-ß-1,6-glucanase from Trichoderma harzianum that is related to its mycoparasitism. J. Bacteriol. 177:1864–1871. Dennis, C. and J. Webster. 1971. Antagonistic properties of species groups of Trichoderma I. Production of nonvolatile antibiotics. Trans. Br. Mycol. Soc. 57: 353–369. El-Katatny, M. H., M. Gudelj, K. H. Robra, M. A. Elnaghy, and G. M. Gubitz. 2001. Characterization of a chitinase and an endo-beta-1,3-glucanase from Trichoderma harizanum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:137–143. Federico, G. R., M. M. Reynoso, M. Ferez, S. N. Chulze1, and A. M. Torres. 2007. Biological control by Trichoderma species of Fusarium solani causing peanut brown root rot under field conditions. Crop Prot. 26:549–555. Germia, A., H. Goldman, D. Jacobs, W. Ardiles, S. Vila, M. Montagu, and A. Herreraestrella. 1993. Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, prbl, related to mycoparasitism by Trichoderma harzianum. Mol. Microbiol. 8:603–613. Ghisalberti, E. L. 2004. Anti-infective agent produced by the Hyphomycetes genera Trichoderma and Gliocladium. Med. Chem. Ser. Rev. 1:395–403. Grinyer, J., L. Kautto, M. Traini, R. D. Willows, J. Te’O, P. Bergquist, and H. Nevalainen. 2007. Proteome mapping of the Trichoderma reesei 20S proteasome. Curr. Genet. 51:79–88. Gurr, S. G., M. J. Mcpherson, and D. J. Bowles. 1992. Molecular Plant Pathology Vol. I. Oxford University Press. New York. 216 pp. Jong, M. B., R. Charkes, and C. Howell. 1999. The role of extracellular chitinase from Trichoderma virens. 39. Gv29-8 in the biocontrol of Rhizoctonia solani. Curr. Genet. 35:41–43. Koike, N., M. Hyakumachi, K. Kageyama, S. Tsuyumu, and N. Doke. 2001. Induction of systemic resistance in cucumber against several diseases by plant-growth-promoting fungi: lignification and superoxide generation. Eur. J. Plant Pathol. 107: 523–533. Kucuk, C. and M. Kivanc. 2003. Isolation of Trichoderma spp. and determination of their antifungal, biochemical and physiological features. Turk. J. Biol. 27:247–253. Lai, P. S. 2003. Evaluation of Genetic Diversity in Soybean Byrandom Amplified Polymorphic DNA Markers. Master Thesis. Graduate Institute of Biotechnology, National Chiayi University. 86 pp. (in Chinese with English abstract) Lo, C. T., T. F. Liao, and T. C. Deng. 2000. Induction of systemic resistance of cucumber to cucumber green mosaic virus by the root-colonizing Trichoderma spp. Phytopathology 90:S47. Lorito, M., K. Hayes, A. Pietro, L. Woo, and E. Harman. 1994. Purification characterization and synergistic activity of a ß-1,3-glucosidase and an N-acetyl-ß-blucosaminidase from Trichoderma harzianum. Phytopathology 84:398–405. Monte, E. 2001. Understanding Trichoderma: between biotechnology and microbial ecology. Int. Microbiol. 4:1–4. Montero, M., L. Sanz, M. Rey, E. Monte, and A. Llobell. 2005. BGN 16.3, a novel acidic beta-1,6-glucnase from mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum CECT 2413. FEBS J. 272:3441–3448. Nguyen, N. V., Y. J. Kim, K. T. Oh, W. J. Jung, and R. D. Park. 2008. Antifungal activity of chitinase from Trichoderma aureoviride DY-59 and Rhizopus microsporus VS-9. Curr. Microbiol. 56:28–32. Pozo, M. J., J. M. Baek, J. M. Garcia, C. M. Kenerley. 2004. Functional analysis of tvsp1, a serine protease-encoding gene in the biocontrol agent Trichoderma virens. Fungal Genet. Biol. 41: 336–348. Rightsel, W. A., H. G. Schneider, B. J. Sloan, P. R. Graf, F. A., Miller, Q. R. Bartz, J. Ehrlich, and G. J. Dixon. 1964. Antiviral activity of gliotoxin and gliotoxin acetate. Nature 204:1333–1334. Sid, A. A., C. Perez-Sanchez, C. Egea, and M. E. Candela. 1999. Evaluation of Trichoderma harzianum for.

(12) 40. 台灣農業研究. controlling root rot caused by Phytophthora capsici in pepper plants. Plant Pathol. 48:58–65. Wang, M. H. 2006. Antagonistic Activity of Trichoderma virens FT-333 against Fungal Pathogens and Antifungal Protein Purification. Master Thesis. Graduate Institute of Biotechnology, National Chiayi University. 83 pp. (in Chinese with English abstract) Weindling R. 1941. Experimental consideration of the mold toxin of Gliocladium and Trichoderma. Phytopathology 31:991–1003. White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor. 1990. Amplification and direct sequenencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. p.315–322.. 第 59 卷. 第1期. in: PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. (Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, eds.) Academic Press. New York. Wilcox, W. F., G. E. Harman, and A. Di Pietro. 1992. Effect of gliotoxin on growth, sporulation, and zoospore motility of seven Phytophthora spp. in vitro. Phytopathology 82:1121. Wu, W. S. 1991. Control of sclerotinia rot of sunflower and chrysanthemum. Plant Prot. Bull. 33:45–55. Yang, H. H., S. L. Yang, K. C. Peng, C. T. Lo, and S. Y. Liu. 2009. Induced proteome of Trichoderma harzianum by Botrytis cinerea. Mycol. Res. 113:924–932..

(13) 木黴菌抗生作用之篩選. 41. Screening of Trichoderma spp. from Soils in Taiwan for Antagonism on Fungal Plant Pathogens 1 Hui-Fang Ni2, Shu-Li Hsu2, Ruey-Shyang Chen3, and Hong-Ren Yang4,5 Abstract Ni, H. F., S. L. Hsu, R. S. Chen, and H. R. Yang. 2010. Screening of Trichoderma spp. from soils in Taiwan for antagonism on fungal plant pathogens. J. Taiwan Agric. Res. 59:29–41.. A total of 643 isolates of Trichoderma spp. were obtained from rhizosphere soils in central and southern Taiwan. Among them, 301 isolates were assayed in vitro for antagonism on the fungal plant pathogens, Botrytis elliptica, Phellinus noxius, Sclerotium rolfsii, and Phytophthora capcisi, using for cellophane paper method. Results showed that two of the isolates, Tri-003 and Tri-080, completely suppressed the mycelial growth of these four fungal pathogens. Tri-003 and Tri-080 were further tested for antagonism on seven species of other fungal plant pathogens and the results showed that these two isolates also completely inhibited mycelial growth of Peronophythora litchi and Pythium sp. Results of the internal transcribed spacer (ITS) of rDNA sequence of Tri-003 and Tri-080 isolates showed a sequence identity of 99% with Trichoderma virens. Based on morphological and molecular studies, the identity of both Tri-003 and Tri-080 belongs to T. virens. The potential of these two antagonistic isolates of Trichoderma for control of plant diseases caused by Phytophthora spp., Pythium spp., and Phellinus noxius warrants further investigations. Key words: Trichoderma virens, Antagonism, Fungal plant pathogens, Biocontrol.. 1. Contribution No.2396 from Taiwan Agricultural Research Institute (TARI), Council of Agriculture. Accepted: March 9, 2010. 2. Associate Researcher and Head and Assistant, Department of plant protection, Chiayi Agricultural Experiment Branch, TARI, Chiayi, Taiwan, ROC. 3. Associate Professor, Department of Biochemical Science and Technology, National Chiayi University, Chiayi, Taiwan, ROC. 4. Researcher and Director, Chiayi Agricultural Experiment Branch, TARI, Chiayi, Taiwan, ROC. 5. Corresponding author, e-mail: yhr@dns.caes.gov.tw; Fax: (05)2764525..

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參考文獻

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