應用分子標誌輔助選育高油酸落花生介紹

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(1)農藝作物. 應用分子標誌輔助選育高油酸落花生介紹農試所作物組戴宏宇. 桃園場許育鳴. 一、前言栽培種落花生(Arachis hypogaea L.). 的重要目標之一。目前研究指出高油酸. 為異源四倍體(AABB, 2n = 4x = 40)一年. 比性狀主要由兩個基因共同控制，分別. 生豆科植物，為世界第六大油料作物. 為 ahFAD2A 及ahFAD2B，隨著分子標誌. (2013年栽培面積為2千5百萬公頃)，主要. 技術的演進，針對高油酸對偶基因的分. 種植於熱帶及亞熱帶地區。落花生過去. 子標誌陸續被開發。其中一種基因型鑑. 為台灣重要油料作物，隨著大豆油等廉. 定系統利用 Ta q m a n 探針，以即時聚合. 價食用油引進，目前主要用作鮮食及加. 酶連鎖反應(Real-time Polymerase Chain. 工用途，為台灣重要的雜糧作物之一。落花生含有豐富油脂(約40-54%)，其中油酸(Oleic acid，單元不飽和脂肪酸)及亞油酸(Linoleic acid，多元不飽和脂肪酸)佔了油脂 80% 以上，脂肪酸的飽和程度越高其化學性質亦相對越穩定，已有研究報告指出落花生提高油酸與亞油酸含量比 (Oleic : Linoleic acid ratio, O/L)有助於延. 長落花生保存期限。此外，亦有研究報告指出適當攝取含高油酸的食用油對於健康可能有正面幫助，因此自Norden 等人於 1987 年發表第一個高油酸品系後，將高油酸比性狀導入為目前落花生育種. Reaction, Real-time PCR)快速檢測基因上. 的單一核苷酸多型性 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)，捨棄傳統PCR系統. 需要等待膠體電泳的時間，藉由螢光放大的結果進行基因型鑑定。本文將介紹此系統的原理及流程，以及在高油酸落花生育種的應用現況。. 二、Taqman探針系統原理 Ta q m a n 探針是一組具專一性的 oligon ucleot id e，在 5 端位置連結一個. 螢光物質，在 3 端位置連結熄光物質 (quencher)，當此螢光物質與 quencher 距. 離夠接近時，會構成螢光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)的條件，使熄光物質吸收螢光物質. 所激發的能量，因此無法偵測到螢光物. 作者：戴宏宇助理研究員連絡電話：04-23317111. 10. 農業試驗所技術服務季刊．2017年06月．110期. 質的訊號。.

(2) 例，一組檢測 ahFAD2B 基因型的試驗試. Taqman 探針黏合處會被設計在正向引. 劑包含兩組專一性Taqman探針及一對引. 子 (forward primer) 與反向引子 (reverse p r i m e r ) 間，具有目標單一核苷酸多型. 性的核酸序列類 ( 圖一 )。PCR 反應開始時，在黏合 (annealing) 過程中，探針與兩引子與模板黏合，接著聚合酶開始延長引子，當延長至 Ta q ma n 探針黏合處時，由於聚合酶具有 5 端核酸外切酶. 農藝作物. 在 R e a l - t i m e P C R 設計流程中，. 子。兩組 Taqman 探針中，一組為野生型 ahFAD2B專一性探針，其5端所連結的螢. 光物質為 VIC；另一為突變型 ahFAD2B 的專一性探針，其5端所連結的螢光物質為 FAM。當Real-time PCR 進行時，如試驗個體帶有野生型 ahFAD2B同結合基因. (exonuclease)的活性，能將 Taqman 探針. 型，只會有 VIC 的螢光訊號被放大，在. 降解。此時螢光物質與熄光物質分離，. 圖二中為紅點；如試驗個體帶有突變型. 不再具有螢光共振能量轉移的條件，因. ahFAD2B的同結合基因型，僅有 FAM 的. 此得以偵測螢光物質的能量(螢光物質發. 螢光訊號被放大，在圖二中為藍點；如. 光 )，當 PCR 結束時，每一循環所偵測的. 試驗個體為異結合基因型，則FAM與VIC. 螢光物質訊號積累量為目標DNA序列的. 的螢光訊號會同時被放大，在圖二中為. 放大量。. 綠點。目前本研究室已經成功以Taqman. 三、以Taqman探針系統進行高油酸比落花生基因型鑑定. 探針系統進行高油酸比落花生基因型鑑定，以選拔個體及推進育種世代。. 落花生高油酸比性狀由 ahFAD2A及ahFAD2B兩基因共同. 控制，野生型與突變型ahFAD2A 於起始密碼子算起第 448 個核苷酸位點存在一個 S N P ，野生型 a h FAD2A 於此位點的基因型為 G，而突變型 ahFAD2A 於此位點. 的基因型為 A；而野生型與突變型ahFAD2B的差異於起始密碼子算起第441個及第442核苷酸位點間存在單一核苷酸插入，突變型 ahFAD2B 於此位點有一個 A 核苷. 酸插入。藉由上述 SNP，設計專一性Taqman探針進行高油酸比落花生基因型鑑定。以ahFAD2B為. 圖一、Taqman探針系統原理 (Koch, 2004)。. 農業試驗所技術服務季刊．2017年06月．110期. 11.

(3) 農藝作物. 四、結論分子標誌輔助選種已經在育種上被廣泛利用，但使用分子標誌進行基因型鑑定時，因膠體電泳需進行膠體製備與 PCR 產物泳動才能完成分析，花費大量. 人力及時間成本，且有可能因酶切不完全、PCR產物濃度、染色及照相效果影響判讀(圖三)，Taqman探針系統以螢光訊號判定來進行SNP的基因型鑑定，能省下過往CAPS及dCAPS基因型鑑定中等待酵素酶切及膠體電泳所花費的時間。此外，目圖二、ahFAD2B基因型鑑定之結果。. 前Taqman 探針系統等SNP 基因型分析平台單位成本亦隨著技術發展下降，本研究室亦證明此系統可順利應用於多倍體作物之基因型鑑定，提升篩選雜交後代通量，有助於分子育種工作發展。. 五、參考文獻 Chu Y, Holbrook CC and Ozias-Akins P. 2009. Crop Sci. 49: 2029-2036. Koch, W. H. 2004. Nat Rev Drug Discov, 3(9), 749–761. Mienie, C. M. S. and Pretorius, A. E. 2013. Afr. J. Biotechnol. 12(27): 4283-4289. Norden, A. J., Gorbet, D. W., Knauft, D. A., & Young, C. T. (1987). Peanut Sci. 14(1): 圖三、ahFAD2B的CAPS分子標誌。. 12. 農業試驗所技術服務季刊．2017年06月．110期. 7–11..

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