行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
草綠色鏈球菌之
groEL
基因定序與臨床應用(2/2)
Sequencing of groEL genes of viridans group streptococci and
application on species identification
計畫編號:
NSC 90-2320-B-002-188
執行期限:
90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主持人:鄧麗珍 國立台灣大學醫學院 醫事技術學系
計畫參與人員:陳品妏 國立台灣大學醫學院 醫事技術學系
一、中英文摘要 草 綠 色 鏈 球 菌 ( viridans group streptococci)為人體口腔內之正常菌叢, 但卻也是齲齒、感染性心內膜炎、敗血症 及許多深部組織嚴重感染之重要病原菌。 草 綠 色 鏈 球 菌 是 一 群 相 當 異 質 (heterogeneous)的細菌,依據 16S rRNA 基因序列將草綠色鏈球菌分為 5 群:the milleri (anginosus) group, the mitis group, the mutans group, the salivarius and the bovis group。由於不同菌種之感 染部位、致病性、抗藥性均有差異,但在 臨床鑑定上並沒有一套很簡易且準確的方 法,常造成困擾。因此利用分生方法發展 快速鑑定方法一直是學者的目標。本計劃 已完成四株 ATCC 菌種groESL基因全長定 序,及六株 ATCC 菌種groESL 基因近乎全 長定序。且分析各草綠色鏈球菌之間的 groESL 基因親屬遠近關係,並發現 groES 與groEL 之間的 spacer 序列可作為草綠色 鏈球菌的快速區分方法(已發表於 J Clin Microbiol 40:3172-3178) (如附件)。 關鍵詞:草綠色鏈球菌、groESL 基因、序 列分析、快速鑑定 Abstr actViridans group streptococci (VGS) currently encompass 20 species, which are members of the normal mouth flora and are a major cause of endocarditis or other diseases.
Classification depends on a combination of features including pattern of hemolysis observed on blood agar plates, antigenic composition, growth characteristics, biochemical reactions, and more recently, genetic analysis. On the basis of 16S rRNA sequence homology, these bacteria are categorized in five groups: the milleri (anginosus) group, the mitis group, the mutans group, the salivarius and the bovis group. No single system of classification suffices for the identification of these heterogeneous organisms. The groESL genes
(also known as cpn10/60), is ubiquitous and highly conserved among bacteria. In this study, the full-length sequences of groESL
genes (cpn10/60) from Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, and Streptococcus sanguis, and the near full-length sequence of
the groESL genes of Streptococcus intermedius, Streptococcus bovis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, and Streptococcus salivarius were determined. Phylogenetic
analysis of groES and groEL genes yielded
evolutionary trees similar to the tree constructed with the 16S rDNA. Intraspecies variation of the spacer for some species was minimal on clinical isolates. The groESL
sequence data provide an additional parameter for viridans streptococcal species identification. (published on: J Clin Microbiol 40:3172-3178)
Keywor ds: viridans group streptococci,
groESL genes, sequencing
二、緣由與目的 草綠色鏈球菌為人體口腔中主要的正 常菌群(normal flora),但也是亞急性細 菌性心內膜炎、菌血症、及許多深部組織 嚴重感染之重要病原菌(8,9)。草綠色鏈球菌 是一群相當異質(heterogeneous)的細菌, 至少有 20 種以上的菌種(species),沒有 單一系統可以來分類草綠色鏈球菌。一般 依照菌落生長特徵、在血液培養基的溶血 型式、細胞壁抗原組成、生化反應 (13, 18, 53) 和 最 近 發 展 的 分 子 生 物 學 方 法 , 如 DNA-DNA hybridization 、 DNA-rRNA hybridization和 small submit (16S) rRNA 基 因序列等來分類。依據核醣體核醣核酸基 因(16S rRNA 基因)序列可將草綠色鏈球 菌分成 4 群(6, 30),此分類為大部分學者所接
受。包括 the anginosus group,其中包含 S.
anginosus、S. constellatus 及 S. intermedius;
the mitis group,其中包含 S. sanguis、S.
parasanguis、S. gordonii、S. oralis、S. mitis
及 S. pneumoniae;the mutans group,菌種 主要有 S. mutans、S. criceti、S. ratti 及 S.
sobrinus;the salivarius group,其中包含 S. salivarius 、 S. thermophilus 及 S. vestibularis。在 mitis group 中常見的致病
菌 — 肺 炎 鏈 球 菌 ( Streptococcus
pneumoniae),雖然其生長特徵顯然不同
於其它草綠色鏈球菌,但在 16S rRNA 基因 層面上(genetic level)和 S. oralis、S. mitis
非常相似。因此, S. pneumoniae 並不歸於 草綠色鏈球菌。此外,也有人把 S. mitis
group 細分成兩群—S. sanguis group 和 S.
mitis group。草綠色鏈球菌不同菌種間的生
化特性、抗藥性及引起的疾病並不太相 同,例如,S. mitis group 中的 S. sanguis、
S. gordonii和 S. oralis 易引起感染性心內膜
炎(14), 也 易 在 牙 齒 形 成 牙 斑 ( dental
plaque)。S. mutans 最易引起齲齒。The anginosus group (或稱為 milleri group)易引 起膿瘍,其中 S. intermedius 易引起腦、肝 膿瘍,S. anginosus 易在泌尿生殖道發現(19, 52)。此外,近 10 年來,草綠色鏈球菌對青 黴素(penicillin)的抗藥性也逐漸增加中(11, 47),尤其以 S. mitis 和 S. oralis 最多。因此, 無論是探討致病因子、流行病學或臨床的 治療方面,正確的菌種鑑定是有意義且必 要的,尤其在感染性心內膜炎的復發以及 評估血液培養陽性(positive blood cultures) 對病人的影響均很重要 (11) 。近年來草綠 色鏈球菌雖然已有較清楚的分類,但是在 臨床實驗室的檢驗方法仍然相當混亂,經 常會碰到很難鑑定的菌株。臨床上草綠色 鏈球菌臨床的菌種鑑定方法,仍以傳統試 驗為標準(5, 53),但所需時間極長,並不實 際。因此許多實驗室利用快速鑑定(4)或自動
化鑑定系統,例如 API 20S、API Rapid ID 32 Strep(bioMérieux-Vitek Inc. )、Vitek GPI card、MicroScan GP 等。API Rapid ID 32 Strep由 32 種試驗(tests)組成,接種濃度 McFarlend No.4的菌液後,4 小時判讀,此 系統的資料庫(database)較大,也包含一 些新近命名的草綠色鏈球菌,如 S. gordonii 和 S. oralis(32),操作簡單快速;但是用在草 綠色鏈球菌上,卻經常有下列問題:第一,
有些細菌會因生化特性的改變(phenotype shifts)導致重複試驗有不同結果,而無法 鑑定出正確的菌種(46)。第二,相同的草綠 色鏈球菌菌種,可能會有不同的生化特性 表現,造成鑑定上的困難(5, 32)。第三,命名 系統的變更,例如 S. milleri group 中的 3 個菌種,在 1991 年才有正式的命名及特徵 描述為大家所接受(50, 54);S. mitis group 中
的 S. sanguis、S. mitis 及 S. oralis 在 1989 年有更新的特徵描述(32);加上歐美系統在
S. milleri group及 S. mitis group 命名意見的
不同,近年來又有許多菌種陸續發現及命 名,細菌特徵的更新不能適時出現在資料 庫,更造成鑑定上的複雜性。根據大規模 的研究調查,API Rapid ID 32 Strep 是鑑定 正 確 率 較 高 的 商 業 化 產 品 , 正 確 率 約 80%,其餘 20%為鑑定錯誤或鑑定不出來 的菌株,其中以 S. mitis group 和 S. milleri group錯誤率較高(3, 20, 27, 31)。有鑑於此,近 年來,有許多替代方法被發表,例如,菌 體脂肪酸(cellular fatty acids)分析(12),蛋
白質電泳(SDS-PAGE)分型、PCR 或去 氧核醣核酸雜交(2, 7, 17, 21, 26, 31,38, 41, 42)、或
利用 16S rRNA 基因來鑑定(26, 29, 33, 39, 40, 41, 51)。熱刺激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)
普遍存在於細菌以至於人類,當細菌遭遇 環境壓力下,如熱刺激、養份不足、毒素 等,熱刺激蛋白會大量表現,統稱為壓力 蛋白(stress proteins) (16)。傳統上,依據 分子量的不同,壓力蛋白分為 5 群(16)(five families)—HSP90(包含 HtpG)、HSP70 (包含 DnaK)、HSP60(包含 GroEL 和 GroES)、small HSPs(HSPs 15-30)和 other
HSPs(包含 DnaJ 和 GrpE);其中,HSP60 又 被 稱 為 chaperonins ( cpns, cpn60 和 cpn10),它和蛋白質的穩定性有關。groEL 基因也被發現與核醣體核醣核酸基因有著 類似的特性,在各生物間,例如細菌、真 菌、以至於哺乳動物,都有部分高度相似 性 ( highly conserved ) 及 部 分 變 異 性 (variable)的區域(15, 49),相似性程度比 16S rRNA基因稍低,也可當作分類或鑑定的工 具(34,35,36)。在 1989 年,有學者以片段的 65 kDa 分 枝 桿 菌 抗 原 基 因 ( 65 kDa mycobacterial antigen gene, groEL)當作探
針(probe)來鑑定生長緩慢的分枝桿菌 (Mycobacterium species)(25, 37)。1996 年,
Goh 等人以片段 groEL 基因當作探針,進 行點漬雜交法(dot blot hybridization),用 來鑑定葡萄球菌(Staphylococcus species) (23, 24),1998 年應用於鑑定 Streptococcus iniae(22),結果具有相當高的準確性。因此, 本計劃也想藉由 groEL 基因層面來分析各 草綠色鏈球菌之間的親屬遠近關係,並發 展出草綠色鏈球菌的快速鑑定方法。根據 已發表細菌的 groEL 基因相似性的序列, 設計出一對引子(primers)—GroEL-F 和 GroEL-R,對草綠色鏈球菌進行 PCR 反 應,得到 S. gordonii 之片段 groEL 基因, 約 575 base pairs(bp)(1)。再根據此片段基 因 序 列 設 計 出 另 一 對 引 子— Gor-2F 和 Gor-2R進行 PCR 反應,而製備出其它大部 分草綠色鏈球菌之片段 groEL 基因進行比 對(1)。本計劃藉由已知的片段 groEL 基因 序列去選殖整段 groESL 基因,分析基因序 列構造,探討菌種間演化關係,並應用於
臨床上快速鑑定。
三、結果
LA-PCR. 利 用 LA PCR in vitro
cloning 的方法,接上適當的 linker,進行 草綠色鏈球菌四株 ATCC 參考菌株︰S.
anginosus、S. constellatus、S. gordonii 與 S.
sanguis 之 groESL 全長基因選殖及定序。
得到groESL 基因全長序列。
Sequencing.已完成四株 ATCC 草綠色
鏈球菌 S. anginosus、S. constellatus、S.
gordonii 與 S. sanguis 的完整(full-length) groESL 序列,及六株 ATCC 草綠色鏈球菌 groESL 基因近乎全長序列。完整(full-length) groESL 序列均包括groES (282-288 bp)、 spacer (15 至 111 bp)、與 groEL (1,623 bp) 。鏈球菌的groESL 基因序列經由比對 後,發現與其他革蘭氏陽性細菌類似,在 啟動子區域有調控基因序列-CIRCE。在
groES 與 groEL 之間有一段 spacer 的區
域,各個菌種之間的長度不盡相同。 而在
S. gordonii groESL 基因後面有長的反重複
序列 ( inverted repeat, IR ),可能為基因 轉 錄 停 止 訊 號 (rho-independent transcriptional terminator ) 。
Nucleotide sequence accession number s. The nucleotide sequences of
groESL genes determined in this study were
deposited in the GenBank sequence database. The accession numbers for the full-length
groESL genes are: S. anginosus, AF378195; S. constellatus, AF378196; S. gordonii,
AF338228; and S. sanguis, AF378197. And
the accession numbers for the nearly full-length groESL genes are: S. bovis,
AF389514; S. intermedius, AF389515; S. mitis, AF417589; S. mutans, AF389516; S. oralis, AY38047; and S. salivarius,
AF389517.
Phylogenetic r elationships.分別分析鏈
球菌的groES、groEL 基因的分子演化樹狀
圖。結果如圖一。
圖一、草綠色鏈球菌 groESL 基因演化關
係。(A) GroES (B) GroEL
四、討論
本計劃已完成四株 ATCC 草綠色鏈球 菌 S. anginosus、S. constellatus、S. gordonii 與 S. sanguis 的完整(full-length) groESL 序 列,及六株 ATCC 草綠色鏈球菌 groESL 基因近乎全長序列完成。經比對後, 草綠 色鏈球菌 groESL 基因類似其它革蘭氏陽 性細菌的 groESL 基因或 dnaK 基因,啟動 子區域有類似σ 32 的 DNA 序列,並有
inverted repeat (IR) 結 構 , 其 為 TTAGCACTC-N9-GAGTGCTAA 。此結構
稱為 CIRCE(controlling inverted repeat of chaperone expression),在非熱刺激的情形
下,有 repressor 結合上 IR,可以抑制 dnaK 或 groESL 的表現。 在 GroEL 蛋白質尾端,革蘭氏陰性細 菌 普 遍 存 在 許 多 Methionine ( M ) 和 Glycine(G)這 2 種胺基酸,且存在 GGM 3個胺基酸的重覆現象(GGM repeat)。但 革蘭氏陽性細菌比較不一樣,S. epidermidis GroEL 蛋 白 質 尾 端 胺 基 酸 序 列 為 PGMGGMPGMM , S. pyogenes 為 PGMMGGF , 而 S. gordonii 為 PSMMGGMM。 GroES 與 GroEL 間有一小段序列,稱 為 spacer。Spacer 的長度與序列似乎與菌種 有關。我們已測試一些臨床菌株,大致上 均與參考菌株的結果符合。只有 S. mitis 與 S. oralis仍無法以 spacer 區分。 五、成果自評 (1). LA-PCR:以 LA-PCR 法,我們順利完 成四個 species 的 groESL 基因全長之 sequencing。此部份實驗並不容易。除 了 DNA 品質要很好,也要有一點運氣。 (2). 序列分析:完成十個 species 的 groESL 基因之 sequencing。 (3). 探討臨床菌株groESL基因變異情形, 發現均有菌種內相當保守性及不同菌 種間之差異性。 (4) 探討groESL基因演化關係,提供菌種 間演化關係另一參考。 (5). 設計快速鑑定方法。 註︰(1)至(4)的結果已發表於 2002 年 9 月 Journal of Clinical Microbiology 40 (9): 3172-3178.
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