• 沒有找到結果。

非小細胞肺癌組織中異常表現的KIAA0751蛋白質是否涉及癌化過程之研究

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "非小細胞肺癌組織中異常表現的KIAA0751蛋白質是否涉及癌化過程之研究"

Copied!
7
0
0

加載中.... (立即查看全文)

全文

(1)

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

非小細胞肺癌組織中異常表現的KIAA0751 蛋白質是否涉及

癌化過程之研究

計畫類別:個別型計畫

計畫編號:NSC93-2320-B-039-052

執行期間:93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日

計畫主持人:何恆堅

共同主持人:許南榮

葉坤土

計畫參與人員:詹琇雯

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交):精簡報告

處理方式:除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列

管計畫及下列情形者外,得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權,□一年□二年後可公開查詢

執行單位:中國醫藥大學醫學研究所

95

12

16 日

(2)

前言

我們以九個非小細胞肺癌病人為研究對象進行 differential display,從複製(amplified)出來 的 cDNA 片段(fragments)當中,挑選了某些 cDNA 片段做鑑定(identification),這些 cDNA 片 段在非癌組織與肺癌組織中的表現,有非常明顯的差異。其中一種 cDNA 片段定序後用 BLAST 比對相似性(homology),結果發現這段長度 224 bp 的 cDNA 片段,除了兩端的 primer 序列外,其餘的 195 bp 序列與編譯(encoded)人類 KIAA0751 protein 的 cDNA 有 100%之相似 性。

研究目的

探討KIAA0751 protein 在轉殖小鼠(transgenic mice)的肺臟過度表現,是否會誘發肺癌產 生。

文獻探討

利用 BLAST 進行序列比對,結果發現 KIAA0751 protein 與 rat Rim2 protein 有 83%的 相似性,與 mouse Rim2 protein 也有 75%的相似性﹔Rim 代表 Rab3 interacting molecule,第 一篇關於 rat Rim2 protein 的研究報告是由 Südhof 等人發表於 2000 年 J. Biol. Chem.期刊 (1),在這篇報告中指出:一、Rim2 protein 可以與 Rab3A 和 Rab3C 結合,參與 neurotransmitter release,此點與 rat Rim1 protein 類似(2)﹔二、KIAA0751 protein 就是 human homolog of rat Rim2 protein。日本學者 Seino 等人也發表研究報告指出 Rim2 protein 與 cAMP-GEFII 結合, 參與胰臟細胞分泌 insulin (3, 4)﹔他們還進一步研究發現 Rim2 protein 可以和 Piccolo 結合 形成 heterodimer (5)。根據這些結果,我們可以推測 Rim2 protein 在不同組織中,藉著與不同 的 interacting protein(s)結合,參與某些特定物質的分泌。

References.

1. Wang, Y, Sugita, S, and Südhof, T. C. The RIM/NIM family of neuronal C2 domain proteins. Interactions with Rab3 and a new class of Src homology 3 domain proteins. (2000) J. Biol. Chem. 275, 20033-20044.

2. Wang, Y., Okamoto, M., Schmitz, F., Hofmann, K., and Südhof, T. C. Rim is a putative Rab3 effector in regulating synapticvesicle fusion. (1997) Nature 388, 593-598.

3. Ozaki, N., Shibasaki, T., Kashima, Y., Miki, T., Takahashi, K., Ueno, H., Sunaga, Y., Yano, H., Matsuura, Y., Iwanaga, T., Takai, Y., and Seino, S. cAMPGEFII is a direct target of cAMP in regulated exocytosis. (2000) Nat. Cell Biol. 2, 805-811.

4. Kashima, Y., Miki, T., Shibasaki, T., Ozaki, N., Miyazaki, M., Yano, H., and Seino, S. Critical role of cAMP-GEFII‧Rim2 complex in incretinpotentiated insulin secretion. (2001) J. Biol. Chem. 276, 46046-46053. 5. Fujimoto, K., Shibasaki, T., Yokoi, N., Kashima, Y., Matsumoto, M., Sasaki, T., Tajima, N., Iwanaga, T., and

Seino, S. Piccolo, a Ca2+sensor in pancreatic cells. Involvement of cAMPGEFII·Rim2·Piccolo complex in

(3)

研究方法:轉殖小鼠製備

(1) Promoter 之選擇:要讓 transgene 在轉殖小鼠的肺臟專一性表現,目前較常用的 promoter 為 murine CCSP (Clara cell secretory protein)。Ray 等人所發表的研究報告指出 0.8-kb mCCSP promoter 只有在肺臟有活性,而在其它器官則無(1, 2),因此本實驗選擇 0.8-kb mCCSP promoter 來進行。

References.

1. Ray, M. K., Magdaleno, S., Finegold, M. J., and DeMayo, F. J. (1995) Cis-acting elements involved in the regulation of mouse Clara-cell specific 10kDa protein gene. J. Biol. Chem. 270, 2689–2694.

2. Ray, M. K., Chen, C. Y., Schwartz, R. J., and DeMayo, F. J. (1996) Transcriptional regulation of a mouse Clara cell-specific protein (mCC10) gene by the NKx transcription factor family members thyroid transcription factor 1 and cardiac muscle-specific homeobox protein (CSX). Mol. Cell. Biol. 16, 2056–2604.

(2) Vector:本實驗室已將 mCCSP promoter 構築在 vector pmCCSP-BIC 上,Map 如圖一所示 (IRES:Internal Ribosome Entry Site)。

圖一

(3) Transgene:在肺癌組織中,KIAA0751 protein 的 cDNA 有不同 isoforms,有些 isoforms 的 exon 3 因 splicing 去除,使得 exon 2 與 exon 4 連結在一起,此種類型的 isoform 普遍存 在於肺癌組織與肺癌細胞株中,所編譯的蛋白產物長度很短,因為進行 translation 時將遭 遇 in-frame termination codon (在 exon 4 內部),這種短型的 isoform 也是本實驗所欲構築的

(4)

transgene,所用的兩個 primers 分別位於 exon 2 與 exon 4 內﹔先將 PCR 產物接入 Sal I site (位於 mCCSP promoter 與 IRES 之間,圖一),如此所形成的重組質體(recombinant plasmid), 稱為 pmCCSP-A7C(S)-BIC﹔最後用限制酵素 Stu I 與 Afl II 將 transgene 切下來,用電泳展 開後回收。

(4) 轉殖小鼠產製與鑑定:回收的 transgene 將委託台灣動物科技研究所(ATIT)進行顯微注射 (microinjection),預計三個月後可開始進行轉殖小鼠鑑定。先剪取三週齡的小鼠尾部抽取 genomic DNA,進行 PCR 反應,sense primer 位於 mCCSP promoter 內,antisense primer 位於 transgene 內,PCR 產物長度約 600 bp,所獲得之轉殖小鼠為 F0 generation。

(5) F1 generation:每一隻轉殖小鼠(F0 generation)個別與非轉殖小鼠(wild-type non-transgenic mouse)交配繁殖,如此將會產生幾組不同的 founder lines (F1 generation)﹔在小鼠三週齡時 作鑑定,方法與上述(4)相同,去除非轉殖小鼠。

結果與討論

(1) Transgene 回收:以 pmCCSP-A7C(S)-BIC (colony 4)來回收 transgene,如圖二所示(Left lane, DNA ladder; right lane, transgene)。

圖二 (2) 小鼠產製:如下表所示,基因顯微注射後,計有 130 隻小鼠出生。 表 1、A7C(S)基因轉殖小鼠之顯微注射結果 批次 注射胚數 移置胚數 ET 鼠數 出生仔鼠數 分析鼠數 Tg 鼠數 備註 I 11 11 1 4 4 0 a II 50 49 2 22 12 0 a III 7 7 1 0 0 0 IV 94 84 3 28 26 1 V 197 176 6 54 54 3 VI 122 113 4 22 17 0

(5)

Total 481 440 17 130 97 4 (3) 轉殖小鼠鑑定:以存活的 97 隻小鼠為分析樣本,PCR 分析結果顯示,獲得基因轉殖小鼠 4 隻(編號 7-8、11-6、13-7、13-12),結果如圖三所示。 圖 1、A7C(S)基因轉殖小鼠 PCR 分析結果。(1:7-5;2:7-6;3:7-7;4:7-8;5: 11-5;6:11-6;7:11-7;8:13-7;9:13-8;10:13-9;11:13-10;12:13-11;13:13-12。) 圖三 (4) 轉殖小鼠之繁殖:在交配繁殖前,有一隻轉殖小鼠死亡(編號:13-7),因此剩下三隻轉殖 小鼠分別與非轉殖小鼠(wild-type non-transgenic mouse)交配。

編號 7-8(♀)轉殖小鼠:第一胎生 11 隻小鼠,其中兩隻為轉殖小鼠(F1 generation),如圖 四所示。

圖四

(6)

圖五

第二胎生 8 隻小鼠,仍然只有一隻為轉殖小鼠(編號 11-6-6),如圖六所示。

圖六

編號 13-12(♀)轉殖小鼠:第一胎生 8 隻小鼠,只有一隻為轉殖小鼠(編號 13-12-1),如 圖七所示。

(7)

圖七

在本實驗中,所遭遇的最大困難在於所產下的 F1 generation 中,轉殖小鼠的數量太少,此 點由編號 11-6 轉殖小鼠連續生兩胎即可看出。

參考文獻

相關文件

經濟合作與發展組織於二零零一年六月發表的《經濟展望》報告中指出,全球經濟增長

SF11310 張基晟 比較 Ipilimumab 加上 Etoposide/Platinum 與 Etoposide/Platinum

Conserved complexes are connected sub- graphs within the bacteria-yeast alignment graph, whose nodes represent orthologous protein pairs and edges represent conserved

在商學與管理學的領域中,電子化普遍應用於兩大範疇:一 是電子商務(E-Commerce),另一個為企業電子化(E-Business)。根 據資策會之 EC

二、 工作行為與活動:以工作過程、活動、行為來衡量績效,這

二、 軟式麵包與餐包(Soft bread and Buns). 此類麵包糖與油脂含量皆為麵粉用量的

Based on different characteristics of known protein-protein interaction sites, several methods have been proposed for predicting interface residues using a combination of

• 其認為使用「管制」一詞似乎意指政府單 方面的干涉非營利組織的活動,而使用規