共域及異域分布的田代氏黃芩及布烈氏黃芩族群與其土壤基質對根圈微生物組成的協同效應

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(1)國立臺灣師範大學理學院生命科學系碩士論文 Department of Life Science College of Science. National Taiwan Normal University Master’s Thesis. 共域及異域分布的田代氏黃芩及布烈氏黃芩族群與其土壤基質對根圈微生物組成的協同效應. Synergic effect of the sympatric and allopatric populations of Scutellaria tashiroi and S. playfairi and the soil substrates on the rhizosphere microbial composition. 江祖恩 Chiang, Tzu-En 指導教授：廖培鈞博士 Advisor: Liao, Pei-Chun, Ph.D. 中華民國 109 年 9 月 September 2020.

(2) 致謝這篇論文的完成首先要感謝廖培鈞老師對我的耐心指導與支持，不管是分析、Seminar 、壁報展、還是研究方向的建議都讓我可以更快的完成此文，當初雖然知道我有憂鬱症仍然願意收我當學生，在此獻上十二萬分的感謝。當然也還要感謝黃士穎老師對 R 語言的細心教導讓我獲益良多、也謝謝李勇毅老師當我的口委，能順序完成口試非常謝謝三位老師們的指教，也謝謝所有碩班課程老師們辛苦的教導。除了老師外也很謝謝實驗室大家的包容，碩一時的紹瑋學長、怡雯學姊、怡婷在學業上的討論與建議、敏心、欣蓓、明威、建棣學長口試前的各種意見、也另外特別謝謝秉宏學長帶我去東部採集、林試所實驗的幫助、meeting 時的訂餐、平日日常的各種疑難雜症解惑，雖然你選擇了先走一步這條路，但你對大家的好大家會永遠記得。另外特別感謝我憂鬱症嚴重時大家對我的各種包容與支持，不管是廖老師、同儕、諮商老師、還是休學時參加台大、師大的服務性社團而認識善良而溫暖的大家、一起出梯的台南、豐濱、恩惠、北埔、關山。一起在外住一年的余平、雅君、佩穎，當然還有親愛的國中朋友們、大學社團的摯友們沒有你們的心理支持與陪伴我一定無法走到現在。最後想說，一路走來得之於人者太多，出之於己者太少，雖然目前完成的論文老實說和自己原先讀碩班時的期許有段落差，但還是希望此篇論文可以對這個領域的發展起到一點棉薄之力，希望對看的各位有所幫助。也希望往後自己還能對學術圈有所貢獻。愛因斯坦：「人只有獻身於社會，才能找出那短暫而有風險的生命意義。」努力加油，貢獻地球 2020 年 9 月 10 日 By 江祖恩. i.

(3) 目錄. 中文摘要………………………………………………………iii 英文摘要………………………………………………………iv. 研究背景………………………………………………………1. 研究目的與問題………………………………………………5. 材料方法………………………………………………………6. 結果……………………………………………………………13. 討論……………………………………………………………31. 結論……………………………………………………………44. 參考文獻………………………………………………………45. ii.

(4) 摘要土壤微生物群落與植物有不同的交互作用，而土壤微生物群落的組成受到了寄主植物因子與環境因子的雙重選汰壓力影響。目前較缺乏的是對常見土壤微生物種類的生態功能理解，以及對單一微生物各分類位階在群落內的組成比例及生態功能探討。本研究我將利用兩種最近其分化的台灣特有種黃芩：布烈氏黃芩及田代氏黃芩之根圈微生物作為研究對象，四個不同地理區包含一個共域之樣點共五個樣點。利用 16SrRNA Metagenome 來評估根圈微生物群落的組成，並以操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)、綱為單位進行分析。本研究使用變異數分析(Analysis of variance, ANOVA)檢測各樣本間 α-多樣性是否有顯著差異、使用冗餘分析(redundancy analysis, RDA)檢測寄主植物、土壤基質、土壤顆粒大小對 β-多樣性的影響，並使用 Clamtest 找出微生物在不同寄主間、與不同環境間的分布情形。結果發現寄主植物可以顯著影響樣本間的 α-多樣性、土壤基質影響 β-多樣性所占比例最多。除此之外，本研究除了探討不同類群微生物的功能，也找到八種與兩種寄主植物都有密切相關的核心微生物，有助於我們更加了解植物與微生物間的交互作用。. 關鍵字：α-多樣性、β-多樣性、根圈微生物、核心微生物、操作分類單元. iii.

(5) Abstract There are some of different interactions between soil microbiomes community and plants. The composition of soil microbiomes are influenced by the double selection pressure form the factor of external environments and the factor of host-plants. The problem is we lack not only the knowledge of ecological function of common soil microbiomes but also the investigate to the ecological function of single phylum, class or single microbial species in the community now. Here, I will use soil rhizosphere microbiomes of two recently divergent plants, Scutellaria playfairii and S. tashiroi, and collect soil from four different geography areas including one sympatric area total five plots to understand the forces determining rhizosphere microbiome assembly. Use 16S rRNA metagenomes to evaluate the composition of rhizosphere microbiome, and use operational taxonomic unit and the level of class to analysis data. Using analysis of variance to detect the alpha diversity are significant difference or not between different samples. Using redundancy analysis to detect the influences of beta diversity by host-plant, substrate and soil particle size. Using clamtest to find out the distribution of microbes between different host-plants and different environment. The results that we find is the alpha diversity is significant influenced by host-plant. The substrate is the most influential factor to the beta diversity. Besides this, I also explore the different function between different kind of microbes. This study find eight different microbes that we call them “core plant microbes” which have closely related to our two research host-plants. It may be helpful for us to have more clearly understand to the interactions between plant and microbes.. Keywords: alpha diversity, beta diversity, rhizosphere microbiome, core plant microbes, operational taxonomic unit iv.

(6) 研究背景根圈微生物根圈微生物群落(rhizosphere microbiome)對於寄主植物健康與生長的重要性在先前的研究已被確認(Berg & Smalla, 2009)，根圈微生物群落的組成和功能受到生物性與非生物性因素的影響，例如：寄主植物根系的分泌物與土壤本身的物化特徵(Wu et al., 2017；Lange et al., 2014；Zhalnina et al., 2018；Wang et al., 2017)。雖然寄主植物對於共生菌的生存具有主導性，但共生菌也會受到來自環境的選汰壓力。比起土壤微生物，腸道微生物群落常常被用來探討寄主與微生物之間的共生關係以及共同演化，寄主內的腸道環境壓力也間接影響腸道微生物的多樣性(Chang et al., 2016；Huang et al., 2018；Tasnim et al., 2017；Zhou et al., 2016)。也就是說，腸道微生物受到雙重的選汰壓力：寄主本身受環境的選擇壓力以及腸道微生物受寄主體內選擇的壓力。同理於根圈微生物，除了受到環境的選汰壓力，根圈微生物也受到來自寄主植物的選汰壓力(Wu et al., 2017； Erlandon et al., 2018)，不同於腸道微生物的是根圈微生物位在寄主的體外，受到來自環境與寄主的選汰壓力大小可能與腸道微生物有所不同。. 由於微生物對於環境異質性有高度的敏感度，微生物群落的組成在小型土壤樣本內是多變的(Bailey et al., 2012；Smith et al., 2014；Bailey et al., 2013)，任何兩種土壤樣本的比較都只有小一部分微生物共同存在於兩樣本之中(DelgadoBaquerizo et al., 2018)。相對於植物群落消長的所需時間，土壤的細菌群落可以快速地發生顯著的改變(Jangid et al., 2011)，微生物之間的資源分配與競爭關係快速且反覆的發生和改變。同源微生物藉由群聚合作有助於彼此更容易獲得所需資源。代謝物依賴性的微生物在資源有限的情況與環境篩選的壓力下傾向於共生(Zelezniak et al., 2015)。但對類似資源需求的競爭卻也可能產生資源短缺的可能性。因此另一種相反的假說是：微生物在資源有限的情況與環境篩選的壓 1.

(7) 力下會使群落內的微生物在親源關係上呈現較發散的關係(Mayfield & Levine, 2010)。所以微生物群落內的組成在親緣關係上存在著權衡(Trade-off)的兩難 (Freilich et al., 2011)，微生物群落內物種組成的關鍵在於環境壓力影響了物種間的資源競爭或是合作關係。. 環境與寄主植物因子環境的篩選在決定群落成員中扮演較強力的角色(Mayfield & Levine, 2010； Cavender-Bares et al., 2006)，根據前人的研究我們對各種環境因素的了解日益增加，如土壤 PH 值的改變可能會影響細菌的相互作用模式與產物(Ratzke & Gore, 2018)、氣候乾燥會減少微生物的多樣性與豐度(Maestre et al., 2015)、養分供給對微生物的影響(Leff et al., 2015)……等。而寄主植物的影響如植物根部的分泌物可以影響土壤微生物的組成，並幫助土壤微生物吸收營養(Raaijmakers et al., 2009)、植物影響氨濃度的高低進而調節不同種類微生物的豐度(Trivedi et al., 2019)。近年來因 NGS 的技術發展，大量研究使用基因序列描述土壤細菌群落組成，藉此可了解哪些微生物在土壤中較為優勢，以及它們可能的生態功能 (Janssen, 2006)。. 生態功能目前較缺乏的是對許多常見土壤微生物種類的生態功能理解，許多研究探討的是植物和土壤與微生物 α 多樣性或是 β 多樣性的關係(Li et al., 2017；Curd et al., 2018)。棲息地的異質性通常可以支持更高的物種豐富度(Macarthur & Macarthur, 1961；Stein et al., 2014)，並可以使群落組成的變化增加(Whittaker, 1960；Chase & Leibold, 2003；Heino et al., 2014)，但較少著重在對單一門、綱、目或是單一微生物物種在群落內的生態功能探討或是它們與植物或是土壤的交互作用。先前的研究有探討所謂“植物核心微生物” (core plant. 2.

(8) microbiome) (Lundberg et al., 2012；Schlaeppi et al., 2013；Pfeiffer et al., 2016)，這些微生物在其他的研究被認為是對於寄主植物的生長、抑制病原體、提高寄主植物的耐受性是有所助益的。例如：變形菌門中的 Polaromonas 具有固氮功能、放射菌門中的 Actinomycetales 則有抑制病源體的功能。本研究將會就分析結果與前人的研究進行比較，以期也能夠發現對於寄主植物有幫助的“植物核心微生物”。. 選用寄主植物物種本研究選用的物種為台灣兩種特有種黃芩─田代氏黃芩(Scutellaria tashiroi Hayata)與布烈氏黃芩(Scutellaria playfairi Kudo)，以兩物種之根圈土壤微生物作為研究對象。在先前對分布在台灣的黃芩研究中發現，更新世間冰期與冰河期的周期性氣候因子改變、以及兩物種在生物地理上的擴張、天擇作用的影響可以共同解釋台灣特有種黃芩的多樣性(Chiang,Huang & Liao, 2012；Huang et al., 2017)。本研究使的兩個物種─田代氏黃芩與布烈氏黃芩的分化時間從葉綠體 DNA 的分析結果大約在更新世晚期的二十萬年前(Chiang et al., 2012)或微衛星標記分析(microsatellite markers)的結果小於 15 萬年前(Huang et al., 2017)。較大尺度的研究顯示，氣候因子與地理的歷史因子可以解釋東亞列島植物的多樣性、也反映了近期生態和演化過程之間的交互作用(Kubota et al., 2011；Kubota et al., 2014；Kubota et al., 2014)。田代氏黃芩分布於台灣東部低海拔山區與河谷地以及台灣東南部的外島蘭嶼；布烈氏黃芩分布於台灣南部與東部的低海拔山區。兩物種於台灣東部、東南部山區有共域(Sympatric)的情況。兩物種擁有不同的擴散史，並受到局部選汰壓力影響、也因環境異質性而保持著適應性分岐 (Chiang et al., 2012；Huang et al., 2017)。野外實地觀察中也發現兩物種之分布區域中擁有不同的土壤基質(soil substrate)，在環境上有些許不同。因此本研究希望藉由這兩種最近期才分化的黃芩之根圈土壤微生物來探討土壤微生物群落內 3.

(9) 與群落之間的親緣關係結構、兩種黃芩間的土壤微生物群落是否有差異，目的為：想得知土壤微生物群落的組成是否可反映環境差異之程度、短期內分化的不同寄主植物間土壤微生物群落的組成是否有差異。. 4.

(10) 研究問題與目的本研究以田代氏黃芩與布烈氏黃芩的根圈土壤微生物進行量化分析，基於研究背景提出以下兩個問題。 (1) 哪種因素是造成根圈土壤微生物群落組成差異的主要因子？ (2) 不同的植物根圈土壤是否存在相同的微生物族群？. 此兩個研究問題主要目的為： (1) 分析兩種黃芩間土壤微生物群落組成差異。 (2) 分析不同地理區之間土壤微生物群落組成差異。 (3) 分析環境因子與寄主植物因子對兩種黃芩間土壤微生物群落組成影響。. 而根據以上問題，以及前人的研究成果(Schlaeppi et al., 2013)，我提出下列假說： (1) 環境因子對微生物群落組成的影響比寄主植物大：根據前人研究，較多的研究支持環境因子對微生物群落組成的影響比寄主植物大，且寄主植物的親緣關係遠近也會影響微生物群落組成的差異大小，本研究所選用的兩種寄主植物為親源關係近的物種，故推測本研究環境因子的影響較大。 (2) “植物核心微生物”的存在：根圈土壤中普遍存在對寄主植物有益的微生物，不會因為地理區域的不同而消失，且這類微生物在前人的研究是對寄主植物是有幫助的。推測本研究也可以找到對寄主植物有益的植物核心微生物。. 根據研究結果，我將探討各植物或各地點的土壤樣本的微生物生態功能。. 5.

(11) 材料方法採樣樣點本研究採樣的土壤樣本以土壤微生物之寄主植物物種來區分，田代氏黃芩土壤採樣地點為：花蓮太魯閣綠水步道旁(北緯 24.178，東經 121.512)、台東霧鹿公路旁(北緯 23.133，東經 121.120)、蘭嶼小天池旁(北緯 22.078，東經 121.510)；布烈氏黃芩之採樣點為：屏東霧台伊拉瀑布旁(北緯 22.740，東經 120.719)、台東霧鹿公路旁(北緯 23.133，東經 121.120)，包含四個不同地理區內的五個採樣點(圖 1)。每個樣點皆採集三個足量的土壤樣本(n=3)，總共有 15 個樣本。每個根圈土壤樣本由同一株黃芩寄主植株得來，故同一樣採樣點共採集三株黃芩。本研究採樣的兩種黃芩之族群皆為當地穩定族群，且棲地間環境特徵皆不同(表一)。兩物種於台東霧鹿樣點有共域分布的情況，兩物種土樣採樣點最近距離僅約一百公尺，但微環境有些許不同，而其餘樣點皆只有單一物種分布、各採樣點間環境也皆有差異，土壤分類根據行政院農業試驗所提供的土壤資料進行描述與分析 https://tssurgo.tari.gov.tw/Tssurgo/。本研究藉此採樣策略，利用兩種親緣關係近、分化時間短，且有共域分布和異域分布的寄主植物，來理解不同地理、不同寄主和不同環境條件下如何影響根圈微生物的群落結構。. 6.

(12) 圖 1 田代氏黃芩(Scutellaria tashiroi Hayata)與布烈氏黃芩(Scutellaria playfairi Kudo)的分布範圍與共域區(橘色)、各採樣點地點之示意圖。土壤採樣地點為：花蓮太魯閣綠水步道旁(北緯 24.178，東經 121.512)、台東霧鹿南迴公路旁(北緯 23.133，東經 121.120)、蘭嶼小天池旁(北緯 22.078，東經 121.510)、屏東霧台伊拉瀑布旁(北緯 22.740，東經 120.719)。. 表一採樣物種位置、海拔、土壤基質、氣候因子的資料。 Scutellaria playfairii Wutai. Scutellaria tashiroi. Wulu. Wulu. Lanyu. Taroko. Longitude (E). 120.718137 121.047112 121.047111 121.510169 121.509524. Latitude (N). 22.739569 23.165561. Altitude (m). 23.165562. 22.077472. 24.180075. 150. 428. 475. 775. 775. Substrate. Shale. Shale. Shale. Tempa. 24.5. 10.6. 11.5. 18.7. 14.8. Ann Mean Tempb. 18.1. 18.3. 18.3. 23.8. 17.8. c. 3869. 2039. 2039. 2661. 2286. Ann Mean Precp a. 採樣時的氣溫(°C);. b. 年均溫(°C);. c. 年平均降雨量(mm). 7. Agglomerate Limestone.

(13) 各樣點環境簡述而各採集地地區情況為：霧鹿的黃芩採樣點皆位於台 20 線南迴公路旁靠近山壁一側，公路另一側鄰卑南溪，兩物種採樣點中間隔著五十公尺的舊公路隧道。田代氏黃芩採樣點位於背陽面，單一樣點間坡度差異大，有的位於緩坡、有的生長於被防坍方護網蓋住的陡坡中，採集植株離地面高度約為五十到一百五十公分左右，平均土壤深度為十五公分深，土壤內有些許石塊分布，土質分類部分為石質土、部分為裸岩及崩崖區，緩坡地表被落葉與草本植物所覆蓋、陡坡的地表面多為草本植物與蘚苔類、裸露的面積較高且採集時土表有大群馬陸棲息；布烈氏黃芩採樣點同樣位於背陽面，介在公路與峭壁間的狹小平地上，比起田代氏黃芩採樣點更靠近河岸邊，採集植株位於平地上，平均土壤深度為十公分，土壤相對較稀少、土質分類皆為石質土，土壤表面被稀疏的草本植物所覆蓋。太魯閣三個田代氏黃芩採樣點則是位在綠水步道旁靠近山壁一側，步道另一側即是懸崖。生長於步道旁的木本植物陰暗處或是太陽無法直射處，坡度平緩土壤少而淺，土壤平均約十公分深且地表被大小不一的石塊與岩石、少許枯葉所覆蓋，土質為石質土與裸岩及崩崖，目標植株旁有小型草本植物、蕨類、蘚苔類。蘭嶼的三個田代氏黃芩採樣點在距離海邊僅三百公尺的一小型淡水池塘(小天池)旁，旱季有時池水會乾涸。蘭嶼本身為一座小島嶼，空氣溼度和鹽度相對其他樣點較高，土質為紅土及裸岩，與其他四個位於山區採樣點環境較不同，目標植株附近土壤表面也有草本植物覆蓋。霧台的布烈氏黃芩採樣點則是較深入山區的公路旁，生長在背陽面陰暗處且土壤深度較深，平均為十五到三十公分深，坡度平緩，土質為黃棕色板岩的石質土，目標植株附近也長有小型草本植物與蕨類混雜生長。. 採集方式在每個採樣點的研究目標物種植物地下部附近，利用農藝用鏟子挖掘土 8.

(14) 壤，採集植株下的根圈土壤三至五塊，大多樣本皆取深度小於 15 公分的根圈土壤，少部分樣點因土壤過少故採集至 20 公分深左右，每個土塊大小長度約五到十公分，鏟子在挖掘不同的樣本前會利用 70%濃度酒精清洗鏟子表面並擦拭乾淨避免殘存的土壤微生物汙染下一個樣本。每個土壤樣本皆包含目標物種植物的根圈(rhizosphere)土壤以及少部分無法排除之根部周圍土壤(bulk soil)。方法為採集植株連根拔起後進行搖動與抖動，搖動一段時間後仍附著於根部上的土壤定義為「根圈土壤」，採集過程也發現部分樣本植株根部與其他草本植物根部交纏且無法分離的情況，遇此情況會盡量不採集根部交纏的土壤避免土壤樣本受其他草本植物根部的影響。採集完的土壤第一時間就放進明保鮮袋中保存避免與外界空氣接觸。土壤樣本在運送過程中儲存在 RNAguardian (E-Bio, Taipei) 中，並放置於攝氏 4℃的冰桶中保存以降低微生物的生物活性。. 分子技術處理本研究透過 16S rRNA 宏觀基因組(16S rRNA metagenome)定量所有樣本根圈微生物的組成。根圈微生物 DNA 之萃取參考前人的研究(Sharma, John, Damgaard & Mcallister, 2013)，並利用引子(primers )27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 及 533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC3’)放大 V4 高度變異(hypervariable)的 16S rRNA 片段區，再使用 Roche GS FLX Titanium emPCR 套件進行 DNA 的檔案建構，並依照 Roche 製造商提供的說明來使用焦磷酸測序(pyrosequencing)的試劑和 Roche 454 FLX Titanium 儀器。並剔除短於 200 bps、具有 polyN 或是 polyA/T、或是質量總分小於排名百分之二十五的序列片段。且參考前人研究把序列大於 97%以上相同的序列定義為是相同的操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)(Stackebrandt & Goebel, 1994)，每一個操作分類單元(OTU)在分析中可以視作同一個微生物物種。每個 OTU 編碼都根據 SILVA 數據庫中進行註解(annotation)，所獲得的 16S rRNA. 9.

(15) 基因序列皆存入(deposited)於 NCBI 基因銀行(GenBank)中的根圈微生物元基因組(metagenome)生物樣本(biosample)，布烈氏黃芩的樣本登入號為 RS881263、田代氏黃芩的樣本登入號為 SAMN04158746。生物項目號碼為 PRJNA279212，登錄號碼為 SRX965751。. 樣本分析得到原始 OTU 樣本數據之後，首先利用 Excel 進行初步的 OTU 資料整理，我的分析主要分為兩種：第一種是以 OTU 為分類單位進行分析，第二種是以綱(class)為分類單位進行分析，以綱為分類單位在計算前參考相關研究先剔除豐度佔整體數據豐度比例小於 0.1%的綱以利後續分析(Lynch & Neufeld, 2015)。以 OTU 為分類單位首先計算 15 個樣本中的 OTU 豐度(abundance)、豐富度(species richness)，再利用 R 語言中的 VEGAN 指令包進行均勻度(species evenness)、香農多樣性指數(Shannon's diversity index)、辛普森指數(invers Simpson index, 1/D)、五個樣點內各自三個樣本間的標準差，並利用變異數分析 Analysis of variance (ANOVA)分析五個樣點間的 α 多樣性是否有顯著差異，如果有顯著差異會再利用 AGRICOLAE 指令包中的 TUKEY 檢定進行後測分析以確定確實有顯著差異(Papaioannou & Hsu, 1997)。而以綱為分類單位的部分也會計算 15 個樣本中的豐度、豐富度，同樣也利用 R 語言中的 VEGAN 指令包進行均勻度、香農多樣性指數、辛普森指數、五個樣點內各自樣本間的比較，也再利用 ANOVA 分析五個樣點間的 α 多樣性是否有顯著差異與 TUKEY 檢定進行後測分析。接下來繼續使用 R 語言分別對 OTU 類群與綱類群進行相似性分析 analysis of similarities (ANOSIM)檢測五個樣點間的差異是否大於樣本內的差異以利後續分析(Clarke, 1993)、確認之後再用多變量方差分析 permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)來檢測各樣點間微生物相是否有顯著差異(McArdle & Anderson, 2001)，利用 Bray-Curtis 方法進行 999 次模擬運. 10.

(16) 算計算多變量方差分析中的成對距離。接著再安裝 ADEGENET、 DEVTOOLS、FACTOEXTRA 指令包來使用 RDA 分析(redundancy analysis)各樣點間的關聯性，檢測兩種不同寄主植物間、不同土壤基質(substrate)，共分為沉積岩的頁岩(shale)、火成岩的集塊岩(agglomerate)、沉積岩的石灰岩(limestone) 三種、土壤顆粒大小(soil)，按照顆粒由大到小共分為砂土(sand)、壤土(silt)、黏土(clay)三種，對於土壤微生物群落的影響大小，以此來檢測土壤微生物群落的 β-多樣性差異是否可藉由寄主的不同或是環境差異(即土壤特性與土壤顆粒大小)來解釋。再利用 DAPC(discriminant analysis of principal components)檢測確認以五個樣點來分組是否為最佳分組、各樣點間的分群情況，篩選影響較大的 PC 軸進行分析。. 特定微生物討論而根據 DAPC 的分析結果還可得知影響 PC 軸較大的個別綱以及 OTU，接著使用 VEGAN 指令包內 CLAMTEST 的 CLAM 統計方法(Chazdon et al., 2011) 並使用絕對多數法則去定義在不同寄主植物中的專化微生物(specialist)、以及不同地理區之間的專化微生物，定義標準為該 OTU 與綱在單一寄主植物中的豐度佔整體豐度大於三分之二即為專化微生物，若非是單一寄主植物的專化微生物即是廣布型微生物(generalist)。以此標準期望找出兩種黃芩間的土壤微生物群落間的專化微生物、以及不同地理區之間是否有不同的專化微生物。並將分類結果顯示在兩群樣本皆豐富的族群也找出。得出結果後會進行論文探討，參考其他的研究以了解我們找出的微生物族群它們可能的生態功能。接下來利用 DAPC 與 CLAMTEST 的結果來找出以寄主作為分類標準的情況下哪些 OTU 以及哪些綱的微生物在不同寄主下的數量有顯著差異、哪些微生物是兩植物寄主下數量都穩定存在的廣布型微生物，判斷這些微生物是否為核心微生物的可能性。本研究也會針對在 DAPC 與 CLAMTEST 分析中都顯著較多的廣布型微生. 11.

(17) 物進行探討。以上分析結果的作圖除了使用 EXCEL 內建的作圖程式外、也使用了 R 語言各分析程式包內建的功能以及 GGPLOT2 程式包作圖。. 除了微生物的分析外，本研究所進行的環境因子分析也有採集五個採集地的土壤進行物理與化學性質的分析，但因為分析方法的限制，將會進行討論的方式放在討論內陳述。. 12.

(18) 結果本研究在分子生物處理的結果出來後，利用 EXCEL 初步整理 15 個樣本中讀取到的操作分類單元總共 9678 筆 OTU，首先進行其中豐度、物種豐富度、均勻度、香農多樣性的分析：豐度部分，豐度最高者為 18366、豐度最小者為 4076(圖 2)；物種豐富度則是介於 2883 到 511 之間(圖 3)；物種均勻度介於 0.916 到 0.844 之間(圖 4)；香農多樣性指數介於 7.121 到 5.710 之間(圖 5)。. OTU. 圖 2 15 個樣點各自的 OTU 豐度比較，X 軸為樣點、Y 軸為 OTU 讀數。布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。. 13.

(19) 物種數. 圖 3 15 個樣點各自的 OTU 物種豐富度比較，X 軸為樣點、Y 軸為微生物物種數。布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。. 圖 4 15 個樣點各自的均勻度比較，X 軸為樣點、Y 軸為均勻度指數。布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。. 14.

(20) 圖 5 15 個樣點各自的生物多樣性指數(Shannon-Wiener)比較，X 軸為樣點、Y 軸為多樣性指數。布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。以五個樣點為單位，三個樣本間的香農多樣性指數、辛普森指數、物種豐富度、物種均勻度的平均值和標準差之比較如(圖 6)所示。. 15.

(21) 圖 6 五個樣點間 OTU 的比較。圖(6)A 為香濃多樣性比較，圖(6)B 為辛普森指數的比較，圖(6)C 為物種豐富度，圖(6)D 為均勻度。X 軸皆為五樣點，布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。本研究 15 個樣本的根圈土壤微生物總共有 38 個門與其他未分類的類群、以綱為分類單位的結果得到 78 個綱與其他未知分類群的 OTU 並將它們定義為同一個分類群，總共 79 個綱分類群，為了有利於分析篩選，剔除豐度比例小於 0.1%的綱分類群後剩下 49 個綱的分類群。以綱為分類單位所得的豐度前三高者分別為 Alphaproteobacteria 總共有 40335 筆讀數、Acidobacteria 總共有 28161 筆讀數、Actinobacteria 總共有 13155 筆讀數。以五個樣點為單位，三個樣本間之豐富度、均勻度、香農多樣性指數、辛普森指數的平均值和標準差結果顯示於(圖 7)中。. 16.

(22) 圖 7 五個樣點間綱的比較。圖(7) A 為多樣性比較，圖(7) B 為辛普森指數的比較，圖(7) C 為物種豐富度，圖(7) D 為均勻度。X 軸皆為五樣點，布代表布烈氏黃芩，田代表田代氏黃芩。. 而 AVONA 的結果是：以 OTU 為分類單位的分析結果全部不顯著故不呈現於表中，以綱為分類單位的結果則是：寄主的影響對於香農多樣性指數 P 值與 F 值為：P=0.017、F=8.105，辛普森指數 P 值與 F 值為：P=0.011、F=9.862，均勻度 P 值與 F 值為：P=0.011、F=9.777(表二)，且進行 TUKEY 後測結果也顯著，只有豐富度是不顯著的，其 P 值與 F 值為：P=0.106、F=3.149。而豐富度的結果顯示出土壤基質有顯著影響，其 P 值與 F 值為：P=0.023、F=7.232 (表二)，只是 TUKEY 後測的結果卻無明顯分群。. 17.

(23) 表二以綱為分類單位的 AVONA 分析 Df. Sum Sq. Mean Sq. F-value. Pr(>F). Shannon host soil substrate Residuals. 1 2 1 10. 0.065 0.032 0.012 0.08. 0.065 0.016 0.012 0.008. 8.105 2.029 1.502. 0.017 0.182 0.249. Richness host soil substrate Residuals. 1 2 1 10. 5.878 2.889 13.5 18.667. 5.878 1.444 13.5 1.867. 3.149 0.774 7.232. 0.106 0.487. Invsimp host soil substrate Residuals. 1 2 1 10. 19.608 5.316 7.437 19.881. 19.608 2.658 7.437 1.988. 9.862 1.337 3.741. 0.011 0.306 0.082. Evenness host soil substrate Residuals. 1 2 1 10. 0.006 0.003 0.002 0.006. 0.006 0.001 0.002 0.0006. 9.777 2.176 3.394. 0.011 0.164 0.095. 0.023. 以 OTU 為分類類群進行的五樣點分析結果中，ANOSIM 相似性分析得到的 R 值為 0.393 且顯著 P 值為 0.0004(圖 8)；PERMANOVA 分析的結果為顯著 P 值為 0.001，代表樣本間差異確實大於樣本內差異(表三)；. 18.

(24) 圖 8 Anosim 相似性分析，結果顯示以 OTU 為單位的分群中，五個樣點間的差異顯著大於各樣點內的差異。. 表三以 OTU 為分群的 permanova 的分析結果，結果顯示樣本間差異大於樣本內差異。 Df. SumofSqs. F. R2. Pr(>F). Grp. 4. 1.866. 1.762. 0.413. 0.001. Residual. 10. 2.648. 0.587. 而在以綱為分類群的結果中，ANOSIM 相似性分析得到的 R 值為 0.206 且顯著 P 值為 0.0084(圖 9)，PERMANOVA 分析的結果為顯著 P 值為 0.015，代表以綱為分類群的結果中樣本間差異也大於樣本內差異(表四)。. 19.

(25) 圖 9 Anosim 相似性分析，結果顯示以綱為單位的分群中，五個樣點間的差異顯著大於各樣點內的差異。. 表四以綱為分群的 permanova 的分析結果，結果顯示樣本間差異大於樣本內差異。. Grp Residual. Df. SumsOfSqs. F. R2. Pr(>F). 4. 0.243. 1.623. 0.394. 0.015. 10. 0.374. 0.606. 接下來利用 RDA 分析的 OTU 分群與綱分群結果分別如(表五)、(表六)所示，結果顯示以 OTU 為分群中對土壤微生物族落組成影響大小由大到小分別為土壤基質因子可解釋 23.8%的原因、黃芩寄主因子可以解釋 10.6%的原因、土壤顆粒大小因子可解釋 7%的原因，剩下則有 58.7%的因子由這三項因子無法解釋；. 20.

(26) 表五以 OTU 為分群的 RDA 結果， Df. SumOfSqs. F. host. 1. 0.477. 1.801. 0.011. 0.106. substrate. 2. 1.074. 2.028. 0.001. 0.238. soil. 1. 0.315. 1.190. 0.202. 0.070. Residual. 10. 2.648. 0.587. 4.514. 1. total. Pr(>F) proportion. 以綱為分群中對土壤微生物族落組成影響大小由大到小分別為土壤基質因子可解釋 20.3%的原因、黃芩寄主因子可以解釋 11.3%的原因、土壤顆粒大小因子可解釋 7.7%的原因，剩下則有 60.8%的因子無法由這三項因子解釋。表六以綱為分群的 RDA 結果 Df. SumOfSqs. F. host substrate soil. 1 2 1. 0.070 0.126 0.048. 1.852 1.667 1.265. Residual total. 10. 0.377 0.620. Pr(>F) proportion 0.031 0.032 0.224. 0.113 0.203 0.077 0.608 1. 至於 DAPC 以 OTU 為分群的結果發現霧鹿兩個樣點不同寄主黃芩間的樣本有分群的現象並顯示 PC 軸的分群為五是最佳結果(圖 10)(圖 11)，15 個樣點以五大樣點分群的比例(圖 12)其中 OTU469、OTU3571、OTU6024、OTU7852 為顯著影響此分類結果的 OTU(圖 13)；. 21.

(27) 圖 10 以 OTU 為分類單位進行的 DAPC 分析，結果顯示分類群等於 5 時是較好的分法。. 圖 11 以 OTU 為單位的分群進行的 DAPC 分析 22.

(28) 圖 12 以 OTU 為分類單位進行的 DAPC 分析各樣本內的分類歸群. 23.

(29) 圖 13 以 OTU 為分類單位進行的 DAPC 分析判別對 PC 軸分群影響較大的 OTU，圖 A 為影響第一軸較大的 OTU，圖 B 為影響第二軸較大的 OTU。兩圖之 X 軸為不同的 OTU，Y 軸為對此 PC 軸分群的影響程度。. 以綱為分群的 DAPC 結果也顯示霧鹿兩個樣點不同寄主黃芩間的樣本有分群的現象、布烈氏黃芩在霧台的三個樣本土壤微生物族落相似度最高，PC 軸為三時的分群為最佳結果(圖 14)，田代氏黃芩在霧鹿的樣本間相似度最低(圖 15)， 15 個樣點以五大樣點分群的比例(圖 16)其中 Actinobacteria、 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Bacilli 為顯著影響此分類結果的綱(圖 17)。. 24.

(30) 圖 14 以綱為分類單位進行的 DAPC 分析各樣本內的分類歸群，結果顯示分類群等於 3 時是較好的分法。. 圖 15 以綱為分類單位進行的 DAPC 分析 25.

(31) 圖 16 以綱為分類單位進行的 DAPC 分析，為分類單位進行的 DAPC 分析各樣本內的分類歸群，X 軸為樣點，Y 軸為樣點內群落微生物的歸群。. 26.

(32) 圖 17 以綱為分類單位進行的 DAPC 分析判別對 PC 軸分群影響較大的綱，圖 A 為影響第一軸較大的綱，圖 B 為影響第二軸較大的綱。兩圖之 X 軸為不同的綱，Y 軸為對此 PC 軸分群的影響程度。. 至於 CLAMTEST 的結果以 OTU 為單位情況、不同植物寄主為分群的樣本間比較如下：總共有 1565 個 OTU 為廣布型微生物，615 個 OTU 在布烈氏黃芩為寄主植物的樣本裡較多，679 個在田代氏黃芩為寄主植物的樣本裡較多，剩下 6819 個 OTU 則是在不同寄主植物樣本間都稀少的族群(too rare)(圖 18)；至於以綱為分類單位、不同植物寄主為分群的樣本間比較結果如下：總共有 42 個綱為廣布型微生物類群，1 個綱在布烈氏黃芩較多，6 個綱在田代氏黃芩較多，而以綱為單位因為在分析前已剔除總數小於 0.1%豐度的鋼，故分析結果沒有稀少的族群(圖 19)。以不同環境進行的 CLAMTEST 樣本間比較則發現不同地理環境對比不同寄主植物下擁有更多的專化型微生物(圖 20)(圖 21)(圖 22)(圖 23)。以台灣本島比蘭嶼的 CLAMTEST 就發現有較多的專化型微生物(表八)(表九)，證實環境對微生物的影響大於寄主植物對微生物的影響。. 27.

(33) 圖 18 以 OTU 為分類單位，以寄主植物為分群進行的 Clamtest 分析。縱軸為布烈氏黃芩的 OTU 豐度，橫軸為田代氏黃芩的 OTU 豐度。. 圖 19 以綱為分類單位，寄主植物為分群進行的 Clamtest 分析。縱軸為布烈氏黃芩的綱豐度，橫軸為田代氏黃芩的綱豐度。. 28.

(34) 圖 20 以 OTU 為分類單位，台灣本島與外島為分群所進行的田代氏黃芩 Clamtest 分析。縱軸為霧鹿加上太魯閣的 OTU 豐度，橫軸為蘭嶼的 OTU 豐度。. 29.

(35) 圖 21 以綱為分類單位，台灣本島與外島為分群所進行的田代氏黃芩 Clamtest 分析。縱軸為霧鹿加上太魯閣的綱豐度，橫軸為蘭嶼的綱豐度。. 圖 22 以 OTU 為分類單位，霧台與霧鹿為分群進行布列氏黃芩 Clamtest 分析。縱軸為霧台三樣本的 OTU 豐度，橫軸為霧鹿三樣本的 OTU 豐度。. 圖 23 以綱為分類單位，霧台與霧鹿為分群進行布列氏黃芩 Clamtest 分析。縱軸為霧台三樣本的綱豐度，橫軸為霧鹿三樣本的綱豐度。 30.

(36) 討論取樣與分析策略本研究選取根圈細菌作為研究材料，主要是因為根圈是寄主植物與土壤微生物相互作用較頻繁之區塊，由於與植物共生的真菌所形成的菌根(mycorrhiza) 已經有相當多的研究(Akiyama et al., 2005)，而相對較外圍的土壤微生物先前的研究將與植物較無關的外部土壤作為對照組(Schlaeppi et al., 2013)，雖然僅限根圈土壤在採集時蒐集土壤難度增加，但由於與寄主植物相互作用較多的各類微生物才是本研究著重的重點，如：植物根的分泌物也會影響根圈微生物的組成、部分微生物具有幫助寄主植物抑制病原體的功能……等。因此試著藉由此取樣排除前人研究已確認為共生關係的真菌、以及環境普遍存在與寄主植物較無關的微生物。. 至於本研究之分析選用 OTU 與綱進行分析，不選用門的理由為因為以門為分類單位進行某些分析將會有分類母數過少的問題，不過因為前人研究有些還是以門為單位進行分析，故稍後的討論依然會使用。. 初步分析結果在一開始的 OTU 資料整理就發現，15 個樣本間豐度差異不小，豐度最高者為霧鹿布烈氏黃芩的其中之一的樣本有 18366 筆 OTU 讀數，而豐度最小者是同樣也位在霧鹿的田代氏黃芩其中之一的樣本只有 4076 筆數據(圖 2)，然而在物種豐富度上結果卻顯示豐度最少的樣本其物種豐富度卻是最高的，另外值得注意的是太魯閣田代氏黃芩的其中一個樣本不管是豐度還是物種豐富度皆低(圖 3)，而在均勻度(圖 4)以及香農多樣性指數(圖 5)上 15 個樣本的差異就相對比豐度、物種豐富度來的小，並且在以五個樣點為基礎的比較中(圖 6)，使用. 31.

(37) AVONA 分析以及 TUKEY 分析的結果顯示了樣點間的差異都是不顯著的。在以綱為分類單位的五樣點物種豐富度、均勻度、香農多樣性指數、辛普森指數比較中(圖 7)則是發現以黃芩物種作為區分的結果在均勻度、香農多樣性指數、辛普森指數是有顯著差異的(表二)，雖然在綱豐富度中土壤基質 AVONA 的結果有顯著但進行 TUKEY 後測結果為不顯著。顯示了在檢測環境與寄主對 α 多樣性的影響分析中，只有寄主植物差異才會對 α 多樣性有顯著的影響，在先前對玉米根圈微生物的研究中發現，遺傳差異可以解釋相對豐度的差異 (Walters et al., 2018)。RDA 的結果顯示不管是環境因子還是寄主因子都對土壤微生物的群落組成有顯著影響，且土壤基質對於土壤微生物的影響大於寄主對土壤微生物的影響。由此發現 β-多樣性受到環境因子與寄主因子的影響而且環境因子影響較大，結果與部分前人研究相同(Schlaeppi et al., 2013)。. 環境與寄主對微生物群落的影響 DAPC 的結果不管是以 OTU 為分群單位還是以綱為分群單位都可以發現霧鹿的田代氏黃芩與布烈氏黃芩有分群的現象，分群程度甚至還比霧台的布烈氏黃芩比上太魯閣的田代氏黃芩來的高，推測這可能是生態區位分化(Niche differentiation)的結果，此推測的證據也根據前人研究，土壤中不同的微型節肢動物(microarthropods)佔據不同的營養生態棲位(Schneider et al, 2004)、不同種的真菌對於不同土壤基質的偏好有所不同(Abuzinadah & Read, 1986；Hutchison, 1990)、共同出現(co-occurring)的植物在磷的獲取上展現生態區位的分化與可塑性(Phoenix et al., 2020)、植物會驅動硝化細菌(ammonia-oxidizing bacteria)與古菌之間生態區位的分化，這些間接證據可能表示霧鹿兩種黃芩的根圈土壤微生物的生態棲位有所分化，也可以當作兩種黃芩已經分化的證據。至於蘭嶼的部分可能是土壤基質的因素可以解釋，在這五個樣本中只有蘭嶼是火成岩分類中的集塊岩，可能就是土壤基質的不同進而影響微生物群落的組成。至於. 32.

(38) CLAMTEST 用三分之二絕對多數的標準(Chazdon et al, 2011)，以綱為分類單位的結果則是發現多數綱數量上較多的微生物族群皆是兩種黃芩都有的，在 OTU 的結果發現大部分的 OTU 在統計上都是少數，代表土壤微生物的多樣性高，多數微生物可取代性高或都是少量但穩定存在的族群。. 特定微生物對寄主植物可能的影響綜合 DAPC 與 CLAMTEST 的結果發現 OTU7852 在 DAPC 分析中可明顯辨別五樣本間的不同、在 CLAMTEST 分析中則是布烈氏黃芩的專化微生物，經檢查後發現 OTU7852 最低分類階層為 Proteobacteria 下的 Bradyrhizobium 屬，中文名為緩生根瘤菌，是在全球廣泛分布的類群，在前人的研究中提到緩生根瘤菌是與多種豆科植物互利共生的類群對農業有極大幫助並研究其多樣性 (Jaiswal & Dakora, 2019)，在本研究中 OTU7852 出現在 14 個樣本中，在布烈氏黃芩的六個樣本中有 131~905 筆數據，是 15 個樣本中豐度最多的 OTU、在以綱為分類單位的分析中則是發現 Firmicutes 門下的 Bacilli 綱在 DAPC 分析中可明顯辨別五樣本間的不同、在 CLAMTEST 分析中則是田代氏黃芩的專化微生物，參考先前的研究發現 Bacilli 是一種根瘤菌的綱，其分泌的幾種代謝物有促進植物生長、幫助植物抑制病原體、固氮的功能(Radhakrishan et al., 2017； Hashem et al., 2019)。先前的研究提到促進植物生長的根瘤菌 plant growth promoting rhizobacteria(PGPR)可以顯著的提升植物生長、對病原體產生拮抗作用或是幫助引發植物的誘導系統抗性 Induced systemic resistance (ISR)，代表植物與微生物間互助的相互作用(Beneduzi et al., 2012)。. 而單就 DAPC 的結果來看，OTU3571 是 Nitrosomonadaceae 目，與硝化作用有關(Prosser et al., 2014)。OTU6024 為 Chlorplast 葉綠體。OTU469 為 Proteobacteria 下的 Sphingomonadaceae 科，先前研究指出此為環境中的豐富微. 33.

(39) 生物(Kämpfer et al., 2002)，可能在生物修復方面有幫助。Alphaproteobacteria 是包含廣泛根瘤菌目等不同功能廣泛的綱，Betaproteobacteria 則是對於硝化作用有益。. 生態功能不同類群的微生物其生態功能並不相同，可能提供寄主植物不同的功能，了解不同類群微生物的功用可能有助於我們更了解微生物與寄主間的相互作用以及分工模式。綜合 OTU 與鋼分類群 RDA 的結果與 OTU 對樣本的豐度、豐富度分析則是發現田代氏黃芩位於霧鹿的樣本內差異較大，不只 OTU 樣本豐度差異大，三個樣本間分群距離也遠。推測可能是採樣點間差異較大，有的位於緩坡、有的位於陡坡土壤較少，或是寄主植物的根與其他草本植物的根交纏造成可能的潛在影響。. 與前人研究比較的部分，本研究以門為單位的微生物比例請參考(圖 24)，前三多的門分別是 Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria。前三多的目分別是 Alphaproteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria，Proteobacteria 在許多研究中都是豐度高的微生物類群，而酸桿菌門 Acidobacteria 在前人研究中探討其不同的生態功能，包含不同元素的使用(Ward et al., 2009；Navarrete et al., 2013；Mendes et al., 2014)、抗菌性(Parsley et al., 2011)、環境偏好(Ivanova et al., 2020)，放線菌門 Actinobacteria 在先前的研究中有廣泛生產不同次級代謝物的功能 https://www.intechopen.com/books/actinobacteria-basics-and-biotechnologicalapplications/an-introduction-to-actinobacteria，並且也有部分放線菌與植物共生 (Barka et al., 2016) 。. 34.

(40) 圖 24 以門為單位各類群微生物所占的百分比數據圖，X 軸 15 個樣點、Y 軸為各門的微生物所佔之比例。Pla1 是霧台的布烈氏黃芩，Pla3 是霧鹿的布烈氏黃芩，TAS1 是霧鹿的田代氏黃芩，TAS2 是蘭嶼的田代氏黃芩，TAS4 是太魯閣的田代氏黃芩。. 核心微生物本研究參考前人研究對於核心微生物的定義(Schlaeppi et al, 2013；Pfeiffer et al, 2016；Walters et al., 2018)，並根據本研究 CLAMTEST 的結果列出豐度前二十高的 OTU 與綱(表七)，本研究的定義為：五個不同樣區內各樣點至少要有兩個樣點豐度大於或等於 10，已於前面討論過的微生物就不在此贅述，以下將豐度前二十高的 OTU 一一討論。OTU2705 為根瘤菌目下的 Xanthobacteraceae 科，在 14 個樣本中皆有讀數。OTU3283 為 Proteobacteria 下的 Reyranella 屬，先前的研究報告是從經濟作物中發現(Lee et al., 2017)。OTU6675 是 Bacilli 綱下的 Lactococcus 屬，此微生物只在兩個樣本中大量出現，故不能算是專化微生物或是廣布型微生物。OTU10581 是 Acidobacteria 下的 Chloracidobacteria RB41. 35.

(41) 科，先前研究指出對乾旱或是潮濕的環境改變是敏感的(Jurburg et al., 2018)。 OTU1718 也是屬於 Xanthobacteraceae 科。OTU8925 屬於 Rhizobiales 根瘤菌目。OTU3394 為 Actinobacteria 門下的 Crossiella 科，可能有抗菌的功能 (Adeyemo & Onilude, 2018)。OTU9038 也是屬於 Xanthobacteraceae 科， OTU10370 是為根瘤菌目下的 Rhodobium 屬。OTU1251 是 Sphingomonadaceae 下的 hingomonas 屬，可能與生物修復有關。OTU5046 為 Proteobacteria 下的 Deltaproteobacteria 綱。OTU10532 也是 Acidobacteria 下的 Chloracidobacteria RB41 科。OTU10488 是根瘤菌目下的 Mesorhizobium。OTU3743 也是屬於 Xanthobacteraceae 科，OTU2223 為 Proteobacteria 下的 Enterobacteriaceae 腸桿菌科，是土壤中普遍存在的微生物。OTU770 是 Bacilli 下的 Bacillus 芽孢桿菌屬。這裡面包含了五個布烈氏黃芩的專化微生物以及一個田代氏黃芩的專化微生物。這些豐度高的微生物大多對寄主植物有益，提供了不同的生態功能，像是硝化作用、固氮作用、抗菌功能、促進植物生長。. 根據 OTU 與綱分類的結果，發現豐度前二十多的 OTU 分群有部分群會重複出現，至於符合本研究核心微生物定義的分別是 OTU7852、OTU469、 OTU2705、OTU3283、OTU10370、OTU10488、OTU6204、OTU9644 共 8 個 OTU(表七)，綱的位階其中七個屬於 Alphaproteobacteria α-變形菌綱、一個屬於 Acidobacteria 酸桿菌綱。目的位階其中五個屬於根瘤菌目、一個屬於 Rhodospirillales 紅螺菌目、一個屬 Sphingomonadales 鞘脂單胞菌目、一個屬於 Subgroup_6，這八種微生物的類群在前面討論就已說明是對寄主植物有益。 OTU7852 與 OTU3283 也是布烈氏黃芩的專化微生物，顯示這兩種微生物與布烈氏黃芩寄主有強烈的交互作用。. 36.

(42) 表七分別以 OTU 與綱為單位，寄主植物為分群進行的 Clamtest 分析，下為豐度前二十多的分群結果。左為 OTU、右為綱。 Species. 布烈氏田代氏. Classes. Species. 布烈氏田代氏. Classes. OTU469. 1071. 1518. Generalist. Alphaproteobacteria. 21277. 19078. Generalist. OTU6024 OTU2705 OTU3571. 464 830 689. 1021 437 498. Generalist Generalist Generalist. Acidobacteria Actinobacteria Betaproteobacteria. 14586 5232 6660. 13575 7923 5494. Generalist Generalist Generalist. OTU8925 OTU3394 OTU9038 OTU10370. 406 233 414 193. 375 497 310 445. Generalist Generalist Generalist Generalist. Planctomycetacia Deltaproteobacteria Acidimicrobiia Gemmatimonadetes. 5133 4647 2319 4054. 5983 5114 5250 3333. Generalist Generalist Generalist Generalist. OTU1251 OTU5046 OTU10488. 317 208 293. 295 404 277. Generalist Generalist Generalist. Gammaproteobacteria Sphingobacteriia norank. 2915 2910 2545. 2597 2315 2288. Generalist Generalist Generalist. OTU3743 OTU2223 OTU7852 OTU3283. 374 186 2118 728. 173 336 657 306. Generalist Generalist Specialist-布烈氏 Specialist-布烈氏. Holophagae Phycisphaerae Nitrospira Anaerolineae. 1695 1139 1495 839. 1598 2106 1683 1835. Generalist Generalist Generalist Generalist. OTU10581 OTU1718 OTU10532. 569 602 431. 256 205 158. Specialist-布烈氏 Specialist-布烈氏 Specialist-布烈氏. unclassified Chloroplast Thermoleophilia. 1192 918 3117. 1338 1452 7840. Generalist Generalist Specialist-田代氏. OTU6675 OTU770. 3 0. 916 517. Specialist-田代氏 Specialist-田代氏. Bacilli Spartobacteria. 78 429. 2650 1895. Specialist-田代氏 Specialist-田代氏.

(43) 表八分別以 OTU 與綱為單位，本島與外島為分群進行田代氏黃芩 Clamtest 分析，下為豐度前二十多的結果。左為 OTU、右為綱。 Species. 霧鹿與太魯閣. 蘭嶼. Classes. 霧鹿與太魯閣. 蘭嶼. Classes. OTU469. 805. 713. Generalist. Alphaproteobacteria. 10195. 8883. Generalist. OTU3394 OTU10370 OTU2705. 287 250 250. 210 195 187. Generalist Generalist Generalist. Acidobacteria Actinobacteria Betaproteobacteria. 7769 3036 3646. 5806 4887 1848. Generalist Generalist Generalist. OTU2223 OTU1251 OTU10488 OTU3571. 253 117 146 496. 83 178 131 2. Generalist Generalist Generalist 霧鹿與太魯閣. Planctomycetacia Thermoleophilia Deltaproteobacteria Gemmatimonadetes. 3145 4872 2415 2098. 2838 2968 2699 1235. Generalist Generalist Generalist Generalist. OTU5054 OTU4548 OTU5871. 425 318 262. 0 28 33. 霧鹿與太魯閣霧鹿與太魯閣霧鹿與太魯閣. Gammaproteobacteria Sphingobacteriia unclassified. 1396 1501 1485. 1201 814 803. Generalist Generalist Generalist. OTU7874 OTU6675 OTU7852 OTU770. 275 153 135 2. 6 763 522 515. 霧鹿與太魯閣蘭嶼蘭嶼蘭嶼. Holophagae Phycisphaerae Anaerolineae emply. 941 1312 1313 840. 657 794 522 498. OTU8001 OTU8925 OTU1712. 0 4 8. 396 371 319. 蘭嶼蘭嶼蘭嶼. Acidimicrobiia Nitrospira Bacilli. 4168 496 523. 1082 1187 2127. Generalist Generalist Generalist Generalist 霧鹿與太魯閣蘭嶼蘭嶼. OTU2169 OTU2325. 21 0. 278 265. 蘭嶼蘭嶼. Chloroplast Spartobacteria. 434 345. 1018 1550. 蘭嶼蘭嶼. Species. 38.

(44) 表九分別以 OTU 與綱為單位，霧台與霧鹿為分群進行布列氏黃芩 Clamtest 分析，下為豐度前二十多的結果。左為 OTU、右為綱。 Species. 霧台. 霧鹿. Classes. Species. 霧台. 霧鹿. OTU2705. 416. 414. Generalist. Alphaproteobacteria. 11129. 10148 Generalist. OTU3283 OTU1718 OTU10532. 366 232 318. 362 370 113. Generalist Generalist Generalist. Acidobacteria Betaproteobacteria Planctomycetacia. 8460 4787 3368. 6126 1873 1765. Generalist Generalist Generalist. OTU9038 OTU8925 OTU7430 OTU1251. 229 202 196 221. 185 204 178 96. Generalist Generalist Generalist Generalist. Thermoleophilia Deltaproteobacteria Gemmatimonadetes Gammaproteobacteria. 1473 3094 2696 1559. 1644 1553 1358 1356. Generalist Generalist Generalist Generalist. OTU10488 OTU469 OTU3571. 174 861 632. 119 210 57. Generalist 霧台霧台. Sphingobacteriia unclassified Holophagae. 1683 1505 1140. 1227 1040 555. Generalist Generalist Generalist. OTU10581 OTU6024 OTU9742 OTU839. 495 443 255 257. 74 21 36 25. 霧台霧台霧台霧台. Phycisphaerae Nitrospira Bacilli Anaerolineae. 807 1042 39 552. 332 453 39 287. Generalist Generalist Generalist Generalist. OTU7852 OTU10123 OTU464. 778 21 10. 1340 417 384. 霧鹿霧鹿霧鹿. emply Spartobacteria Chloroplast. 501 317 865. 691 112 53. Generalist Generalist 霧台. OTU3743 OTU5770. 42 28. 332 252. 霧鹿霧鹿. Actinobacteria Acidimicrobiia. 1475 790. 3757 1529. 霧鹿霧鹿. 39. Classes.

(45) 表十八種核心微生物的分類以及在各自樣點所佔的豐度百分比 Pla1%. Pla3%. TAS1% TAS2% TAS4%. Phylum. OTU7852. 1.474. 3.318. 0.249. 1.086. 0.211. Proteobacteria Alphaproteobacteria. OTU469 OTU2705 OTU3283. 1.631 0.788 0.693. 0.520 1.025 0.896. 1.461 0.223 0.236. 1.484 0.389 0.279. 1.271 0.543 0.321. Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Xanthobacteraceae Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Incertae_Sedis. OTU10370 OTU10488 OTU6204 OTU9644. 0.205 0.330 0.294 0.279. 0.211 0.295 0.129 0.171. 0.381 0.210 0.236 0.270. 0.406 0.273 0.133 0.067. 0.441 0.266 0.217 0.233. Proteobacteria Alphaproteobacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Acidobacteria Acidobacteria. 40. Class. Order. Family. Rhizobiales. Bradyrhizobiaceae. Rhizobiales Rhizobiales Rhizobiales Subgroup_6. Rhodobiaceae Phyllobacteriaceae Bradyrhizobiaceae norank.

(46) 物化性質本研究也參考本實驗室的研究成果，黃秉宏博士的研究中有探討田代氏黃芩與布烈氏黃芩土壤的物化性質(表十)，採樣點包含本研究的所有五個樣區，因樣本數與本研究不同且與本研究並非同時採集故無法進行直接分析但仍然可以與其他前人研究進行探討。先前研究發現土壤類型會影響萵苣根圈微生物的組成(Schreiter et al., 2014)、土壤鹽化與 PH 值還有黏土(clay)含量影響土壤微生物群落的 β 多樣性(Montecchia et al., 2015；O’Brien et al., 2019)。故詳細了解是那些物化性質是造成環境因子影響根圈微生物的主因是合理的方向。我比對了進行 RDA 分析的環境因子：土壤基質與土壤顆粒大小的分組(表十一)與學長所做的分析資料進行比對，結果發現鈣、鐵、鉀、鎂、錳、PH 值、NO3 含量的分群與土壤基質分群結果符合、土壤顆粒大小的分群差異相對較小。結果表示土壤基質物化性質含量的差異可能確實影響了土壤根圈微生物群落組成，霧鹿兩種黃芩間的土壤基質差異相對較小，也表示寄主植物的不同確實影響了土壤根圈微生物群落組成。. 41.

(47) 表十一田代氏黃芩與布烈氏黃芩土壤的物化性質，取原數據之平均值。資料來源：黃秉宏博士 host. P. K. 霧台. Pla. 2.064. 9.601. 霧鹿. Pla. 5.652. 霧鹿. TAS. 蘭嶼太魯閣. Ca (mg/kg). Mg. Fe. Mn. Zn. Cu. 308.880 25.224. 17.679. 10.337. 1.310. 0.236. 8.477. 255.345 21.903. 19.353. 10.446. 15.969. 0.149. 7.828. 9.5945. 329.286 24.979. 13.318. 9.035. 22.361. 0.131. TAS. 0.224. 46.166. 123.187 210.824 5.67175. 2.487. 0.113. 0.122. TAS. 0.551. 5.135. 716.676 14.432. 12.566. 0.264. 0.307. N(%). C(%). % of clay. 霧台. 0.357. 4.471. 72.28. 3.32. 24.4. 7.132. 237.836. 814.054. 霧鹿. 0.286. 3.545. 80.09. 4.76. 15.15. 6.685. 322.639. 877.813. 霧鹿. 0.255. 3.221. 76.44. 5.16. 18.4. 6.981. 362.456. 896.452. 蘭嶼. 0.168. 1.847. 79.84. 5.16. 15. 5.895. 304.041. 513.347. 太魯閣. 0.306. 5.501. 73.373. 5.16. 21.467. 7.776. 402.666. 1192.713. 9.770. % of sand % of slit. pH. 42. NH4(ppm) NO3(ppm).

(48) 表十一進行 RDA 分析時所使用的寄主與環境分組，不包含地點。寄主. 地點. 土壤類型土壤基質. 布烈氏. 霧台. 砂土. 頁岩. 布烈氏. 霧台. 砂土. 頁岩. 布烈氏. 霧台. 砂土. 頁岩. 布烈氏. 霧鹿. 壤土. 頁岩. 布烈氏. 霧鹿. 壤土. 頁岩. 布烈氏. 霧鹿. 壤土. 頁岩. 田代氏. 霧鹿. 砂土. 頁岩. 田代氏. 霧鹿. 砂土. 頁岩. 田代氏. 霧鹿. 砂土. 頁岩. 田代氏. 蘭嶼. 黏土. 集塊岩. 田代氏. 蘭嶼. 黏土. 集塊岩. 田代氏. 蘭嶼. 黏土. 集塊岩. 田代氏. 太魯閣. 砂土. 石灰岩. 田代氏. 太魯閣. 砂土. 石灰岩. 田代氏. 太魯閣. 砂土. 石灰岩. 43.

(49) 結論本研究承接前人的研究，寄主植物差異對 α 多樣性才有顯著的影響、β 多樣性上發現環境因子對根圈土壤微生物群落的影響相對寄主植物對根圈土壤微生物群落的影響來的大，也發現八種普遍存在五個樣區內的植物核心微生物，說明了這些微生物對寄主植物有不同的功能且有極高的關聯並適應了不同的環境，八種核心微生物其中有兩種微生物發現了對不同寄主間有明顯的偏好，證明了寄主植物與微生物間強烈的交互作用，也間接證明了兩種台灣特有黃芩的分化。. 至於環境因子的部分，不同的土壤特性、物化性質都可能造成微生物組成的不同，本研究的結果是：土壤基質是影響微生物群落組成的最主要因子。不同的基質擁有不同的物化性質，在養分含量或是組成比例上有根本的差異。按照土壤基質的分類探討，我們發現許多物化性質的數據與土壤基質的結果吻合，物化性質中養分的組成會影響到微生物如硝化作用與固氮作用的進行，因此也是對根圈微生物群落組成有重要的影響。. 絕大多數的微生物樣本並沒有同時存在於所有樣本中，這可能代表多數與植物有關的微生物其功能是可以互相代替或取代的，或是普遍存在於環境中隨機出現的物種。由於多數微生物物種鑑定多數只到科或是屬，因此僅能由群落的階層進行討論，無法確認每個微生物完整的生態功能，但還是可以藉由群落來分出不同群落間可能的差異與不同寄主、不同環境間可能產生的差別。. 44.

(50) 參考文獻 Abuzinadah, R. A., & Read, D. J. (1986). The Role Of Proteins In The Nitrogen Nutrition Of Ectomycorrhizal Plants. I. Utilization Of Peptides And Proteins By Ectomycorrhizal Fungi. New Phytologist, 103(3), 481–493. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1986.tb02886.x Adeyemo, O., & Onilude, A. (2018). Antimicrobial Potential of a Rare Actinomycete Isolated from Soil: Crossiella sp.-EK18. Journal of Advances in Microbiology, 11(2), 1-15. https://doi.org/10.9734/jamb/2018/41989 Akiyama, K., Matsuzaki, K., & Hayashi, H. (2005). Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi. Nature, 435(7043), 824-827. https://doi.org/10.1038/nature03608 Bailey, V. L., Bilskis, C. L., Fansler, S. J., Mccue, L. A., Smith, J. L., & Konopka, A. (2012). Measurements of microbial community activities in individual soil macroaggregates. Soil Biology and Biochemistry, 48, 192–195. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2012.01.004 Bailey, V. L., Mccue, L. A., Fansler, S. J., Boyanov, M. I., Decarlo, F., Kemner, K. M., & Konopka, A. (2013). Micrometer-scale physical structure and microbial composition of soil macroaggregates. Soil Biology and Biochemistry, 65, 60–68. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.02.005 Barka, E. A., Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., & Meier-Kolthoff, J. P. et al. (2016). Correction for Barka et al., Taxonomy, Physiology, and Natural Products of Actinobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(4), 1-43, Iii-Iii. https://doi.org/10.1128/mmbr.0004416 Beneduzi, A., Ambrosini, A., & Passaglia, L. M. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Their potential as antagonists and biocontrol agents. Genetics and Molecular Biology, 35(4 suppl 1), 1044-1051. https://doi.org/10.1590/s1415-47572012000600020 Berg, G., & Smalla, K. (2009). Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology, 68(1), 1–13. https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2009.00654.x Cavender-Bares, J., Keen, A., & Miles, B. (2006). Phylogenetic Structure Of Floridian Plant Communities Depends On Taxonomic And Spatial Scale. Ecology, 87(sp7), S109-S122. https://doi.org/ 10.1890/0012-9658(2006)87[109:psofpc]2.0.co;2. 45.

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