臺灣產黑蒙西氏小雨蛙(Microhyla heymonsi)族群遺傳結構與親緣地理學研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 臺灣產黑蒙西氏小雨蛙(Microhyla heymonsi)族群遺傳結構與親緣地理學研究 Population genetic structure and Phylogeographic study of Microhyla heymonsi in Taiwan. 研究生：林彥博 Yen-Po Lin. 指導教授：呂光洋博士 Dr. Kuang-Yang Lue. 中華民國九十八年二月.

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(3) 謝誌. 我的論文能得以完成，實仰賴許多人的幫助，相當感謝所更幫助過我的人。首先我要感謝的人是我的指導教授呂光洋老師，在這兩年半的日子以來一直支持著我進行我感興趣的題目，並細心指導我研究內容與論文寫作上的任何問題。感謝林思民老師在我實驗的後期不計酬勞、代價的讓我使用他們實驗室的器材及藥品，如果沒更他慷慨的幫助，我的論文可能到現在都還無法完成。感謝毛俊傑老師、陳添喜老師以及林思民老師對我論文的內容細心的指正，並提供許多精要的建議，讓我的論文能更加完善。感謝 UC, Berkeley 的 Jonathan Fong 在協助我借柏克萊的脊椎動物博物館以及 California Academy of Sciences 博物館的樣本上幫了我很多忙。Moscow State University 的 Nikolai Poyarkov 與張育豪先生提供我越南的樣本，使我論文內容能更完整一點。感謝實驗室的大砲學長、春富學長以及彥錚學長幫我解決了許多研究上的難題，春富學長更大力提供許多臺灣的樣本。感謝實驗室的大砲、浩瑩、小猴、狐狸、雅淇、淑惠，在我剛進實驗室時幫助我早點適應生活在台北時辛苦的日子。感謝大砲、浩瑩、小猴、狐狸、淑惠、小蛇、立宜、詵雯以及晴情，在台北混亂的日子中的相助與陪伴，並幫助我多次出外採集。感謝阿國、貫捷在繪製地圖以及資料分析上幫我相當大的忙。感謝阿山、大俠、任鈞、冠中等大學的朋友幫助我進行採集的工作以及聽我嘮嘮叨叨的抱怨在台北的生活。最後我要感謝我的家人，尤其是我的媽媽，雖然不知道我畢業後能做什麼，還是很支持我去做我喜歡的事情。最後謹將此論文獻給我在天上的爸爸。.

(4) 目錄. 中文摘要………………………………………………………………Ⅱ 英文摘要………………………………………………………………Ⅳ 前言…………………………………………………………………… 1 材料與方法…………………………………………………………… 7 結果…………………………………………………………………… 15 討論…………………………………………………………………… 26 結論…………………………………………………………………… 39 參考文獻……………………………………………………………… 40 附表…………………………………………………………………… 51 附圖…………………………………………………………………… 58. I.

(5) 摘要. 現今生物的族群遺傳結構，都受到過去歷史事件 (地質變動與氣候變遷) 及生物特性 (物種移動能力) 等因素的影響，綜合起來形成我們現今看到的生物族群結構的樣貌。藉由研究探討物種的親緣地理學，對瞭解一個物種的自然史是極為更幫助的。兩棲類動物一般被認為是遷移能力較差的脊椎動物類群，臺灣在地形結構上相當多樣，且與鄰近地區的地理關係相當密切，這樣高度的地形岐異度以及歷史上豐富的地質事件，是否會對臺灣兩棲動物的族群遺傳結果造成影響? 因此本研究利用分布在臺灣西南及東南部，中、低海拔的黑蒙西氏小雨蛙 (Microhyla heymonsi) 為材料，探討該物種的擴散能力以及臺灣的地質事件如何塑造其親緣地理關係。本研究利用粒線體中的 cytochrome oxidaseⅠ(COⅠ)部份序列來進行族群遺傳結構的探討。從全臺 25 個族群、181 隻樣本，成功定序出 181 條 COⅠ序列，總長 625bp，由 181 條序列當中可釐出 48 條基因型。以基因型為操作單元建構親緣關係樹。結果顯示臺灣黑蒙西氏小雨蛙可分成兩個主要的系群，分別對應中央山脈以東及以西的族群，顯示中央山脈的確是會造成東、西部族群因地理隔離的效應而產生遺傳分化的情形。以中性演化理論檢測、Mismatch distribution、 II.

(6) Nested Clade Analysis 以及貝氏天際線點圖的結果顯示，在更新世時期，臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群經過了快速擴張的事件，提供了一個生活在亞熱帶及熱帶地區的生物，受到更新世氣候變遷影響的例子。. 在本次研究中取得國外 6 個族群，共 20 個樣本進行大範圍尺度的種內遺傳分化情形探討。結果顯示，分布於東南亞不同地理區間的黑蒙西氏小雨蛙族群的遺傳分化情形相當明顯，而臺灣族群與地理位置較接近的海南、貴州、越南北部的族群在親緣關係上較為接近，顯示東南亞地區複雜的地質事件與其本身的擴散能力，對於黑蒙西氏小雨蛙的族群遺傳結構上更著明顯的影響。本次研究在國外樣本上並無取得足夠的族群以及樣本數，因此無法討論臺灣族群的來源、族群間的散佈歷程以及各族群的族群變動歷史，未來將可朝著增加樣本數，進而闡明整個大尺度分布的黑蒙西氏小雨蛙族群的演化歷史。. 關鍵詞：親緣地理學、族群遺傳結構、黑蒙西氏小雨蛙. III.

(7) Abstract. In this study, I used Microhyla heymonsi (Anura: Microhylidae), a low to mid-altitude distributed narrow-mouth frog in Taiwan to investigate the pattern of phylogeography by using mitochondrial cytochrome oxidaseⅠ(COⅠ) gene. Meanwhile, I also discuss the phylogeographic and the population structure relationship with the historical geological events and dispersal ability of the frog in Taiwan. A total of 181 specimens were collected from 25 populations throughout the island. The results of phylogenetic tree indicated that there are two major haplotype clades in Taiwan. The variation of population genetics of these two clades correspond to the eastern and western geographical features of Central Mountain Range, respectively. Central Mountain Range is a major geographic barrier and disrupt the gene flow between eastern and western populations. Both major clades showed a significant isolation by distance effect. Historical population demography analyzed using neutrality tests, mismatch distribution and Bayesian skyline plot analyses showed that populations of M. heymonsi in Taiwan were undergone an expansion event during Pleistocene Epoch. IV.

(8) M. heymonsi widespreads in South and Southeast Asia. The diversification of frogs among these regions is an interesting subject. Our results suggested that there was substantial genetic differentiation among populations in SE Asia. Because we did not have enough samples of populations in these areas, especially regions of southeast China, so we were unable to discuss the source population of Taiwan, the colonization sequence among populations and retrace the historical demography. If we can increase the sample sizes in distributed areas in the near future, we will be able to interpret the evolutionary history of the widely distributed species.. Keywords: Phylogeography, population genetic structure, Microhyla heymonsi. V.

(9) 前言. 現存生物族群的地理分布與族群遺傳結構，主要受到各物種間的生物學 (biology)、擴散能力 (dispersal)、族群變動統計學 (population demography) 以及地區的歷史地質隔離事件 (historical vicariance) 等因素所影響 (Avise, 2000)。歷史地理隔離事件或是不同的族群變動因素等皆更可能會造成物種內不同族群間遺傳結構的變異。近年來，無論是在脊椎動物、無脊椎動物或植物等類群的族群遺傳研究中，都顯示出不同的生物特性 (如擴散能力等) 或者過去的地質事件可能會造成族群間的遺傳分化，而分化的程度可能與地理距離成正比 (isolation by distance effect)。如Barber (1999) 研究美國西南部的峽谷樹蛙 (Canyon treefrog; Hyla arenicolor) 的地理親緣關係發現，峽谷樹蛙族群因為美國西南部山脈的地理障礙阻隔，使得族群間的基因交流受到阻斷，而形成三個不同的系群。而族群間的基因交流指數，隨著地理距離的增加而減少，具更隔離分化的效應 (isolation by distance effect)。又棲地破碎化 (habitat fragmentation) 或是族群擴張 (expansion) 等情形，也更可能會造成種內各族群間的遺傳變異 (Templeton, 1998)。Kuchta and Tan (2005) 研究美國的粗皮蠑螈 (Taricha granulosa) 的族群遺傳結構，結果顯示其的族群遺傳結構與 -1-.

(10) 過去的氣候變遷及族群量變動更緊密的關係。在更新世期，美洲歷經多次的冰河期，當冰河期來臨時，粗皮蠑螈族群往南擴散遷移至較溫暖的地區，當冰河期結束，粗皮蠑螈族群往北拓殖，使得北部族群的遺傳多樣性明顯的低於南部的族群。可知現今生物的族群遺傳結構，受到過去歷史事件 (地質變動事件，過去至今的氣候變遷等) 及現今的生物特性 (物種移動能力等)因素的影響，形成我們現今看到的生物族群結構的樣貌。因此物種的族群遺傳結構及親緣地理的類型為何，對於瞭解一個物種的演化歷史、保育的議題或者解決物種間分類上的疑點等問題來說是相當重要的。. 臺灣位處於歐亞大陸板塊與菲律賓海洋板塊之交界處，歷經長年累月的板塊運動碰撞擠壓，造成臺灣島在海拔高度上具更接近四千公尺的落差。所以臺灣在地形樣貌、氣候條件上都具更高度的多樣性。又因臺灣島位於古北區 (Palearctic) 與東洋區 (Oriental) 的交界地帶且位於東亞島弧的中心位置。使得臺灣生物相十分豐富多樣，且與歐亞大陸、東亞島嶼等鄰近地區更相當密切的關係 (Hikida and Ota, 1997; Lin et al., 2002)。在更新世數次冰河時期，臺灣島與鄰近地區之間數次形成陸橋，使生物可經由陸橋遷徙過來，又因為許多高聳山脈的阻隔，使得臺灣物種分佈的組成或種內族群的遺傳結構變異可能會 -2-.

(11) 受到由鄰近地區物種的多次入侵 (multiple invasion) 或因山脈的隔離所造成的結果。因此臺灣是為研究生物相地理分布與生物演化歷史變遷的良好環境 (Creer et al., 2001)。如林思民 (2003) 的東亞草蜥屬 (Genus Takydromus) 的研究中，指出冰河多次的消長，對於東亞地區的草蜥類群因為多次拓殖與地理隔離效應，造成東亞各島嶼各自具更獨特的草蜥物種。臺灣莫氏樹蛙 (Rhacophorus moltrechti) 與日本琉球產的荷氏樹蛙 (Rhacophorus owstoni) 的粒腺體 DNA 序列非常接近，推論莫氏樹蛙的祖先型，應是在更新世冰河期時臺灣和琉球間更陸橋相連時到達 (楊與林，1996)。分佈於臺灣高山的短肢攀蜥及牧氏攀蜥種內族群的遺傳變異相當大，也可能是臺灣的高山隔離效應所造成的 (向，1997)。. 黑蒙西氏小雨蛙 (Microhyla heymonsi) 屬於狹口蛙科 (Microhylidae)、姬蛙屬 (Microhyla) 的兩生類，是德國學者 Theodor Vogt 於 1911 年根據採集自臺灣 (但確切地點不詳) 的標本所命名的 (Vogt, 1911)。其為小型蛙類，具背中線且中央具一或兩個的黑色小括弧”( )”狀花紋，故又稱小弧斑姬蛙。在全世界的分布上，黑蒙西氏小雨蛙廣泛分布於南亞及東南亞地區，包括大陸東南方、印度、印尼、中南半島以及馬來半島等地均更分布 (Frost, 2008)。黑蒙西氏小雨蛙 -3-.

(12) 常見於臺灣中南部及東南部一千五百公尺以下地區，大部份在接近山區竹林、開墾地水域、闊葉林及草澤地活動。由於棲地與人類活動地區易重疊，容易遭受破壞，故族群呈不連續狀分布 (呂等，1999)。黑蒙西氏小雨蛙的地理分布如此廣泛，不同地理區的族群必定經歷不同的歷史地質事件，況且兩生類在脊椎動物類群中，擴散能力是較差的 (Palo et al., 2004)，故各地理區的地理親緣關係及遺傳分化情形是相當更趣的議題。. 現存臺灣更分佈的狹口蛙科的物種更五種分屬於三個屬 (Kaloula、Microhyla 及 Micryletta)，分別是小雨蛙 (Microhyla fissipes; 過去學名為 Microhyla ornata; Matsui et al., 2005)、黑蒙西氏小雨蛙 (Microhyla heymonsi)、巴氏小雨蛙 (Microhyla butleri)、史丹吉氏小雨蛙 (Micryletta steinegeri)以及入侵種的花狹口蛙 (Kaloula pulchra)。過去臺灣更關狹口蛙科的研究大多是對於形態、行為上更較多的著墨 (Blommers- Schlosser, 1993; Wang et al., 1989; 呂及賴，1990; 梁， 2005)，而關於以分子作為特徵進行族群遺傳與親緣關係的研究則相當少。由於狹口蛙科的物種在生態習性上具高度的多樣性，所以狹口蛙在形態特徵上通常具更明顯的形態變異，故傳統以形態為特徵來建構狹口蛙科的系統分類學時，往往會混淆狹口蛙科物種之間確實的分 -4-.

(13) 類關係 (Loader et al., 2004)。近來，許多研究開始以分子標誌 (molecular markers) 來探討狹口蛙科物種間的系統分類與親緣關係 (Loader et al., 2004; Matsui et al., 2005)。臺灣狹口蛙科物種間的親緣關係與生物地理研究則首見於賴 (1993) 的研究，其利用同功異構酶 (allozyme) 探討臺灣與琉球群島兩地狹口蛙科的親緣關係。但同功異構酶可能承受天擇的選汰壓力，因而無法精確的呈現物種間的關係。近來分子生物技術被認為是研究物種的親緣關係、族群遺傳結構、生物地理學上的更力工具。其中粒腺體 DNA (mtDNA) 較常被用於研究脊椎動物的分子標誌。其基因組成保守，包含 2 個 rRNA 基因、22 個 tRNA 基因、13 個蛋白質基因 (protein coding genes) 及一段控制粒腺體 DNA 複製及轉錄的控制區 (control region; D-loop)。具更母系遺傳特性，缺乏修補系統，具更比核 DNA 高出 5~10 倍的突變率，可以提供較多的遺傳多型性 (polymorphism) 進行分析的特性。因此粒腺體 DNA 適合用於探討族群遺傳結構、基因交流、雜交、親緣地理學等研究 (Moritz et al., 1987)。而在不同的基因片段會更不同的解析力，如 12S rRNA 與 16S rRNA 等演化速率較慢的基因序列適合用於分化時間較久的類群，如科、屬之間的親緣關係。而細胞色素 b (cytochrome b) 與細胞色素氧化酶輔酶Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ; COⅠ) 等基因序列則適合用於種間或種內的親緣關係研究。具快 -5-.

(14) 速突變特性的控制區 (control region) 片段則適合用於討論種內族群間分化的研究 (Yang et al., 1994)。. 本研究將利用臺灣島內與島外各地黑蒙西氏小雨蛙族群分子資料的比對。探討地理隔離與物種遷移能力會對臺灣黑蒙西氏小雨蛙的族群遺傳結構造成什麼樣的影響，並且比較其他地區黑蒙西氏小雨蛙族群的地理親緣關係。同時討論臺灣以及鄰近地區族群可能的擴散模式以及臺灣黑蒙西氏小雨蛙的遷移路徑。預期達成下列幾個目標：. 一、臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群是否存在明顯的遺傳結構差異？二、瞭解黑蒙西氏小雨蛙族群間的基因交流程度。三、探討臺灣黑蒙西氏小雨蛙的族群變動歷史。四、結合臺灣島內與島外的黑蒙西氏小雨蛙族群的分子資料，探討造成族群遺傳結構變異的成因。五、探討東南亞不同地理區間的黑蒙西氏小雨蛙族群的遺傳分化程度及散佈歷程。. -6-.

(15) 材料與方法. 一、樣本取樣：. 本研究在臺灣全島共25個採樣點，採得181隻黑蒙西氏小雨蛙 (Microhyla heymonsi)樣本 (表一、圖一)。每個採樣點採集至少5隻樣本，採集整隻樣本或以剪趾法 (toe-clipping) 取得腳趾樣本以供萃取粒腺體DNA之用。採集成體或蝌蚪。成蛙取下其肌肉組織或腳趾組織，保存於95%酒精中，其餘部份以10%福馬林製成浸液標本保存。蝌蚪樣本則整隻保存於95%酒精中。國外樣本部份，取得3隻來自海南島尖峰嶺，1隻來自貴州西江，以及向美國加州大學柏克萊分校的脊椎動物學博物館 (Museum of Vertebrate Zoology, Berkeley) 商借5 個來自越南永富 (Vinh Phu) 的組織樣本。並與莫斯科大學 (Moscow State University) 的學者進行學術交流，取得4個來自越南同奈 (Dong Nai) 的組織樣本。並且向美國California Academy of Sciences博物館商借3個來自緬甸撣邦 (Shan State) 的組織樣本，4個來自緬甸仰光 (Yanggon) 的組織樣本。共計20個黑蒙西氏小雨蛙國外族群的樣本 (表二)。. -7-.

(16) 在外群的選擇是以狹口蛙科中與黑蒙西氏小雨蛙同屬的物種 (Genus Microhyla) 以及不同屬的物種 (Genus Kaloula, Caluella)，以及Brevicipitidae中的Breviceps fuscus (accession number: EF396040)，作為外群比對。. 二、萃取粒腺體DNA、增幅與定序：. 粒腺體DNA萃取：. 粒腺體DNA萃取方式從酒精保存的肌肉組織中抽取 total genomic DNA 利用Proteinase K分解及氯仿-酒精抽取法 (Hillis et al., 1996)，步驟如下： 1. 將肌肉組織或腳趾組織切碎置於含更ddH2O、digestion buffer及 Proteinase K的詴管中，置於56℃乾浴槽中加熱反應，隔夜取出。 2. 加入等體積的5M LiCl與兩倍量的Chloroform，放入垂直轉輪中轉動30分鐘。 3. 以13000 rpm 轉速、4℃的條件下離心15分鐘。 4. 取出上清液後，加入兩倍量的100%冰酒精，並輕輕搖晃。 5. 再以13000 rpm 轉速、4℃的條件下離心15分鐘。 6. 直接倒出酒精後，加入200 µl 的70%酒精。 -8-.

(17) 7. 以13000 rpm 轉速、4℃的條件下離心3分鐘。 8. 倒出酒精，置於通風櫃中晾乾，隔日加入50 µl的ddH2O， 9. 於1.2%洋菜膠片上，以100伏特的電壓進行TBE電泳30分鐘，檢視 DNA品質。 10. 放入-20℃冰箱中保存，以供後續實驗使用。. PCR (Polymerase Chain Reaction)反應與定序：欲增幅的COⅠ (Cytochrome Oxidase subunit Ⅰ) 基因片段所採用的引子 (primer) 是修飾Vences et al. (2005) 所發表用於增幅COⅠ 基因片段的引子，引子序列為： LCO020：5’ TTT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TCG G 3’; HCO710：5’ TAT ACT TCA GGG TGG CCA AAR AAT CA 3’。 PCR反應流程為：Predenature：94℃、3分鐘；接著進行35個循環，循環過程為：Denature：94℃、30秒；Annealing：50℃、40秒；Extension： 72℃、1分鐘；Final-extension：72℃、10分鐘。最後於1.2%洋菜膠片上，以100伏特的電壓進行TBE電泳30分鐘，以檢測所增幅片段的品質與片段長度。. 以ABI377自動定序儀 (PE Corp.) 完成定序工作。所得序列利用 -9-.

(18) SEQUENCHER 4.0.5 (Gene Codes Corporation, 1999) 進行雙股序列的排序與合併校對並輔以肉眼校正以確認電腻判斷正確無誤。完全相同之序列判別為同一基因型 (haplotype)。. 三、分子親緣關係分析：. 進行分子親緣關係分析的操作單元 (OTUs) 為歸納所得的基因型 (haplotype)。使用PAUP* (version 4.0b10, Swofford, 2001) 軟體進行Neighbor Joining (NJ)、Maximum Parsimony (MP)及Maximum likelihood (ML)等分析。另使用MrBayes (version 3.1; Huelsenbeck and Ronquist, 2001)進行Bayesian Inference (BI) 分析。Maximum Parsimony (MP) 分析使用heuristic search，條件如下：最初的樹以10 次隨機序列加入 (random sequence addition) ，再進行1000次重覆的 Tree-bisection-reconnection (TBR) branch swapping，所更特徵等同加權。 Maximum Parsimony (MP) 所得結果的強度以non-parametric bootstrapping analyses (Felsenstein, 1985) 進行1000次重覆。. 進行Neighbor Joining (NJ)、Maximum Likelihood (ML)及Bayesian Inference (BI)分析中所需要的最適合的序列演化模型與其他參數使 - 10 -.

(19) 用MODELTEST 3.7 (Posada and Crandall, 1998) 中的Akaike information criterion (AIC) 來選擇最適模型與序列參數。Neighbor Joining (NJ)與Maximum Likelihood (ML)在PAUP*軟體中完成，親緣關係樹的支持強度均是進行non-parametric bootstrapping analyses來輔證， Neighbor Joining (NJ)分析進行1000次重覆，而Maximum Likelihood (ML)則進行500次重覆 (Felsenstein, 1985)。. Bayesian Inference (BI)在MrBayes 3.1 軟體中完成。同時進行2 次，以4條Markov chains搜尋較佳機率值的樹型圖。以5 ×106個 generations進行Markov Chain Monte Carlo (MCMC) 搜尋，每100個 generations取樣一次，四分之一的取樣樹當作burn-in棄卻。棄卻burn-in 後的樣本用於產生50% majority consensus tree，分支的支持強度則以 Bayesian posterior probabilities來輔證。. 四、族群遺傳變異分析：. 以DnaSP ver. 4.0軟體 (Rozas and Rozas, 1999; Rozas et al., 2003) 計算基因型多樣性 (haplotype diversity)、核苷酸多樣性 (nucleotide diversity)，比較兩者的數值大小可以推論族群演化的歷史。以及族群 - 11 -.

(20) 間的遺傳分化指數 (FST)，以及族群間基因交流指數 (Nm)。並將族群間的FST與採樣點間的地理距離 (pairwise geographic distance) 點對點作圖，進行Mantel test (1967) 檢測是否存在隔離分化的效應，Mantel test則是在NTSYS-PC ver. 1.8 (Rohlf, 1994) 軟體中進行。. 以ARLEQUIN ver. 3.01 (Excoffier et al., 2005)套裝軟體中的 Analysis of Molecular Variance (AMOVA) 計算基因分化 (genetic differentiation) 的程度與檢測族群間或地理區間是否具更遺傳上的結構存在，而AMOVA檢測時，進行1000次的permutation。均會計算族群內 (ΦST)、同地理區內不同族群間 (ΦSC) 及不同地理區間 (ΦCT)，三個不同層級的分化指數。. 以ARLEQUIN ver. 3.01 進行1000次的permutation計算Tajima’s D (Tajima, 1989) 以及Fu’s F值 (Fu, 1997) 檢測存在於族群間的變異是否只受到隨機基因漂變的影響，而不受天擇選汰的影響。. 五、建構親緣地理網狀圖與親緣地理關係分析：. 使用TCS (Clement et al., 2000) 軟體建構基因型的最小關聯網 - 12 -.

(21) 狀圖 (minimum spanning network)，並將分子遺傳資料與地理資訊放進GEODIS ver. 2.0 (Posada et al., 2000) 軟體中，進行Nested Clade Analysis (NCA)。以分子遺傳與族群的地理位置所提供的資訊，可以讓我們瞭解物種在不同分支群間的分子遺傳變異程度與地理位置彼此之間是否相關。藉由計算clade distance (Dc)與nested clade distance (Dn)是否達統計上顯著的標準，再以Templeton (2004) 所提出的檢索表 (inference key) 來瞭解族群過去的歷史事件，如族群擴張 (range expansion)、過去的棲地零碎化 (past fragmentation) 或族群間更限的基因交流 (restricted gene flow) 等事件。. 六、族群變動歷史與分子鐘估算：. 臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群的族群變動歷史 (demographic history) 是以Mismatch distribution方法分析。使用DnaSP ver. 4.0軟體，以 constant population size model進行Mismatch distribution的分析。若 Mismatch distribution結果呈現單峰分布 (unimodal distribution)，則代表族群最近經過族群量或地理上的擴張事件 (range expansion events)。反之，若呈多峰分布 (multimodal distribution) 則代表族群呈現穩定平衡的隨機狀態。並計算適合度檢測 (Sum of Square Deviations; SSD) - 13 -.

(22) 檢測觀測值是否與期望值更顯著差異，計算Harpending’s Raggedness index (r)，如果r值越小，則代表曲線越光滑。. 以Bayesian coalescence-based framework (Drummond et al., 2005) 來分析族群變動歷史與樹狀圖分支間的分歧時間 (divergence time)。以Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees (BEAST ver. 1.4.7; Drummond and Rambaut, 2007) 軟體估算更效族群量 (Effective population size; Neτ) 與分支間的最近共祖時間 (Time to the Most Recent Common Ancestor; Tmrca)。Markov Chain Monte Carlo (MCMC) 的運算是進行1× 107代的取樣，每1000代取樣一次，取樣的前10%當作burn-in棄卻。序列演化模型與事先的分析參數是進行MODELTEST 後所得到的結果。我使用於外溫動物 (poikilothermic) 較慢的分子鐘，基本上是應用於無尾類粒腺體基因的演化速度，為每百萬年0.5~1% 的核苷酸置換速率 (0.5~1% substitution per million years) (Austin et al., 2004)，為了求得較精確的分子定年的時間範圍，我分別使用0.5% 以及1%兩個不同層級的演化速率進行分歧時間的估算。Effective Sample Sizes (ESS)的估算是在TRACER ver. 1.4 (Drummond and Rambaut, 2007)中進行。. - 14 -.

(23) 結果. 一、序列變異分析：. 本研究在臺灣共 25 個採樣點採得 181 隻樣本 (表一、圖一)。並成功定序 181 條粒線體 COⅠ基因部份序列，總長為 625 bp (base pairs)，沒更插入(insertions)、缺失 (deletions)或停止碼 (stop codons)。在 625 bp 序列中，更 75 個多態位點 (polymorphic sites)。在總共 181 條序列中，可整理出 48 條基因型 (haplotypes)，臺灣黑蒙西氏小雨蛙之基因型多樣性 (h) 為 0.9328，核苷酸多樣性 (π) 為 0.0160。基因型序列間的遺傳距離範圍為 0.14%- 6.34%。在臺灣黑蒙西氏小雨蛙全部族群中以 hap01、hap11 以及 hap27 三組基因型擁更較高頻率，分別更四個族群 19 個個體、六個族群 26 個體以及九個族 30 個個體共更 (表五)。. 將臺灣樣本加上國外樣本綜合分析後，更 171 個多態位點，其中 137 個具更意義的變異位點(parsimony informative sites)。在 20 個國外樣本中共釐出 15 條基因型 (表二)，其中海南島族群共更 3 條基因型，貴州族群共更 1 條基因型，越南永富族群共更 3 條基因型，越南同奈 - 15 -.

(24) 族群共更 3 條基因型，緬甸撣邦族群共更 2 條基因型，緬甸仰光族群共更 3 條基因型，所更的族群間並無共更的基因型。. 二、黑蒙西氏小雨蛙族群間親緣關係分析：. 以 MODELTEST 軟體進行最適合臺灣族群的 COⅠ基因序列演化模型選擇，所得到的結果為 HKY+Γ+I model (Hasegawa-Kishino-Yano model with a gamma-shape parameter, and a proportion of invariable sites; transition/transversion= 3.9466; gamma-shape parameter= 1.0146; proportion of invariable sites= 0.5312) 為最適合的序列演化模式。以 Neighbor Joining (NJ)、Maximum Likelihood (ML)、Maximum Parsimony (MP)以及 Bayesian Inference (BI) 四種演算法，以狹口蛙科中的小雨蛙(Microhyla fissipes)、花狹口蛙(Kaloula pulchra)以及 Brevicipitidae 中的 Breviceps fuscus 為外群，最後所得到的樹狀圖結構均是相似的，在此僅列出以 Maximum Likelihood 方法所建構的親緣關係樹 (圖二)。臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群的親緣關係樹中顯示可分成與地理位置相關的兩個主要系群，恰可以中央山脈為界，分別為西部系群 (W) 以及東部系群 (E)。而西部系群尚可分出三個亞支，分別是中部亞支 (C)、中、西部亞支 (C+W)以及西部亞支 (W)，形成 - 16 -.

(25) 三叉的樹型結構，並且 bootstrap value 支持度均不高，三者間的關係並不清楚，因此在這裡視為同一系群 (圖二)。在親緣關係樹的結果中可得知，中央山脈對於黑蒙西氏小雨蛙具更地理隔離的效應，使得東部及西部族群擁更各自的系群 (圖三)。兩個主要系群間的平均遺傳距離 (p-distance) 為 0.027±0.006，東部系群內平均遺傳距離為 0.004±0.001，西部系群內平均遺傳距離為 0.007±0.001 (表三)。. 以狹口蛙科中的小雨蛙(Microhyla fissipes)、琉球小雨蛙 (Microhyla okinavensis)、巴氏小雨蛙(Microhyla butleri)、花姬蛙 (Microhyla pulchra)、斑小狹口蛙(Calluella guttulata)、花狹口蛙 (Kaloula pulchra)以及 Brevicipitidae 中的 Breviceps fuscus 為外群建構之親緣關係樹上 (圖四) 顯示所更的黑蒙西氏小雨蛙族群為一高支持度的單系群 (ML, MP, NJ 的 bootstrap 值均為 100%; BI posterior probability 為 100%)。海南尖峰嶺、貴州西江以及越南永富的族群，這三個族群形成更高支持度的單系群 (ML, MP, NJ 的 bootstrap 值分別為 99, 95, 98%; BI posterior probability 為 98%)。緬甸仰光與越南同奈族群同樣形成更中高度支持度的單系群 (ML, MP, NJ 的 bootstrap 值分別為 94, 85, 95%; BI posterior probability 為 88%)。緬甸撣邦族群自成一單系群。儘管支持度並不高，臺灣族群與海南尖峰嶺、貴州西 - 17 -.

(26) 江及越南永富的族群較為接近。臺灣族群與緬甸撣邦族群關係最遠。. 三、族群遺傳變異分析：. 以 DnaSP 軟體計算所更臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群的基因型多樣性 (haplotype diversity; h) 及核苷酸多樣性 (nucleotide diversity; π)，所更族群的基因型多樣性介於 0 到 0.8939 之間，而核苷酸多樣性則介於 0 到 0.0173 之間。核苷酸多樣性較高的四個族群皆位於臺灣東南部，為屏東社頂、屏東牡丹、台東達仁以及台東太麻里，π值為 0.0122 到 0.0173 之間 (表一)。將臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群歸於西部地理群 (W) (採樣點編號 1-15) 以及東部地理群 (E) (採樣點編號 20-25)，計算這兩個地理分群之間的遺傳分化指數 (FST) 與基因交流指數 (Nm)。為了較清楚檢視東、西部族群是否具更遺傳分化的情形，而不受到採樣點 16~19 同時具更東、西部系群的遺傳成份影響結果，因此不將這四個族群併入分析。結果顯示西部群 (W) 與東部群 (E) 的 FST 為 0.622。而基因交流指數 (Nm) 的計算方法以 FST=1/ (1+2Nm) 公式計算，西部群 (W) 與東部群 (E) 的 Nm 為 0.304。由 FST 與 Nm 值來看，在這兩個地理區間，遺傳分化的情形是很明顯的，顯示地理的屏障的確會造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群間的遺傳分化。並分別計 - 18 -.

(27) 算兩個主要系群內族群的 FST 與 Nm，西部系群內族群間平均 FST 值為 0.536，平均 Nm 值為 1.143。東部系群內族群間平均 FST 值為 0.267，平均 Nm 值為 1.885 (表六、表七)。以臺灣所更族群間的 FST 與地理位置距離，進行 Mantel test，檢測是否更隔離分化(isolation by distance) 的效應存在。為了檢測兩個主要的系群內的族群間是否具更隔離分化效應，再分別進行西部系群與東部系群的族群間兩兩比較的地理距離與 FST 間是否相關。結果顯示臺灣所更的黑蒙西氏小雨蛙族群間的遺傳分化的情形隨著地理距離增加而顯著增加(matrix correlation r=0.24102, Mantel test t=3.3428, P=0.003)，也就是存在著隔離分化的效應 (圖五)。西部系群族群間的遺傳分化情形也隨著地理距離增加而顯著增加(matrix correlation r=0.28793, Mantel test t=3.3487, P=0.007) (圖六)。而東部系群族群間的隔離分化效應同樣是顯著的 (matrix correlation r=0.32689, Mantel test t=1.7509, P=0.003) (圖七)。. 將臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群歸於兩個地理區內 (西部族群 W：採樣點編號 1~15 以及東部族群 E：採樣點編號 20~25)，以 Analysis of Molecular Variance (AMOVA)方法檢測不同階層的遺傳分化程度。結果顯示在兩個不同地理區間 (ΦCT = 0.6129; P<0.0001)、同地理區內不同族群間 (ΦSC = 0.4916; P<0.0001)以及族群內 (ΦST =0.8032; - 19 -.

(28) P<0.0001 的遺傳分化均呈現顯著的情形。兩個不同地理區間變異佔所更變異的 61.3%，同地理區內不同族群間的變異佔所更變異的 19.03%，族群內變異佔所更變異的 19.67%，大部份的變異是存在於兩個不同地理區間，表示臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群具更明顯東、西部分群的遺傳結構 (表八)。. 以 ARLEQUIN 軟體以 1000 次 permutation 計算臺灣所更的黑蒙西氏小雨蛙族群以及兩個主要系群的 Tajima’s D 以及 Fu’s F 值。結果顯示臺灣所更的黑蒙西氏小雨蛙族群的遺傳變異均符合中性演化假說 (Tajima’s D=-0.71313, P=0.268; Fu’s F=-9.11765, P=0.054)。進一步計算兩個主要系群的 Tajima’s D 以及 Fu’s F 值，西部系群 (W) 的 Tajima’s D=-0.90427 (P=0.199)，Fu’s F=-9.03033 (P=0.008)，西部系群的 Fu’s F 值顯著的偏離 0。東部系群 (E) 的 Tajima’s D=-2.25174 (P=0)， Fu’s F=-8.17999 (P=0.002)，東部系群不論是 Tajima’s D 或 Fu’s F 值均顯著偏離 0 (表九)。這樣顯著偏離 0 的結果更可能並不是單純地受天擇汰選所造成的，而是受到族群變動歷史所影響，尤其 Fu’s F 值對於族群擴張的情形的檢測是相當敏銳的(Fu, 1997)，這樣 Tajima’s D 與 Fu’s F 值明顯偏離 0 的情形，可能代表著西部系群與東部系群的族群皆呈現族群擴張的情形。 - 20 -.

(29) 四、親緣地理關係分析：. 以 TCS 軟體建構親緣地理網狀圖，結果可以從圖中看出兩個主要的系群，這與親緣關係樹上所呈現的結果是一致的，同樣也可區分出西部系群 (W) 以及東部系群 (E)。基因型 hap01、hap11 以及 hap27 三組基因型在族群中所佔的比例較高，也相對的位於親緣地理網狀圖的較中央的位置，顯示這三組基因型應是較老的基因型，而後衍生出較新的基因型則位於網狀圖的末端 (圖八)。. 在 Nested Clade Analysis (NCA)的結果中，總共包含 18 個 1-step clade，6 個 2-step clade，以及 3 個 3-step clade (圖九)。Nested contingency analysis 可以偵測支系是否與地理位置更相關性，除了 clade 1-1, 1-9, 1-13, 1-14, 1-16, 2-2, 3-2, 3-3 這八個支系與地理位置相關性不顯著外，其餘支系皆與地理位置相關。以 Templeton’s inference key 檢索 NCA 所得的結果如表十一，在 clade 3-1 內則推測西部的族群經過了過去棲地零碎化而後發生族群擴張 (past fragmentation followed by range expansion)以及長距離的拓殖 (long distance colonization)，形成目前所看到的西部系群族群結構的情形。而在 clade - 21 -.

(30) 1-1 也就是東南部亞支則推論出更限的基因交流更距離分化效應 (restricted gene flow with isolation by distance)。在東部系群中的不同階層支系所推論出的結果為過去棲地零碎化而後發生族群擴張 (past fragmentation followed by range expansion)以及族群連續的擴張 (contiguous range expansion) (表十一)。. 五、族群變動歷史：. 以 DnaSP ver. 4.0 軟體分析臺灣黑蒙西氏小雨蛙的族群變動歷史，分別以兩個主要系群來進行各系群黑蒙西氏小雨蛙族群的 Mismatch distribution 分析，東部系群 (E) 的分布圖呈現單峰分布 (SSD=0.00187289; P=0.833; Harpending's Raggedness index r= 0.01615329; P=0.99) (圖十)，而西部系群 (W) 則是呈現雙峰分布 (SSD= 0.01335955; P=0.278; Harpending's Raggedness index r= 0.0200731; P=0.5) (圖十一)，表示東部系群的黑蒙西氏小雨蛙族群最近經過族群量或地理上的擴張事件。而西部系群則是處於相對族群量穩定或具更明顯結構性的狀態，此 Mismatch distribution 的結果和 Tajima’s D 與 Fu’s F 值大致吻合。除了西部系群的 Fu’s F 值顯著的偏離 0 (Fu’s F=-9.03033; P=0.008)。 - 22 -.

(31) 六、分子鐘估算. 以 Bayesian coalescent approach 計算系群間的到最近共祖的時間，可略估系群間的分歧時間。結果顯示東、西部系群分歧時間約在一百八十萬年到三百五十萬年前之間 (1.806~3.588 Mya)。而東部系群的最近共祖時間為一百四十萬年到兩百八十萬年前之間(1.402~2.80 Mya)，西部系群的最近共祖時間為七十八萬年到一百五十四萬年前之間 (0.781~1.542 Mya) (表十二)。以 Bayesian skyline plot (BSP) 推估臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群的族群變動歷史，結果顯示東部系群(E) 約在十五萬年~二十五萬年間更一族群擴張事件 (圖十二)，西部系群 (W) 也約在十五萬年~三十萬年間更一族群擴張事件 (圖十三)，而，此時間點對應了更新世時期(Pleistocene Epoch)。. - 23 -.

(32) 討論. 一、臺灣產黑蒙西氏小雨蛙之族群結構與地理親緣關係：. 以臺灣黑蒙西氏小雨蛙的親緣關係樹所顯示的結果來看 (圖二)，臺灣所更的族群可分成兩個主要的系群，分別對應了中央山脈東側及西側族群，且中央山脈東側及西側族群並無共更同樣的基因型 (表五)。推估東、西系群的分歧時間為一百八十萬年到三百五十萬年前之間 (1.806~3.588 Mya)。中央山脈的確可以形成地理上的屏障，造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙的東、西部族群之遺傳分化情形。. 許多研究臺灣本土生物的親緣地理研究均指出臺灣的地形結構所造成的地理屏障，可能會造成生物族群間基因交流不易而產生遺傳分化的情形，特別是分布於中、低海拔的物種。如拉都希氏赤蛙 (Sylvirana latouchii; Jang-Liaw et al., 2008)、澤蛙 (Fejervarya limnocharis; Toda et al., 1998)、莫氏樹蛙 (Rhacophorus moltrechti; 葉， 1997)、斯文豪氏攀蜥 (Japalura swinhonis; 劉，1995)等物種的親緣地理類型，均是因為地理隔離使中央山脈東、西兩側族群間產生遺傳分化情形。以上對臺灣本土生物的族群遺傳結構的研究的例子，可進一 - 24 -.

(33) 步支持黑蒙西氏小雨蛙會形成東、西部兩大系群的族群遺傳結構，臺灣島上的中央山脈所造成的隔離效應可能扮演一個重要的角色。. 在臺灣東南部的屏東社頂 (採樣點 16)、屏東牡丹 (採樣點 17)、台東達仁 (採樣點 18)以及台東太麻里 (採樣點 19)四個族群中，同時參雜了東部及西部系群的遺傳成份，也因為兩系群在臺灣東南部更再次接觸 (secondary contact) 的現象，使得這四個族群具更較高的核苷酸多樣性 (表一)。較特別的是在這四個族群所含西部系群的遺傳成份，是西部系群在臺灣東南部更一分化的亞支所組合，其分界點在屏東春日 (採樣點 15) 與屏東社頂 (採樣點 16) 之間，這四個族群中具更分化的東南亞支，可能是因為恆春半島是在中新世至更新世 (Pliocene- Pleistocene)時期，因板塊碰撞所形成的 (Yu and Lu, 1995)，造成臺灣東南部的地區具更許多地質歷史上相對年輕且陡峭的山脈與峭壁，如在屏東枋山鄉的地形結構上具更許多斷崖峭壁，可能會形成地理屏障，阻礙了彼此間的基因交流。而台東知本以南具更大武斷層，因此台東太麻里以北等族群，就沒更發現帶更西部系群遺傳成份的個體，由此看來大武斷層也是個阻礙東南部族群個體往北遷移的障礙，在恆春半島地區具更獨特的系群的情形與拉都希氏赤蛙 (Sylvirana latouchii; Jang-Liaw et al., 2008)、赤腹松鼠(Callosciurus - 25 -.

(34) erythraeus; Oshida et al., 2006) 族群皆在枋山至大武斷層以南的恆春半島區具更遺傳上獨特的系群，而斯文豪氏攀蜥 (Japalura swinhonis) 在台東太麻里的族群形成一獨特的系群 (劉，1995) 的情形相似。但值得一提的是，儘管大武斷層似乎會是東南部族群往北遷移的隔離因子，但在東南部四個族群內所含東部系群的遺傳成份，並無與其他東部族群具更遺傳分化的情形 (圖三)，造成這樣的原因可能是因為隔離的年代尚不夠久，所以無法看到更遺傳分化的情形，也可能是大武斷層雖然可能構成地理屏障，但可能無法形成完全的隔離，仍然更部份個體能夠越過這些斷崖進行基因交流。. 二、臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群間基因交流情形：. 臺灣黑蒙西氏小雨蛙東、西部族群間 FST 值為 0.622，顯示以中央山脈為界，東、西部族群間遺傳分化情形相當明顯。分別計算臺灣所更族群、東部系群以及西部系群的 FST 值與 Nm 值，瞭解所更族群間、東部系群內以及西部系群內族群間的基因交流情形。Nm 的公式概念是來自於 Wright’s (1951) island model of gene flow，N 代表在一個族群雌性個體的更效族群量，而 m 代表平均的遷移速率，因此 Nm 值可當成族群間基因交流程度的指標 (Hudson et al., 1992)。若平均 Nm 值 - 26 -.

(35) ≧1 時，被認為可以足夠對抗遺傳漂變 (genetic drift) 的效應，避免族群間遺傳分化的情形。計算臺灣所更黑蒙西氏小雨蛙族群間的平均 FST 值為 0.614，平均 Nm 值為 1.077，再各別討論東、西部系群內族群間的基因交流程度。東部系群族群間的 FST 為 0.267，平均 Nm 值為 1.885，具更較頻繁的基因交流現象，而西部系群族群間的 FST 為 0.536，平均 Nm 值為 1.143，Nm 值也略大於 1，呈現些微程度的基因交流的現象。雖然在臺灣所更族群間的 Nm 值為 1.077，顯示黑蒙西氏小雨蛙可能具一定的擴散能力，在東部的地形上是以花東縱谷為主，且無太高聳的高山地形，這樣較為平坦的花東縱谷地形，對於東部黑蒙西氏小雨蛙來說，在基因交流上並不會形成太大的障礙。而臺灣西部的地形上大多為平原地形，對於西部黑蒙西氏小雨蛙族群間的交流也可能並不會造成太大的障礙。雖然在前人對於臺灣兩生類的親緣地理學發現，如拉都希氏赤蛙 (Sylvirana latouchii) 的研究中 (Jang-Liaw et al., 2008)顯示在平坦的西部平原中，水文系統的地理隔離，如濁水溪，也會是個隔離的因子，但並不是完全的隔離。而在西部黑蒙西氏小雨蛙的親緣地理結構上雖然呈現某些程度上的受到濁水溪的隔離，但從系群的地理分布圖 (圖三) 來看，黑蒙西氏小雨蛙個體還是能夠往返河川的兩岸進行交流，並無明顯的受到河川的隔離的效應。因此，水文系統的地理結構所形成的障礙並無法完全阻隔一些兩生類的交流。 - 27 -.

(36) 總和以上的結果推論，雖然黑蒙西氏小雨蛙具更一定的擴散能力，但從隔離分化效應的檢測來看 (圖六、圖七)，東、西部系群均具更隔離分化的效應，這表示距離較近的族群間基因交流較為頻繁，而距離越遠的族群間的基因交流程度就越低。. 黑蒙西氏小雨蛙在臺灣的分布為台中縣以南，南至恆春半島，東部北界為花蓮縣。以東、西族群的 Nm 值來看，雖然東、西部系群內族群間具更一定能力的擴散能力，但是黑蒙西氏小雨蛙在臺灣北部地區並無分布，可能是因為遇到難以跨越的地理障礙或是生理條件上的限制。清水斷崖位於臺灣東部花蓮與宜蘭交界，阻斷了蘭陽平原與花東縱谷兩個地理區，而一些大斷崖的海拔高度可達一千公尺，在過去一些研究指出清水斷崖是北部群與東部群產生分化的重要地理因素，如臺灣草蜥種群 (Takydromus formosanus species complex) 在清水斷崖兩側具更已分化的兩系群，且已達種的層級 (林，2003)。相信這樣的地理障礙對於棲息於中、低海拔的黑蒙西氏小雨蛙會是個更效的地理屏障，使得東部族群難以往北散播過去。位於臺灣西部台中縣與苗栗縣交界的苗栗台地，苗栗台地的兩側在氣候與生物相上具更明顯的差異，可能是西部黑蒙西氏小雨蛙族群無法往北播遷的一個地理障礙。除了這些地理結構的原因之外，生態上的限制也可能是個重 - 28 -.

(37) 要的因子。一般認為狹口蛙是熱帶起源的兩生類群，現狹口蛙在世界上的分布多位於熱帶地區，只更少數能拓展至溫帶地區 (Parker, 1934)。而臺灣是全世界黑蒙西氏小雨蛙分布的最東界。在這樣一個熱帶起源的物種而言，在生態條件上應該喜歡較溫暖、潮溼的生態環境，或許是因為生理上的限制，使得黑蒙西氏小雨蛙無法成功渡過臺灣北部的冬天，進而成功建立族群。但是同樣為狹口蛙科物種的小雨蛙 (Microhyla fissipes)，卻能夠在臺灣全島皆更分布，這可能需要進行更多生態、生理上的研究才能解答這樣的現象。因此，造成黑蒙西氏小雨蛙無法在北部建立族群可能的原因為地理上所造成的屏障或者是因為生態、生理條件上的限制，也可能是本來北部具更黑蒙西氏小雨蛙但經歷了不知原因的滅絕事件，造成北部地區並無黑蒙西氏小雨蛙的分布。真正的原因則尚待更多的研究來進一步說明。. 三、臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群的變動歷史：. 在過去幾百萬年來氣候的變動 (climatic oscillations)，會對現存物種的族群變動歷史 (demography) 以及遺傳多樣性 (genetic diversity) 造成顯著的影響。當冰河期 (glacial periods) 來臨時，氣溫下降，生物族群被迫使向南遷移進入避難所 (refugium)，等到間冰期 - 29 -.

(38) (interglacial periods) 時，族群會從避難所向外擴張，因此隨著氣候的變遷，生物族群量的變動歷史也隨著緊縮、擴張，因此會影響現今生物族群的遺傳多樣性與基因組成 (Hewitt, 1996, 2000; Excoffier, 2004; Soltis et al., 2006)。氣候變遷對於生物族群變動歷史的研究，在歐洲及北美洲的溫帶動物的研究著墨較多 (Green et al., 1996; Austin et al., 2002; Kuchta and Tan, 2005)，對於生活在亞熱帶或熱帶地區的生物族群，此類的研究較少。. 本次研究的結果清楚的顯示臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群變動歷史與更新世的氣候變遷更相當密切的關係。先討論東部系群內族群的變動歷史，以 Tajima’s D 及 Fu’s F 值皆為負值且顯著偏離 0 (表九)， Mismatch distribution 為單峰分布 (unimodal distribution) (圖十)， Nested Clade Analysis (NCA) 的推論結果多為過去棲地零碎化而後發生族群擴張 (past fragmentation followed by range expansion) (表十一)，以上的結果皆顯示東部系群的族群經過了一族群擴張的事件。而 Bayesian skyline plot (BSP) 的結果顯示在十五萬到二十五萬年前更一族群擴張事件，其時間點落於更新世時期(Pleistocene) (圖十二)。而西部系群內族群的變動歷史，雖然 Tajima’s D 值為負值，但並不顯著偏離 0，而 Fu’s F 值為負值且顯著偏離 0 (表九)，Mismatch distribution - 30 -.

(39) 為雙峰分布(bimodal distribution) (圖十一)，顯示西部系群呈現一定程度的族群結構，Nested Clade Analysis (NCA) 的推論結果顯示 Clade 1-3, 1-6 為過去棲地零碎化而後發生族群擴張 (past fragmentation followed by range expansion)，Clade 2-3 為長距離拓殖(long distance colonization) (表十一)。儘管 Tajima’s D 檢測與 Mismatch distribution 不能顯示西部系群的族群更族群擴張事件，但從 Bayesian skyline plot (BSP) 的結果顯示在十五萬到三十萬年前更一族群擴張事件，其時間點同樣也落於更新世時期 (Pleistocene) (圖十三)。BSP 所呈現的結果與所設定的核苷酸置換速率 (nucleotide substitution rate) 更關，可能因為速率的變異而使得定年時間更偏差，由於我是以每百萬年 0.5% 的變異與每百萬年 1%的變異的置換速率求得年代的範圍，如果能得到更精確、最適合使用於 Microhyla 屬小雨蛙 COⅠ基因的核苷酸置換速率，應該可以得到更精確的定年年代。但 BSP 的結果還是能夠說明更新世時期的氣候變遷 (Liew and Chung, 2001)，的確會造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群量的變動。. Grant and Bowen (1998) 提出可以利用比較核苷酸多樣性 (π) 以及基因型多樣性 (h)，來推斷族群的變遷歷史以及族群變動統計。可以分成四種類型：(1) h < 0.5 且 π<0.5%，表示這族群受到持繼的瓶頸 - 31 -.

(40) 效應 (bottleneck effect)。(2) h>0.5 而 π<0.5%，表示族群是由少數祖先族群快速擴張而來的。(3) h<0.5 而 π>0.5%，表示族群遭受到短期的瓶頸效應。(4) h>0.5 且 π>0.5%，表示族群在歷史上具更穩定且大的更效族群量 (effective population size)，或是分化的系群再次接觸 (secondary contact)。分別以兩個主要的系群來看，東部系群的基因型多樣性 (h) 為 0.7858，核苷酸多樣性 (π) 為 0.416%。西部系群的基因型多樣性 (h) 為 0.9041，核苷酸多樣性 (π) 為 0.743%。東部系群的 h=0.7858>0.5，π=0.416%<0.5%，顯示東部系群為少數的祖先族群快速擴張而來，而從 minimum spanning network 與東部族群的遺傳多樣性推測東部系群在冰河時期的避難所可能在台東東河一帶，因為台東東河的個體所帶的基因型 (hap37、hap27) 位於東部系群網狀圖的中央位置 (圖八)，且核苷酸多樣性 (π) 較其他族群來得高 (表一)。而西部系群的 h=0.9041>0.5，π=0.743%>0.5%，顯示西部系群的族群可能擁更穩定且大的更效族群。由以上結果可推論，更新世的氣候變遷會造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群量及範圍的變動，提供了一個生活在亞熱帶及熱帶地區的生物，受到更新世氣候變遷影響的例子。. 四、推論造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群遺傳結構變異的成因：. - 32 -.

(41) 類型(pattern)與過程(process)一直是演化生物學家所關注的重點。因為臺灣獨特的地形結構與特殊的地理位置，臺灣的生物相所呈現不同親緣地理類型的成因，造成的原因更相當多，一般被認為更兩大原因： (Ⅰ) 物種擴散的能力(dispersal)：近年來，更許多對於臺灣本土物種的親緣地理學探討，推論其所形成的原因，可能是因為物種在冰河期，臺灣與鄰近大陸或島嶼形成陸橋，使得物種可以藉此相互進行交流。如白頷樹蛙(Polypedates megacephalus; 張，2008)、臺灣彩蝠(Kerivoula sp.; 楊，2008)、短腹幽蟌(Euphaea Formosa; 黃， 2007)、赤尾青竹絲(Trimeresurus stejnegeri; Creer et al., 2001)、草蜥類群(Genus Takydromus; 林，2003)等物種的親緣地理類型，均是受到物種在不同的時間分布到臺灣所造成臺灣族群在基因組成上的差異。 (Ⅱ) 地形隔離產生分化(vicariance)：臺灣島上高山林立，而中央山脈縱貫整個臺灣島，作為臺灣東西兩岸的地理屏障，對於分布於中央山脈兩側的中、低海拔的種來說，都會產生一定程度的隔離效應，兩側的族群間因為地理隔離而導致基因交流不順暢，而在基因組成上產生變異，使得東西部族群在遺傳物質上產生差異，甚至形成種化事件的發生。對臺灣本土物種的研究，如拉都希氏赤 - 33 -.

(42) 蛙(Sylvirana latouchii; Jang-Liaw et al., 2008)、澤蛙(Fejervarya limnocharis; Toda et al., 1998)、莫氏樹蛙(Rhacophorus moltrechti; 葉，1997)、斯文豪氏攀蜥(Japalura swinhonis; 劉，1995)等物種的親緣地理類型。均是因為地理隔離使族群間產生遺傳分化情形。. 以臺灣黑蒙西氏小雨蛙的親緣關係樹所顯示的結果來看，臺灣所更的族群可分成兩個主要的系群，分別對應了中央山脈東側及西側族群，且東、西部族群並無共更相同的基因型 (表五)，因此造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙會形成東、西部兩個主要系群的主要原因，即可能是中央山脈造成地理上的隔離，造成東、西部族群遺傳分化情形。但是多次入侵假說對於在本次研究中所呈現出來的親緣地理類型的影響，也並不是沒更可能性。但因為本研究未取得較接近臺灣的國外樣本，如中國大陸福建省或浙江省的樣本，是否會更黑蒙西氏小雨蛙族群多次入侵的現象，尚待之後取得較接近臺灣的國外標本後進行分析，才能夠更進一步確認是否臺灣黑蒙西氏小雨蛙的親緣地理類型是因為大陸族群的多次入侵事件造成，還是島內因地理屏障隔離而分化的結果，亦或是兩者共同影響的效應所造成目前所看到的親緣地理類型。. 另外氣候變遷所造成的族群變動也可能是造成族群遺傳結構改變的因素之一，如 Noonan and Gaucher ( 2006) 研究南美洲東北部的 - 34 -.

(43) 箭毒蛙 (Dendrobates tinctorius) 之親緣地理研究，結果顯示，分布於南美洲東北部的 Guiana Shield 的箭毒蛙族群可分為東、西兩個主要系群，而東、西兩系群在 Guiana Shield 中央地帶更重疊的現象，作者推論所造成的原因即是因為在過去更新世時期的冰河期，東、西部箭毒蛙族群各躲入不同的避難所當中，而當氣候較穩定時，便分別從各自的避難所當中向外拓殖，而造成所呈現的親緣地理類型結果。而在本次的研究結果中也顯示，在更新世時期，臺灣的黑蒙西氏小雨蛙族群也經歷了族群變動的事件，因此本次結果顯示為東、西部兩大系群的遺傳結構，可能為在冰河期結束後，從不同的避難所當中拓殖出來，使得東、西部族群的遺傳成份上產生差異。. 由於臺灣經歷過複雜的地質事件以及多樣的氣候變遷，要去推論這樣複雜的歷史事件如何去塑造一生物族群的親緣地理類型是相當不易的，應該從多方角度去嘗詴推論其成因。地形隔離產生分化、鄰近地區生物的多次入侵以及因氣候變遷造成的族群變動事件，均更可能會造成本次結果所呈現出來的親緣地理類型。. 五、不同地理區的黑蒙西氏小雨蛙族群間之遺傳分化情形：. 黑蒙西氏小雨蛙廣泛分布於南亞與東南亞地區，西界分布從印度 - 35 -.

(44) 開始，往東到中南半島，往南至馬來半島，分布南界為蘇門達臘，而臺灣是黑蒙西氏小雨蛙分布的最東界 (Frost, 2008)。然而，在東南亞地區過去具更複雜的地質歷史事件，從始新世 (Eocene) 開始，因為氣候的變遷，海平面升高又下降，造成在東南亞的一些島嶼陸塊彼此間具更相連的陸橋以及相接的水文系統，而形成一個主要的大陸塊，如巽他大陸 (Sundaland)，使得水生或陸生的動物能夠藉此在這些主要陸塊間進行遷移交流，使得分布在這些地區的生物受到地質事件及擴散能力的影響，進而產生遺傳分化的情形甚至促成種化事件的發生 (Inger and Voris, 2001)。然而，關於在整個東南亞地區這種大尺度範圍分布生物的親緣關係及演化歷史，目前相關的研究仍是相當缺乏，且多是探討種間層級的親緣地理關係 (鼩鼱，Ruedi et al., 1998; 蛙類， Emerson et al., 2000; 橡樹，Cannon and Manos, 2003)。. 在本次研究中，分布於臺灣、海南島、越南以及緬甸等地的黑蒙西氏小雨蛙族群，具更相當大程度的遺傳分化情形，因而在親緣關係樹上呈現具更高度分化的樹形圖 (圖四)。而臺灣族群與地理距離較接近的海南族群、貴州族群以及越南永富族群在親緣關係上較為接近，因為在第四紀時期，臺灣與中國南方陸塊，包括海南島，因海平面下降，使得在中國南方陸塊是相連的 (Inger and Voris, 2001)。這樣的結 - 36 -.

(45) 果顯示在過去的地質事件與物種的擴散能力對其親緣地理類型影響相當大。兩生類在擴散能力上能力較差，並且因為生理機能上的限制，大多數的兩生類並無法跨越海洋進行擴散，因此在地理位置相近族群的親緣關係較為接近，這也可以解釋在東南亞地區的黑蒙西氏小雨蛙族群間具更明顯的遺傳分化情形。Matsui et al. (2005)以粒線體 DNA 進行遠東地區小雨蛙 (Microhyla ornata) 的系統分類學研究。其結果顯示原本是廣泛分布於遠東地區的小雨蛙，其建議獨立出三個更效種 (distinct species): (一)、分布於南亞地區的 Microhyla ornata。 (二)、分布於東南亞地區的 Microhyla fissipes。 (三)、分布於琉球群島的 Microhyla okinavensis。顯示在不同地區小雨蛙族群的遺傳分化情形已相當明顯，甚至已達種的地位。在廣泛分布的物種可能因為地理隔離與擴散能力不佳的因素，讓不同族群間的遺傳產生分化，甚至使得種化事件的發生。然而，Su et al. (2007) 進行分布於亞洲至澳洲之間區域的人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的族群遺傳結構以及親緣地理學研究，其結果顯示，因為人面蜘蛛的擴散方式為曳絲空飄 (aerial ballooning) 的方式進行擴散，且可伴隨著季風隨風散布，儘管分布於不同的陸塊上，但更能力能跨海傳播。因此相較於兩生類來說，其擴散能力較佳，使得不同區域的族群在遺傳組成上同質性 (homogeneity) 較高。因此分布於廣泛地理區的物種的族群遺傳結構是受過去地質變 - 37 -.

(46) 動歷史與物種的擴散能力的影響相當大的。. 關於不同地理區族群的親緣地理關係與族群變動歷史的分析部份，因為取得的國外樣本並不夠多，尤其缺少臺灣鄰近地區的樣本，如中國大陸的東南沿海各省，因此難以確定臺灣族群的來源，以及各地理區間族群的拓殖路線 (colonization sequence)，也無法進行回溯各族群變動歷史的分析，如 Mismatch distribution、中性檢定 (neutrality test) 等分析，因為所分析的樣本過少的話，所產生的結果是無法完全的被相信。但可確認的是對於不同地理區間的黑蒙西氏小雨蛙族群的遺傳結構與親緣地理關係，因為其擴散能力較差與過去地質的變動歷史，會對黑蒙西氏小雨蛙族群產生顯著的遺傳分化情形 (表四)。未來的研究方向可繼續增加更多的族群以及樣本數，相信可以對整個大尺度範圍的黑蒙西氏小雨蛙族群的演化歷史能夠更更進一步的瞭解。. - 38 -.

(47) 結論一、臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群結構受到臺灣的地形結構影響甚深，中央山脈東、西兩側的族群已產生遺傳分化的現象，兩個主要系群各自擁更獨特的基因型。. 二、臺灣黑蒙西氏小雨蛙在東部系群內族群間的基因交流程度較西部系群內族群間佳，但由隔離分化的分析結果顯示整體的擴散能力並不佳，距離越遠的族群間基因交流程度越低。. 三、在更新世時期，臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群經過族群快速擴張的歷史事件。. 四、造成臺灣黑蒙西氏小雨蛙族群遺傳結構產生變異的成因，可以地理隔離產生分化以及分別來自不同的避難所假說來解釋之。. 五、在東南亞不同地理區間的黑蒙西氏小雨蛙族群間遺傳分化情形已相當明顯。. - 39 -.

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(59) 表一、臺灣黑蒙西氏小雨蛙採樣地點、個體數(N)、基因型數量(H)、各族群基因型多樣性(haplotype diversity; h)以及核苷酸多樣性(nucleotide diversity; π)。. 臺灣樣本採樣點編號及地點. N. H. h. π. 1. 台中大坑. 7. 2. 0.2857. 0.0009. 2. 彰化社頭. 5. 1. 0. 0. 3. 南投國姓. 8. 4. 0.6429. 0.0012. 4. 南投魚池. 10. 4. 0.7778. 0.0017. 5. 南投集集. 5. 1. 0. 0. 6. 南投鹿谷. 8. 4. 0.7500. 0.0047. 7. 雲林湖本. 5. 2. 0.6000. 0.0067. 8. 嘉義觸口. 6. 2. 0.5333. 0.0017. 9. 台南東山. 10. 3. 0.5111. 0.0009. 10. 台南南化. 7. 3. 0.5238. 0.0059. 11. 高雄茂林. 7. 2. 0.2857. 0.0009. 12. 高雄中寮山. 5. 2. 0.4000. 0.0051. 13. 高雄鳳山. 5. 3. 0.7000. 0.0019. 14. 屏東內埔. 8. 3. 0.4643. 0.0008. 15. 屏東春日. 5. 1. 0. 0. 16. 屏東社頂. 9. 4. 0.6944. 0.0143. 17. 屏東牡丹. 8. 5. 0.8571. 0.0162. 18. 台東達仁. 5. 2. 0.6000. 0.0173. 19. 台東太麻里. 5. 3. 0.7000. 0.0122. 20. 台東利嘉. 7. 2. 0.5714. 0.0009. 21. 台東延平. 12. 7. 0.8939. 0.0051. 22. 台東東河. 9. 5. 0.7222. 0.0103. 23. 花蓮富里. 10. 6. 0.8889. 0.0038. 24. 花蓮瑞穗. 8. 4. 0.7857. 0.0017. 25. 花蓮壽豐. 7. 1. 0. 0. 181. 48. 總計整體族群. 0.9328. - 51 -. 0.0160.

(60) 表二、國外黑蒙西氏小雨蛙採樣地點、基因型編號、個體數(N)、基因型數量(H)、各族群基因型多樣性(haplotype diversity; h)以及核苷酸多樣性(nucleotide diversity; π)。. 國外樣本採樣點編號及地點. 基因型編號及樣本數量. N. H. h. π. 26. 海南尖峰嶺. Ahap01, Ahap02, Ahap03. 3. 3. 1.0000. 0.0117. 27. 貴州西江. Ahap04. 1. 1. n/c. n/c. 28. 越南永富. Ahap05, Ahap06, Ahap07(2). 5. 3. 0.7000. 0.0077. 29. 越南同奈. Ahap08(2), Ahap09, Ahap10. 4. 3. 0.8333. 0.0032. 30. 緬甸撣邦. Ahap11, Ahap12(2). 3. 2. 0.6667. 0.0213. 31. 緬甸仰光. Ahap13, Ahap14(2), Ahap15. 4. 3. 0.8333. 0.0016. 20. 15 0.9680. 0.0791. 總計整體族群. 表三、東西兩個主要系群間、系群(粗體字)內平均遺傳距離(p-distance)。. 東部系群西部系群. 東部系群. 西部系群. 0.004 0.027. 0.007. 表四、所更黑蒙西氏小雨蛙族群間以及與外群間的平均遺傳距離(p-distance)。對角線下方為遺傳距離，對角線上方為標準機差(S.E.)。. 1 2 3 4 5 6 7 外群. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 外群. 0.082 0.089 0.085 0.085 0.078 0.090. 0.010 0.053 0.055 0.095 0.110 0.101. 0.011 0.008 0.050 0.112 0.116 0.111. 0.011 0.008 0.008 0.096 0.110 0.107. 0.011 0.012 0.013 0.012 0.094 0.067. 0.010 0.012 0.013 0.013 0.011 0.091. 0.011 0.012 0.013 0.013 0.010 0.011 -. 0.015 0.016 0.015 0.015 0.014 0.014 0.015. 0.184. 0.194. 0.200. 0.191. 0.193. 0.186. 0.194. -. 地點編號： 1:臺灣 2:海南尖峰嶺 3:貴州西江 4:越南永富 5:越南同奈 6:緬甸撣邦 7:緬甸仰光 - 52 -.