利用一價溴化銅區位選擇活化4-pyridone及uracil衍生物碳氫鍵進行芳基化反應

全文

(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文指導教授：簡敦誠博士. Regioselective Arylation of Uracil and 4-Pyridone Derivatives via Copper(I) Bromide Mediated C-H Bond Activation. 利用一價溴化銅區位選擇活化 4-pyridone 及 uracil 衍生物碳氫鍵進行芳基化反應. 研究生：程健中華民國一零一年七月.

(2) 謝誌. 在師大兩年的碩士生涯，首先，感謝我的父母，給予我莫大的支持及鼓勵，儘管一句簡單的打氣，都是我繼續向前邁進的動力來源。最感謝的是我的指導教授簡敦誠博士，總是不厭其煩叮嚀我實驗的危險，灌輸重要的化學觀念；在討論實驗的過程中，教導我利用不同的角度，來思考其中的細微變化；並建議我未來有多種選擇，指引一條正確的道路。感謝口試委員高佳麟教授及本校林文偉教授，能撥空對我的論文指教及建議。. 感謝實驗室學長諭樵、振傑，總是不厭其煩的教導我化學觀念、協助我突破實驗上的困難及提點我在實驗中必須掌握的關鍵。感謝同儕們嘉祺、元棟、雅媖，在實驗室度過這兩年的歡笑及彼此間的互相鼓勵。感謝學弟妹佩樺、俊琦、宗翰、志偉，教學相長及陪伴，讓實驗室能夠永續的經營，並且在生活上的互相扶持。也感謝我所有在師大的朋友們。. 程健謹誌於國立臺灣師範大學化學系碩士班中華民國一百零一年七月.

(3) 簡. 歷. 姓名: 程健生日: 1986/11/22 籍貫: 台北市學歷:民國 99. 私立天主教輔仁大學化學系畢業. 民國 101 國立臺灣師範大學化學研究所畢業.

(4) Table of Contents Table of Contents……………………………………………………………………...I List of Abbreviations………………………………………………………………..III. Topic I Regioselective Arylation of Uracil and 4-Pyridone Derivatives via Copper(I) Bromide Mediated C-H Bond Activation 利用一價溴化銅區位選擇活化 4-pyridone 及 uracil 衍生物碳氫鍵進行芳基化反應. Abstract……………………………………………………………………………....V 摘要…………………………………………………………………………….........VI Chapters I.. Introduction. 1-1.. C-Aryl-Substituted Uridine……………………………………………...…...1. 1-2.. Direct C-H Arylation of 1,3-dimethyluracil………………………………….3. 1-3.. Ullmann reaction……………………………………………………………..6. II. Synthesis of 6-Aryl-Substituted Uracil Derivatives 2-1.. Results and Discussion………………………………………………………8. 2-2.. Conclusion………………………………………………………………….26. III. References………………………………………………………………………27. I.

(5) Topic II Design and Synthesis of 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uridine Derivatives 設計及合成 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uridine 衍生物. Abstract……………………………………………………………………………VIII 摘要…………………………………………………………………………….........IX Chapters I.. Introduction 1-1.. Orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (ODCase) …………………...30. 1-2.. Machanism against ODCase………………………………………………..33. II. Synthesis of 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uracil & 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uridine 2-1.. Introduction………………………………………………………………...39. 2-2.. Results and Discussion. 2-2-1.. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil…………...40. 2-2-2.. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine………….43. 2-3.. Conclution……………..…………..………………………………..………47. III. Reference………………………………………………………………………..48 IV. Instrumentation, Experiment Section and Spectral Data 4-1.. General Experiment Processing………………………………………….…50. 4-2.. Instrumentation……………………………………………………………..50. II.

(6) List of Abbreviations Ac2O. Acetic anhydride. min. minute(s). Bn. Benzyl. mol. mole(s). BOMCl. Benzyloxymethyl chloride. m.p.. Melting point. o. Degree Celsius. MS. Mass spectrometry. CAN. Cerium (IV) ammonium nitrate. NBS. N-bromosuccinimide. DABCO. 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane. NMR. nuclear magnetic resonance. DBU. 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene. Ph. Phenyl. DMAP. 4-Dimethylaminopyridine. 1,10-Phen. 1,10-Phenanthroline. DMF. N,N-Dimethylformamide. PMBCl. para-Methoxybenzyl chloride. DMSO. Dimethyl sulfoxide. ppm. Parts per million (in NMR). EtOAc. Ethyl acetate. Rf. retention factor. g. gram(s). rt. room temperature. h. hour(s). T. temperature. Hex. Hexane. TBAI. Tetra-n-butylammonium iodide. Hz. Hertz. TBDMSCl. tert-Butyldimethylsilyl chloride. J. Coupling constant (in NMR). TBDPSCl. tert-butyldiphenylsilyl chloride. M. Mole(s) per liter. TFA. Trifluoroacetic acid. m/z. Mass to charge ratio. THF. Tetrahydrofuran. (in mass spectrometry). TMEDA. Tetramethylethylenediamine. C. III.

(7) Topic I. Regioselective Arylation of Uracil and 4-Pyridone Derivatives via Copper(I) Bromide Mediated C-H Bond Activation. 利用一價溴化銅區位選擇活化 4-pyridone 及 uracil 衍生物碳氫鍵進行芳基化反應. IV.

(8) Abstract. C-Aryl-substituted uridine derivatives are an important class of pyrimidine nucleoside analogs that has received considerable attention in recent years. Very few examples of 6-aryluridines have been reported in the literature.. In general, the introduction of an aryl group at 6-position of uracil was limited to the following two ways: (1) photochemical arylation from the 6-iodouridines. (2) Suzuki-Miyaura and Stille cross-coupling reaction from 6-iodouridines. Both methods were restricted by the difficulty for the preparation of 6-iodouridines.. In the past decade, the direct C-H activation for arylation has become an effective method for the introduction of diverse aromatic and heteroaromatic substituents. The focus of this thesis was to develop an effective method which could directly activate the C-H on the uracil or 4-pyridone to undergo the coupling reaction with aryl iodides.. Herein,. we. reported. a. general. and. practical. synthesis. of. 6-aryl-1,3-dimethyluracil derivatives from 1,3-dimethyluracil (1,3-DMU) derivatives via the copper-mediated C-H bond activation as a reaction model for uridine. The reaction scope is generally applicable to a variety of uracil derivatives. In addition, the deuterium isotope studies were carried out in order to gain insight into the reaction details. A preliminary reaction mechanism was proposed based on the isotope effect data.. 關鍵字：碳氫鍵活化. V.

(9) 摘要. 尿嘧啶核苷 (uridine) 在 5-位或 6-位上含有芳香環取代的類似物是嘧啶核苷酸 (pyrimidine nucleotides) 中重要的一類衍生物，近年逐漸地受到重視。但 6-aryluridines 合成及應用的相關文獻卻非常有限。. 一般而言，在 uridine 的 6-位中引進芳基團，僅限於以下兩種方式： (1) 在 6-iodouridines 上利用光化學 (photochemical) 進行芳基化反應；(2) 在 6-iodouridines 利用 Suzuki-Miyaura 和 Stille 交叉耦合 (cross-coupling) 進行芳基化 (arylation) 反應。但 6-iodouridines 製備困難，而限制了此方法的應用性。. 在過去十年間，直接針對 C-H (碳-氫) 鍵活化而進行 arylation 逐漸成熟，因此可應用在多種芳香環及雜芳香環上。而本論文研究即針對 uracil 和 4-pyridone 與 aryl iodides 直接將 C-H 鍵活化，進行交叉耦合反應。. 因此，我們報導實用且一般性的合成，利用 1,3-dimethyluracil 及其衍生物作為 uridine 的模型，藉由銅金屬 (copper) 催化經由 C-H 鍵的活化而合成 6-aryl-1,3-DMU 的衍生物。此外，利用同位素效應的研究，更進一步地了解反應的細節，並經由同位素效應的實驗數據，推測出可能的反應機制。. Keyword : C-H activaiton VI.

(10) Chapter I : Introduction 1-1. C-Aryl-Substituted Uridine. Uridine 在 5-位或 6-位上含有芳香環取代的類似物是嘧啶核苷酸 (pyrimidine nucleotides) 中重要的一類衍生物。近年來研究發現，針對 5位和 6- 位上具有芳香環取代的尿嘧啶鹼基 (uracil bases) 及核苷類 (nucleosides) 的化合物，均具有可抑制細胞生長 (cytosatic) 及抗病毒 (antiviral) 的生物活性 (biological activities)。1-3 5-Aryluridines 已經廣泛應用在去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid) 中，作為螢光探針來研究其中的電子轉移； 4-13 或作為生物感測器，偵測與 uridine 相關的蛋白質 (protein) 序列。14 合成上，可以經由 5-halouridines 由鈀 (palladium) 催化，利用 Suzuki-Miyaura reaction 4-9,14-16,24,25 和 Stille 10-13,17-23,25 的反應，進行交叉耦合反應而得到 5-aryluridines。相較之下，卻少有文獻報導 6-aryluridines 的合成方式以及應用，26-31 一般而言，在 uridine 的 6-位引進芳基團，僅限制於以下兩種方式：(1) 在 6-iodouridines 上利用光化學進行 arylation ； 31 (2) 6-iodouridines 與 arylstannanes 或 6-tributylstannyluridines 與 aryl halides 進行 Stille 交叉耦合反應。27-20 而在 2010 年，26 Van Calenbergh 首先在 Org. Biomol. Chem. 發表了利用 Suzuki-Miyaura 交叉耦合反應而製備 6-aryluridines 的合成方式。我們團隊於次年， 32 史諭樵學長在 Tetrahedron 中發表以 6-iodouridines 使用 Suzuki-Miyaura 交叉耦合反應而形成 6-aryluridines 的優化條件。2012 年，33 Piet Herdewijn 在 Tetrahedron Lett. 中研究指出，想要利用鈀催化針對 6-iodo 2’-deoxyuridine nucleoside 的類似物進行 Suzuki-Miyaura 交叉耦合反應，但因醣苷鍵 (glycosidic bond) 不穩定，所以作者利用 1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl (TIPS) 保護，並且使用 1.

(11) 等劑量的 copper thiophene carboxylate (CuTC) 作為共同催化試劑，成功地合成了一系列的類似物。儘管這些條件已然發展的足夠成熟，但起始物 6-iodouridines 的製備不易，以及反應的產率不佳，導致此方法具有很大的限制性。. Scheme 1-1. Strategies for the C-C bond formation C. X. X. C. pre-activation. C. C. path I. C. C. path II. C. C. path III. two side C. X. H. C. C. H. H. C. pre-activation one side [O]. 形成 C-C (碳-碳) 鍵結的方式，大多使用傳統的交叉耦合反應來製備，例如 Suzuki-Miyaura 和 Stille 反應經常被應用於 C-C 鍵形成上。但近年來，由於金屬催化的發展，可先活化兩端基團再利用催化而形成 C-C 的鍵結 (Scheme 1-1, path I)；或是直接將兩端都未活化的基團，利用引導基團 (directing group) 的催化，進而得到 C-C 鍵結的生成 (Scheme 1-1, path III)；或是近期發展較完備的方式，直接利用 aryl halides 與雜環基團進行反應而製備 (Scheme 1-1, path II)。因此本篇論文主要以尿嘧啶 (uracil) 作為 uridine 的模型，希望以 path II 合成策略利用 C-H 交叉耦合反應合成 6-aryluracil 衍生物。. 2.

(12) 1-2. Direct C-H Arylation of 1,3-dimethyluracil (1,3-DMU) 直接針對 C-H 鍵結活化而進行 arylation 逐漸成熟，並可應用在廣泛的芳香環及雜芳香環上，34-39, 49-50 故以此方法來設計合成策略。一般而言，在雜環上 π-電子密度低 (π-electron-poor) 的位置，通常較容易利用金屬催化進行 C-H arylation。40-41 在針對 C-H arylation 的反應中，能夠應用作為催化反應的金屬非常廣泛，大多是利用過渡金屬的錯合物 (transition metal complex) 。目前，常利用鈀的錯合物 (Pd complex) 進行催化，其中，也可加入銅的鹽類 (Cu salts) 來作為共同催化的試劑。文獻指出當反應不加入銅催化時，反應的機制類似 concerted metalation deprotonation (CMD)，42-44 首先，鈀催化 aryl halide 進行氧化加成 (oxdative addition)，隨後再加成至另一芳香烴上 (arene) ，同時 C-H 鍵斷開，而形成 C-Pd 鍵結後，再經由還原脫去 (reductive elimination) 而形成二芳基團 (biaryl) 的產物。但相反的，若反應中添加銅催化時，則是一種新的反應機制，45-47 先形成芳香銅 (aryl cuprate) 的化合物，再經由交叉耦合與 aryl halide 反應而得到產物。在 2009 年，48 Michal Hocek 在 Eur. J. Org. Chem. 發表了以鈀催化，再利用銅添加與否，控制 1,3-DMU 進行 C-H arylation 的位向，作者也嘗試多種不同的 aryl halides (4-iodotoluene, 2-iodotoluene, 4-iodoanisole, 4-iodobenzene, 2-bromonaphthalene, 1-bromopyrene)，但此反應的時間過長，需要 50 小時以上的反應時間；而區位選擇性不佳，而在 6-位反應的產率最高雖有 72% 但也含有在 5-位進行 arylation 的混合物 (Scheme 1-2)。. 3.

(13) Scheme 1-2. Preparative C-H arylation of 1,3-DMU. O Me O. Ar. N. Method A Ar-X, Pd(OAc)2, P(perFPh)3, Cs2 CO3 DMF, 160 oC, 50 h. N. O. N Me. Method B Ar-X, Pd(OAc)2, CuI P(perFPh)3 , Cs2CO3 DMF, 160 oC, 50 h. O Me. 48. O Me. Method C Ar-X, CuI, Cs2CO3 DMF, 160 oC, 50 h. N Me. major product. O. N N Me. Ar. major or only product. 在 2011 年，49 Michal Hocek 在 J. Org. Chem. 發表了一篇用不同的保護基來保護 uracil 的文獻，並且觀察當 N 端保護不同保護基時，uracil 的反應活性、選擇性、產率變化、並找出去保護基的方式，以增加此方法的應用性。以 4-iodotoluene 為反應物，並深入探討當產物為 5-aryluracil 時，N 端保護為 p-methoxybenzyl (PMB) 可以利用 BBr3 去保護，而產率有 62% 為最佳；而 N 端保護為 benzyl (Bn) 可以利用 HCO2NH4 和 1.1 當量的 10% Pd/C 去保護，而產率有 98% 為最好；但當產物為 6-aryluracil 時，只針對當 N 端保護為 Bn 時進行去保護的探討，同樣可以使用上述的兩種方式，但在不同例子中，需使用不同的去保護試劑 (Scheme 1-3)。. Scheme 1-3. Deprotection of 5-substituted-uracil 49 O R. R= R= R= R=. R. deprotection. N. O. O. N R PMB PMB Bn Bn. O. R = PMB or Bn Method Method Method Method. A B A C. O H. Tol. N. O. N H 82% 0% 0% 0%. Tol. N. : : : :. N H 0% 62% 98% 15%. Method A : HCO 2NH4 , 10% Pd/C (1.1 equiv), MeOH, 72 o C, 17 h Method B : BBr3 , m-xylene, pressure tube 140 o C, 5 h Method C : BBr3 , m-xylene, ref lux,140 o C, 19 h. 4.

(14) 隨後 2011 年，50 Jae Nyoung Kim 在 Tetrahedron Lett. 發表一篇文獻，利用鈀催化進行 C-H arylation，並推論出形成 5-aryluracils 的反應機制可能為 electrophilic metalation-deprotonation，由 pivalate 在 uracil 的 1-位上形成 enamine，再區域選擇性地選擇在 5-位 π-電子密度高的位置與較缺電子的鈀金屬進行 palladation，同時利用 pivalate 穩定 N1 上的電荷，隨後 pivalate 螯合在 5-位氫及鈀金屬上面，再經由電子轉移而脫去 pivalic acid，最後脫去鈀金屬而得到 5-aryl-1,3-DMU，而同時也可經由 Heck-type 的反應機制得到了 6-位進行 arylation 的副產物，但也可以直接的經由 CMD 的反應機制得到產物 (Scheme 1-4)。 Scheme 1-4. Pd catalyzed 5-arylation and 6-arylation of 1,3-DMU 50 O Me Ar-Pd PivO. O Me O. N. regioselective O electrophilic palladation (major process). N. Me N Me. O Ar-PdBr. O. H PdAr. N Me. Me. N. O. PivO. N. Pd. O Me. O Ar - PivOH. N. O. Me. O N. O. H. Me. PdBr N H Me. O. Me. O Competitive PdBr Heck type Me N H carbopalladation (minor process) Ar O N H Me. Me O. Ar. N. N. OPdBr H N Me. - Pdo. N Me. O. OH Ar H PdBr H. PdAr. N. Ar H. Me. N. O. N Me. O H Ar PdBr H. O. N N Me. O. N Me. - HBr H PdBr Ar H. Ar. N. - Pdo. O Me. Me. O Me O. N N Me. Ar. 因此，本篇論文就以此為目標，針對 1,3-DMU 進行催化反應，不同於之前反應設計的途徑，我們希望只使用銅作為單一的催化劑進行 C-H arylation，並且深入的探討本實驗的反應機制。. 5.

(15) 1-3. Ullmann reaction 在 1901 年，Fritz Ullmann 和 Irma Goldberg 報導新的合成方式 (Scheme 1-6) ，利用銅進行芳香親核取代反應 (aromatic nucleophilic substitution reaction) 合成 biaryl 的化合物，在反應中，需要使用等計量銅錯合物及高溫的條件。而近年研究發現，只需在其中加入螯合基 (ligands) (ex : diamines, aminoalcohols, diketones, diols) 即可用催化劑量的銅催化反應，因而擴展此反應的應用性。. Scheme 1-6. Ullmann reaction [Cu] X. X R1. R1. > 200o C. R1 R1 symmertrical biaryl. [Cu] X. X. R1. heat. R2. R1 , R2 = H, CN, NO2 R, I, Br Cl X = I, Br, Cl, SCN. R1 R2 unsymmertrical biaryl. Solv. = DMF, pyridine, quinoline, nitrobenzene.... 近期對 Ullmann 反應研究反應機制的結果顯示，大致可分為五種不同的機制：(1) 將 aryl halide 利用氧化加成形成 Cu(III) 的中間體，再還原脫去。(2) σ-bond 歧化反應 (metathesis) 而 Cu (II) 則保持原來的氧化態進行催化。(3) 單電子轉移 (single electron transfer) (SET) 將 aryl halide 藉由 radical anion 形成 (Cu(I)/Cu(II))。(4) π-complexation 經由 Cu (I) 與 aryl halide 進行類似親和取代的反應 (nucleophilic substitution reaction)。(5) 利用碘原子轉移. (iodine atom transfer) (IAT) 形成. aryl radical. (Cu(I)/Cu(II))，而最後一點反應機制的推論較少。因此，另外一篇論文則是以較可能的四種的反應機制來推測，當加入不同試劑時，是否改變反應速率；及推、拉電子的取代基是否會增加反應的速率，來區別出彼此不同 6.

(16) 的差別，及反應機制的類型 (Scheme 1-7)。51-52. Scheme 1-7. Distinguish between the four possible reaction mechanisms in the modified Ullmann reaction 51-52. 7.

(17) Chapter II : Synthesis of 6-Aryl-Substituted Uracil Derivatives 2-1. Results and Discussion 首先，史諭樵學長以 1,3-DMU 作為起始物，利用 0.4 當量 CuI 為催化劑；2 當量 NaOtBu 為鹼；0.4 當量 1,10-phenantroline (1,10-Phen) 為螯合基；2 當量的 iodobenzene 為反應物，控制反應濃度為 2 M 在 DMF 下以 125 oC 和 65 小時進行反應，可以得到 6-phenyl-1,3-DMU (Table 2-1, entry 1)，因此推論此反應或許具有區位選擇性。隨後增加鹼的當量數優化條件，但產率並沒有明顯的上升 (Table 2-1, entry 2)，因此固定反應時間為 24 小時、125 oC 及反應濃度為 2 M，改變銅金屬、鹼、及螯合基的來源，但反應後大多只回收起始物，唯有一些條件能得到低於 10% 的產率 (Table 2-1, entries 3-12)；隨後固定為 20 小時、85 oC 及反應濃度為 0.5 M，在上述條件進行反應，卻也無法得到較高的產率 (Table 2-1, entries 13-22)。最後，不使用螯合基進行反應，發現當利用 0.4 當量 CuI 為催化劑加入 2 當量 LiOtBu 為鹼，在 0.5 M 的 DMF 濃度以 120 oC 下反應 5 小時，可以得到 6-phenyl-1,3-DMU 產物 52%，在同條件下，相較於加入螯合基的條件中，產率明顯提升，且只得到少於. 3% 的. 5-phenyl-1,3-DMU (Table 2-1, entries 23-24)，並且可由 Ullmann 的反應機制中，首先排除利用銅催化進行氧化加成及電子轉移的方式，因添加螯合基後反而降低了反應的活性。而實驗證實，反應在一小時內即可完成，並且具有區位選擇性，故提升此方法的價值。. 8.

(18) Table 2-1. Examination of reaction condition of 1,3-DMU (史諭樵學長實驗表格) O Me O. Entryb, c 1. CuX , arylating reagent. Me. ligand, base, N Me. H. H. N. O. solvent, temperature. Me. N Me. Ar. O. Ar. N N Me. H. Catalyst. Base. Ligand. Temp.. Time. Yielda. [0.4 eq]. [eq]. [eq]. [oC]. [h]. [%]. t. 1,10-Phen (0.4). 125. 65. 27. t. CuI. NaO Bu (2). 2. CuI. NaO Bu (5). 1,10-Phen (0.4). 125. 65. 23. 3. CuI. Cs2CO3 (2). PPh3 (0.8). 125. 24. S.M.. 4. CuI. K3PO4 (2). 1,10-Phen (0.4). 125. 24. S.M.. 5. CuI. DABCO (2). TMEDA (0.4). 125. 24. S.M.. 6. CuCl. Cs2CO3 (2). L-proline. (0.4). 125. 24. S.M.. 7. CuCl. K3PO4 (2). TMEDA (0.4). 125. 24. S.M.. 8. CuCl. DABCO (2). 1,10-Phen (0.4). 125. 24. S.M.. t. 9. CuCN. NaO Bu (2). TMEDA (0.4). 125. 24. S.M.. 10b. CuCN. Cs2CO3 (2). 1,10-Phen (0.4). 125. 24. S.M.. 11. CuCN. K3PO4 (2). L-proline. (0.4). 125. 24. S.M.. 12. CuCN. DABCO (2). 1,10-Phen (0.4). 125. 24. ~10. 13. CuI. NaOH (3). 1,10-Phen (0.4). 85. 20. S.M.. 14. CuI. Cs2CO3 (3). 1,10-Phen (0.4). 85. 20. S.M.. 15. CuI. Na2CO3 (3). 1,10-Phen (0.4). 85. 20. S.M.. t. 16. CuI. NaO Bu (3). 1,10-Phen (0.4). 85. 20. ~5. 17. CuI. DBU (3). 1,10-Phen (0.4). 85. 20. S.M.. 18. CuI. NaOH (3). －. 85. 20. S.M.. 19. CuI. Cs2CO3 (3). －. 85. 20. S.M.. 20. CuI. Na2CO3 (3). －. 85. 20. S.M.. t. 21. CuI. NaO Bu (3). －. 85. 20. S.M.. 22. CuI. DBU (3). 23 24 25 a. N. O. O H. CuI CuI CuI. －. 85. 20. S.M.. t. －. 120. 5. 52. t. 1,10-Phen (0.8). 120. 5. 46. －. 120. 0.5. 56. LiO Bu (2) LiO Bu (2) t. LiO Bu (2) b. Yields for the isolated product; The reaction was added iodobenzene (2 eq) of entries 1-12 and 23-25,. and iodobenzene (4 eq) for entry 13-22; c The reaction was dissolved in DMF (2 M) for entries 1-12, DMF (0.5 M) for entries 12-25; 1,10-phenantroline = 1,10-Phen; Tetramethylethylenediamine = TMEDA.. 9.

(19) 隨後，我們以 1,3-DMU 作為起始物，希望利用催化劑量的銅活化 C-H 鍵，直接在 6-位進行 arylation，並且改變溶劑、鹼、溫度、及添加劑和螯合基來找出最佳化的條件。反應先以 0.2 當量 CuBr 作為銅的催化劑；以 2 當量的 Cs2CO3 作為鹼的來源；以 2 當量的 iodobenzene 作為反應物；以 DMF 作為溶劑，控制反應濃度為 0.5 M，在迴流溫度進行反應，以此為標準條件 (Table 2-2, entry 1)，卻無法得到預期產物，因此改變反應的條件。首先，改變鹼的條件 (Table 2-2, entries 2-4)，可以由表格中發現，當使用 LiOtBu 為鹼時有 76% 的產率，因此後者反應就以此為鹼的來源；隨後，嘗試使用不同溶劑，也都無法將反應的產率提升，而當溶劑為 DMSO 時，將溫度提升為 180 oC，但因反應溫度太高使反應複雜，並且破壞起始物的結構導致反應失敗 (Table 2-2, entries 5-10)；隨後再探討改變加入不同添加劑或螯合劑的變化，反而降低了反應的產率 (Table 2-2, entries 11-14)；若是改變芳基試劑的來源，發現本條件下無法與 Ph-B(OH)2 進行反應，抑或是 phenyl bromide，也大大的降低了反應的活性 (Table 2-2, entries 15-16)；若改變溫度，將溫度降溫至 120 oC 後，卻抑制了反應的進行 (Table 2-2, entry 18)；最後改變銅及鹼的當量數，篩選最佳的條件。反應使用了 0.4 當量的 CuBr 和 4 當量的 LiOtBu，作為優化的條件 (Table 2-2, entries 17-18)，因為相對於鈀，銅仍屬於較便宜的金屬催化劑；並且使用不同價數及種類的銅來觀察反應活性的差異，卻也無法再提升產率 (Table 2-2, entries 19-23)。而觀察其中反應時 5-位進行 arylation 的產物遠小於 1%，並且沒有從 NMR 中觀察到有在 5-位及 6-位都進行 arylation 的產物。因此此方法不但不需要額外添加劑，並可以有非常好的區位選擇性。而事實上反應中也可加入 PPh3 作為螯合基來幫助反應，但因反應後會進行氧化形成 triphenylphosphine oxide，因為純化上不易，所以捨棄使用添加額外的添加劑作為螯合基。 10.

(20) Table 2-2. Optimization of the reaction condition of 1,3-DMU O Me O. O H. N. CuX , arylating reagent. Me. ligand, base, N Me. H. solvent, temperature. O. H. N N Me. Ar. Arylating Catalyst. Base. Ligand. [eq]. [eq]. [eq]. Entry. Solvent. Yielda. [0.5 M]. [%]. reagent [2 eq]. 1. CuBr (0.2). Cs2CO3 (2). －. Ph-I. DMF. 0. 2. CuBr (0.2). LiOH (2). CuBr (0.2). 3. CuBr (0.2). 4. CuBr (0.2). 5. CuBr (0.2). 6. CuBr (0.2). 7. CuBr (0.2). 8. CuBr (0.2). 9 10. b. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22. CuBr (0.2) CuBr (0.2) CuBr (0.2) CuBr (0.2) CuBr (0.2) CuBr (0.2) CuBr (0.1) CuBr (0.4) CuCl (0.4) CuI (0.4) CuCN (0.4) Cu(OAc)2 (0.4). 23. CuSO4 (0.4). 24. CuBr (0.4). 25 a. CuBr (0.2). －. －. Ph-I. DMF. 0. t. －. Ph-I. DMF. 76. t. －. Ph-I. DMF. 21. t. －. Ph-I. THF. ~5. t. －. Ph-I. DME. ~20. t. －. Ph-I. dioxane. 41. t. －. Ph-I. toluene. ~30. t. －. Ph-I. tAmyl-OH. ~10. t. －. Ph-I. DMSO. 0. t. PPh3 (0.2). Ph-I. DMF. 67. t. LiO Bu (2) NaO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2). 1,10-Phen (0.1). Ph-I. DMF. 62. t. L-proline. (0.1). Ph-I. DMF. 57. t. TMEDA (0.1). Ph-I. DMF. 60. t. －. Ph-B(OH)2. DMF. 0. t. －. Ph-Br. DMF. 2.6. t. －. Ph-I. DMF. 63. t. －. Ph-I. DMF. 87. t. －. Ph-I. DMF. 79. t. －. Ph-I. DMF. 79. t. －. Ph-I. DMF. 70. t. －. Ph-I. DMF. 78. t. LiO Bu (4). －. Ph-I. DMF. 34. －. －. Ph-I. DMF. 0. t. －. Ph-I. DMF. 0. LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (2) LiO Bu (4) LiO Bu (4) LiO Bu (4) LiO Bu (4) LiO Bu (4). LiO Bu (4) 1. The yields were determined by H NMR analysis of the crude products using caffeine as an internal. standard; b The reaction was stirred at 180 oC.. 11.

(21) 當擁有優化條件後，首先將 1a 作為起始物，與具有不同取代基的 iodobenzene 進行反應，結果顯示可以成功地合成預期的 6-aryluracil 產物，並且有中等到不錯的產率 (28%-85%)，在實驗中也可歸納，當反應物含有推電子基時，反應性較高；反之，則較低。因此，當與具有強拉電子基的 1-iodo-4-nitrobenzene 反應時，只能得到 6% 的產率，但將反應物的當量數與反應時間提升五倍，產率也能因此提升 (Table 2-3, entries 1-10)；隨後，開始針對 5-位具有不同取代基的 1,3-DMU 進行反應，其中含有 5-methyl- (1b)、5-fluoro- (1c)、5-chloro- (1d)、5-bromo- (1e) 和 5-nitro- (1f) 1,3-DMU 取代上不同推拉電子的取代基，再以相同的條件反應，來觀察此方法的限制性及應用的擴展性。若以相同的條件與各式不同的 iodobenzene 來反應均可以得到中等以上的產率 (Table 2-3, entries 11-21)；但例外的是，以 entry 22 為例，當起始物為 1e 與 2a 進行反應，卻得到了 3aa 及 3ea (Table 2-3, entries 22-24)。因此特殊的結果，我們推測在高溫及強鹼的作用下，此反應機制是經由 “hataryne” 或 “benzynoid” 的結構再經由銅金屬的加成反應後，再經由還原脫去反應而得到產物 (Scheme 2-1)，53-43 但此反應卻沒有在 5-fluoro和 5-chloro-1,3-DMU 上發生，但當起始物為 1f 時，反應得到了一個複雜的結果，無法得到預期 arylation 的產物 (Table 2-3, entry 25)。. 12.

(22) Scheme 2-1. Postulated benzynoid formation mechanism of 5-bromo-1,3-DMU I. O Me O. Br. N N Me. 2a (2 eq). O Me. CuBr (0.4 eq). reflux, 1 hr. Me O. O Br. N N Me. H. LiOtBu. Me O. Br. N. H LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M) O. O. O Me. N Me. O. N Me. O. I. Me N N Me. N. CuBr. O. N N Me. Cu. 最後，我們使用 5-bromo-1,3-DMU 作為起始物，在鈀金屬的催化下，利用 Suzuki-Miyaura 的反應先製備 5-phenyl-1,3-DMU ，隨後在標準條件下與 iodobenzene 反應而成功合成了 5,6-diphenyl-1,3-DMU (3ga)。實驗結果發現當 5-位具有取代基時，因立體障礙的影響及當 5-位具有拉電子的取代基時，因電子效應的影響，均會導致在 6-位進行 arylation 的產率下降。因此推論立體障礙 (steric effect) 及電子效應 (elctronic effect) 的會影響反應性。因此，我們實驗若將 6-位上含有取代基時，是否可以得到在 5-位進行 arylation 的產物，因此將 6-chloro-1,3-DMU 和 6-methyl-1,3-DMU 以相同條件與 4-iodotoluene 反應，我們預期，當五位及六位含有氯時，可能會藉由 homo coupling 互相鍵結；35 而當六位含有甲基時，可能會對甲基進行脫氫反應，隨後與 tolyl iodide 進行 SN2 加成反應，但實驗結果卻皆沒有在 5-位進行 arylation，也無法對 6-chloro-1,3-DMU 的 6-位氯及 6-methyl-1,3-DMU 的 6-位甲基進行活化而進行耦合反應 (Scheme 2-2)。. 13.

(23) Table 2-3. C-H arylation of 1,3-DMU derivatives with diverse aryl halides I R 2a-i (2 eq). O Me O. R5. N N Me. H. CuBr (0.4 eq). O Me. LiOt Bu (4 eq), DMF (0.5 M) reflux, 1 hr. 1a-f. O. R5. N N Me. R. 3a-f. Entry. Reactant. R5. Ar-I. R. Product [yield]a. notebook. 1. 1a. H. 2a. H. 3aa [82%]. QR 159-A. 2. 1a. H. 2b. 4-Me. 3ab [58%]. QR 163-A. 3. 1a. H. 2c. 4-MeO. 3ac [54%]. QR 160-B. 4. 1a. H. 2d. 4-Cl. 3ad [55%]. QR 159-B. 5. 1a. H. 2e. 4-Br. 3ae [28%]. QR 164-B. 6. 1a. H. 2f. 4-NO2. 3af [6.3%]. QR 164-C. b. RL 007-A. a. 7. 1a. H. 2f. 4-NO2. 3af [20%]. 8. 1a. H. 2g. 2-Me. 3ag [85%]. RL 019-B. 9. 1a. H. 2h. 3-MeO. 3ah [72%]. QR 163-B. 10. 1a. H. 2i. 2-MeO. 3ai [66%]. RL 019-C. 11. 1b. Me. 2a. H. 3ba [21%]. QR 173-C. 12. 1b. Me. 2b. 4-Me. 3bb [46%]. QR 186-A. 13. 1b. Me. 2c. 4-MeO. 3bc [31%]. QR 186-B. 14. 1b. Me. 2d. 4-Cl. 3bd [29%]. QR194-A. 15. 1c. F. 2a. H. 3ca [47%]. QR193-A. 16. 1c. F. 2b. 4-Me. 3cb [41%]. QR198-A. 17. 1c. F. 2d. 4-Cl. 3cd [42%]. QR198-B. 18. 1d. Cl. 2a. H. 3da [68%]. QR 173-A. 19. 1d. Cl. 2b. 4-Me. 3db [44%]. QR 187-A. 20. 1d. Cl. 2c. 4-MeO. 3dc [45%]. QR 187-B. 21. 1d. Cl. 2d. 4-Cl. 3dd [35%]. QR194-B. 22. 1e. Br. 2a. H. 3ea [39%) + 3aa [23%]. QR199-C. 23. 1e. Br. 2b. 4-Me. 3eb [32%) + 3ab [9%]. QR199-A. 24. 1e. Br. 2d. 4-Cl. 3ed [24%] + 3ad [12%]. QR199-B. 25. 1f. 26. 1g. NO2. 2a. H. Ph. 2a. H. N. D.. c. 3ga [47%]. b. c. isolated yields; 4-nitrophenyliodide (5 eq), 5 hr; no desired product.. 14. RL011-A.

(24) Scheme 2-2. Reactivity of the 6-substituted 1,3-DMU toward the arylation condition O Me. 4-MePh-I (2b, 2 eq) CuBr (0.4 eq). N. N R6 Me 6a R6 = Cl 6b R 6 = Me. O. Me. LiOtBu (4 eq) DMF (0.5 M) ref lux, 1 hr. N. O. O Me. Me. O. N R6 Me 7a-b not observed O. Me. N. O. N Me Me 3ab not observerd from the reaction of 6a. O. Me. N N Me. C H2. 8 not observerd from the reaction of 6b. 隨後，為了評估 N 上取代基的影響，我們分別在 N1 和 N3 的位置接上不同取代基，即以 uracil (9a)、1-methyluracil (9b) 進行比較，而 9a 製備不易，因此嘗試將 uracil 作為起始物，利用 K2CO3 行 deprotonation，隨後只加入等當量的 MeI 進行反應後，可以得到 35% 的產率，卻因無法由 NMR 來確認結構，因此以 X-ray 確認產物反應的位置。隨即將 9a 及 9b 在標準條件下進行反應，但兩者卻皆無法得到預期的產物，因此推論此反應條件下，N 上含有取代基的必要性 (Scheme 2-3, entries 1-2)。. Scheme 2-3. X-ray identification of 1-methyluracil (9b). 15.

(25) 隨後，希望將此條件應用在 urdine 上，因此嘗試使用不同的保護基，希望隨後可將保護基卸下，因此嘗試使用 1,3-di-(p-methoxybenzyl)uracil (9c) 和 1,3-di-(benzyloxymethyl)uracil (9d)，來觀察反應的限制性。結果只有 9c 能夠在 6-位進行 arylation 的反應因此隨後我們將 uridine 的 N3 利用 PMB 保護，在進行反應是用性的評估 (Table 2-4, entries 3-4)。. Table 2-4. C-H arylation of uracil derivatives with 4-iodotoluene O R3 O. N N R1 9a-d. entry reactant 1 2 3 4 a. 9a 9b 9c 9d. 4-MePh-I (2b, 2 eq) R3 CuBr (0.4 eq) N LiOt Bu (4 eq) DMF (0.5 M) reflux, 1 hr. R1. R3. H H Me H PMB PMB BOM BOM. O. O. N R1 10a-d. Me. product (yield)a. notebook. N.R.c N.R.c. QR 177-B RL 011-C RL 001-A RL-001-B. 10c (43%) N.D.b. isolated yields.; b no desired product.; c no reaction.. 隨後，希望擴大此一反應的適用性，將此反應延伸至具有類似結構的 4-pyridone 衍生物。首先，依據前面實驗的結果，必須將 N 上進行保護，形成 1-(p-methoxybenzyl)-4-pyridone (6)，但為了確定在 N 上的保護位置 (N-alkylation 或 O-alkylation)，利用 X-ray 鑑定 11 結構 (Scheme 2-4)。. Scheme 2-4. X-ray identification of 1-(p-Methoxybenzyl)-4-pyridone (11). 16.

(26) Table 2-5. C-H arylation of 4-pyridone derivative with diverse aryl halides I. O. R. (2 eq). O. CuBr (0.4 eq) N PMB 11. LiOtBu (4 eq) DMF (0.5 M) reflux, 1 hr. Entry Reactant Ar-I 1 11 2 11 3 11 a isolated yields.. 2a 2b 2d. R. N PMB 12a,b,d. Product [yield]a. R. notebook. H 12a [28%] QR195-A 4-Me 12b [33%] QR189-B 4-Cl 12d [31%] QR200-A. 確認結構後，我們再利用優化條件，成功地選擇在 pyridone 的 2-位進行 arylation，成功的得到 (12a、12b、12d)，最後以 12d 化合物為例，經由 2D NMR (COSY, HMBC, HMQC) 及 NOE 的鑑定確認反應位置。 Figure 2-1. 1-(4-Methoxybenzyl)-3-p-chlorophenyl-4(1H)-pyridinine (7d). Figure 2-2. H-H COSY of 7d. Figure 2-3. H-C HMBC of 7d. 17.

(27) Figure 2-4. H-C HMBC of 7d. Figure 2-5. H-C HMQC of 7d. Figure 2-6. H-C NOE of 7d. 首先，在 H-H COSY 中，可以明顯區別兩 phenyl 取代基在氫譜中有兩組 peak 為 δ 7.34 ppm 和 δ 7.13 ppm 另一組 peak 為 δ 6.77 ppm (Figure 2-2)。因 7d 中只有唯一的 CH2 即可利用 DEPT 和碳譜判別 peak 為 δ 56.4 ppm，在 Figure 2-4 中，在 H-C HMBC 觀察到 CH2 與氫譜. peak 為. δ 6.77 ppm 有. 3. J coupling 故推論此. peak 為. 4-methoxyphenyl，同時也可觀察到氫譜中有一組 peak 為 δ 7.40 ppm 有 3. J coupling 將此 peak 訂為 a。因此可推論 peak 為 δ 7.34 ppm 和 δ 7.13. ppm 是 4-chlorophenyl 上氫的化學位移。確認了取代基上的 H 的相對位置後，而 4-pyridone 上的未知的三個 H，依氫譜中，化學位移的大小將 δ 7.40 ppm 訂為 a、 δ 6.40 ppm 訂為 b、 δ 6.28 ppm 訂為 c。在 Figure 2-2 中，可藉由 H-H COSY 觀察到 b 與 a 18.

(28) 有 coupling 且 b 與 c 也有 coupling 因此推論 b 在 1 號位置上。隨後，在 H-C HMBC 中觀察出 b 與碳譜中兩組 peak 有 coupling 分別為 δ 141.5 ppm 和 δ 120.6 ppm，而 4-chlorophenyl 在其中除了與本身的 C-H 有 coupling 外，且與碳譜中一組 peak 有 coupling 為 δ 151.1 ppm。因此可以推論出，b 所在的位置與 4-chlorophenyl 取代位置並非鄰位，因此推論 b 取代在 4 位上。最後，在 Figure 2-6 中，觀察空間中 NOE 的效應，並確認 H 所屬的位置。首先， CH2 與 a 有 NOE 效應，代表 a 位於 3 號位置；而後，也能觀察到 a 與 b 的 NOE 效應。綜合上述兩者，最後也可推測出 c 位於 2 號位置上。隨後嘗試，將相同的反應應用在 2-pyridone，分別利用 Bn 及 PMB 作為 N 上的保護基並在優化條件下進行反應，但卻無法得到 arylation 產物，只回收起始物。最後，我們深入了解反應細節，因此做了初步的氘同位素效應研究。首先，我們以 1,3-DMU (1a) 在 NaOD 為鹼中，在 0.5 M 反應濃度的 D2O 中，在 85oC 下，反應 24 小時，可以得到 5,6-di-deuterated 1,3-DMU (1a-5,6-d2) 的產物 57%。隨後，將 1,3-DMU (1a) 和 5,6-di-deuterated 1,3-DMU (1a-5,6-d2) 等比例混和，並加入 iodobenzene 在標準條件下進行反應，最終得到 87% 的產率。此方式是利用兩不同的受質，進行分子間的競爭反應，藉由 C-H 與 C-D 間鍵能的不同由產物的比例，得到 KIE (kinetic isotope effect) 的比值。而 KIE 的比值為 3a / 3a-5-d = 3.35 (Scheme 2-4 eq. 1)。隨後，單獨加入 5,6-di-deuterated 1,3-DMU (1a-5,6-d2) 並以相同條件反應後，產率同為 87%，但在 5-位上氘的含量卻意外發現剩下 48%，代表有 52% 的氘被氫交換，因此懷疑，可能經由脫質子 (deprotonation) 後，再由溶劑中的水進行質子化反應，所以導致在 5-位上的氘被氫取代 19.

(29) (Scheme 2-5, eq. 2)。由此證明氫氘交換的比例，並不只有唯一的變因，推測反應中的溶劑或水可能提供質子，因此推論同位素效應 KIE 的比例應大於 3.35。同時，我們做了一系列的實驗確定質子的來源 (Scheme 2-5, eq. 3)。因此，選擇不同氘的來源與 1,3-DMU (1a) 在標準條件下進行反應。結果顯示，當反應中加入一滴 D2O 或是 acetic acid-d4 時有 17~18% 的 5-位氫會被氘交換，由此證明，溶劑中殘存的水也會提供反應時的質子。依上面的實驗結果，在氫與氘交換的實驗中加入 D2O，儘管會稍微降低產率，但也可顯示此反應對水的容忍性很高，在有水的存在下，依舊可進行反應。 Scheme 2-5. Preliminary deuterium isotope studies I. O Me. 2a (2 eq) D/H. N. O. N Me. O Me. CuBr (0.4 eq). D/H LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M) O. N Me. reflux, 1 hr. 1a & 1a-5,6-d 2. D/H. N. (1). 3aa & 3aa-5-d 3aa / 3aa-5-d = 0.77 / 0.23 KIE = 3.35 I. O Me. 2a (2 eq) D. N. O Me. CuBr (0.4 eq). D/H. N. N D LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M) O N Me Me reflux, 1 hr 1a-5,6-d 2 3aa & 3aa -5-d. O. (2). 3aa / 3aa-5-d = 0.52 / 0.48 KIE > 3.35 I. 2a (2 eq). O Me O. H. N N Me 1a. H. CuBr (0.4 eq). O Me. LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M) O 1 d D2O or 1 d CD3COOD. D/H. N N Me. (3). 3aa / 3aa-5-d reflux, 1 hr. 0.83 : 0.17 D 2O 74% 0.82 : 0.18 CD3 COOD 81% 0.59 : 0.41 DMF-d 7 82%. 20.

(30) 但由 eq. 2 中所顯示的結果，含有氘化的比例有 48%，遠高於少量質子來源的交換結果。因此將 DMF-d7 作為反應的溶劑，在標準條件與 1,3-DMU (1a) 進行反應，實驗中顯示有 41% 的 5-位氫被氘交換，因此可證實，在被脫質子後，是可以從溶劑中再次進行質子化反應。實驗結果顯示，KIE 比例應大於 3.35，為 1° 同位素效應。故推論 6位 C-H 鍵結的斷裂，可能是速率決定步驟 (rate determining step) (RDS)。依據實驗的結果，首先推論反應是經由 Ullmann 的反應機制，並且會產生 uracil 6-carbanion (13) 中間體的結構。 Figure 2-7. Proposed C-H bond activation mechanism O Me I. H. N. O. 2a. N Me. O Me. 3aa C-H bond cleavage. (I). Cu Br. O 14. mechanism A. H. N N Me. Cu (III)BrI. N H Me 17. O Me. O. H. N. mechanism B. Cu(III)BrI I Cu(III) Br 12. O. O. O Me O. H. N. C-H bond cleavage. Me O. N Me. X  H   (III) Cu N   O N  H Me 16. Me. H. N N Me. H. mechanism A mechanism B common steps. 1a. 13. 所以根據初步的同位素效應的結果，我們推測出反應機構 A，56 催化反應的循環先經由 CuBr 和 iodobenzene (2a) 利用氧化加成形成 PhCu(III) 的錯合物 (12)，同時區位選擇性是藉由強鹼脫除在 1,3-DMU (1a) 上 6-位的氫，而形成 uracil 6-carbanion (13) 的中間體。我們合理化 21.

(31) 地推測，區位選擇性的形成負電荷在 6-位，是由於 5-位及 6-位上 pKa 的不同，因 KIE 顯示，deprotonation 在 6-位的 C-H，因此可能為速率決定步驟。隨後，uracul 6-carbanion (13) 置換錯合物 12 上的鹵素，藉金屬置換反應 (transmetallation) 來形成 diaryl Cu(III) 的錯合物 (14)，隨後還原脫去，形成耦合產物 3aa 及活化再生 Cu(I) 試劑。雖然 1a 在 6-位上的 pKa 大約為 30~34，56-59 但需進一步地確認，是否反應中產生 6-carbanion (13) (Figure 2-5)。 Scheme 2-6. Kinetic isotope effect study. CuBr (0.4 eq). O Me. N. O. N Me. O. H. LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M). Me. H. 1 d D2O or 1 d CD3COOD. O. D/H. N. (4) N Me. reflux, 1 hr. D/H. 1a & 1a-5,6-d 2. 1a. 1. 5-H / D [0.86 : 0.14] 6-H / D [0.88 : 0.12] D2 O 67% 2. 5-H / D [0.80 : 0.20] 6-H / D [0.85 : 0.15] CD 3COOD 96% 3. 5-H / D [0.30 : 0.70] 6-H / D [0.22 : 0.78] DMF-d 7 65% O Me O. N N Me. O H. LiOtBu (4 eq), DMF (0.5 M). Me. H. 1 d D2O or 1 d CD3COOD. O. reflux, 1 hr. D/H. N. (5) N Me. D/H. 1a & 1a -5,6-d 2. 1a. 4. 5-H / D [0.76 : 0.24] 6-H / D [0.78 : 0.22] D 2O 35% 5. 5-H / D [0.88 : 0.12] 6-H / D [0.90 : 0.10] CD3 COOD 57% 6. 5-H / D [0.12 : 0.88 ] 6-H / D [0.18 : 0.82] DMF-d 7 41%. 為了了解是否有 uracil 6-carbanion 中間產物的生成，我們做兩組不同的實驗，並且使用三種不同氘的來源，分別為 D2O、acetic acid-d4 及 DMF-d7 來進行比較。一組是將 1a 在標準條件下，但不加入 iodobenzene (Scheme 2-6, eq. 4)；另一組同樣以 1a 作為起始物，但不加入 iodobenzene 及 CuBr (Scheme 2-6, eq. 5)。實驗的結果顯示無論是哪一種氘的來源 5位和 6-位氘交換的比例並無明顯的差異。而在兩個例子中，利用 DMF-d7 22.

(32) 來確認氘的來源，結果在 5-位及 6-位都得到了約有 70~88% 的氘化的產物，因此我們推論，實驗沒有明顯的證據證明反應中 6-carbanion 中間產物生成與反應的區位選擇無關；也證實 DMF 在反應中會提供質子交換。因此，我們推測反應機構 B，1a 在 5,6-位上的雙鍵先對 PhCu(III) 錯合物 (12) 的銅金屬中心進行配位，形成 cis-5,6-dihydro-6-phenyluracil copper(III) (16)。此一步驟，我們解釋它的選擇性可能因為 1a 上 5,6-位的雙鍵和 PhCu(III) 錯合物間的鍵 (12)，利用本身鍵結極性的配對。因此，較親電性 (electrophilic) 的 PhCu(III) 錯合物 (12) 中的銅連接上較親核性 (nucleophilic) 的 1a 中的 5-位，隨後芳香環轉移至 6-位上，而形成 6-Ph-uracil Cu 錯合物 (17) 。因此步驟為區位選擇性的決定步驟。隨後，利用強鹼脫除 6-位的氫原子，促使反應進行反向脫去反應 (β-elimination) 形成耦合產物 3aa 及活化再生 Cu(I) 試劑。. Figure 2-8. Proposed C-H bond activation mechanism O CuBr. Li OtBu. [OA]. I Ph Cu Br. Ph I 2a. I OtBu. N O. N. Ar. 12 O. O I. N O. N. Cu Br. Cu. [RE] Ar. elimination. N O. N. Ar. 3aa. 隨後，我們也參考師大葉名倉教授的意見，推測反應機制可能經由 CuBr 和 iodobenzene (2a) 利用氧化加成形成 PhCu(III) 的錯合物 (12)，而後，利用 base 攻擊 12 中的碘離子，隨後，uracil 的 5-位攻擊帶正電荷的碘離子；同時以 Cu complex 攻擊 uracil 的 6-位，最後經由脫去反應及還原脫去反應，形成耦合產物 3aa 的過程。 23.

(33) Scheme 2-7. Studies for the heteroaromatic ring. Me N. O. S. N 18. 19. 20. O N 21. 我們成功的開發了 1,3-DMU 利用銅的催化，具有區位選擇性的在 6位進行 C-H 的 arylation。因此，我們嘗試使用 N-methylimidazole (18)、 furan (19)、thiophene (20)，在標準條件下，似乎無法得到進行 arylation 的產物，唯獨 19 在低解析質譜中，有類似產物的分子量，而有待確認。然而，我們設計一個起始物 21 希望能在標準條件下，進行 arylation，但結果卻也無法確認，有得到我們預期的產物。. Scheme 2-8. Studies for the 6-substituted uridines O. O PMB. HN O TBSO. N TBSO. O. O. N PMBO. O. N. O BnO. N. BnO. OBn. O. BnO. 26. N. O PMBO. OBn 27. 24. O. N. O. OPMB 25. PMB. O. PMBO 28. N. N. O. PMBO. N. O TBDPSO. O. PMBO. O. O PMB. N. O. 24. O PMB. PMB N. O. 23. O. N. O. O O. 22. PMB. N. O. O. O.

(34) 最後，我們希望將優化的條件應用於 uridine 上。首先，以 22 作為起始物，在標準條件下進行反應，但依前面的實驗顯示，必須在 N3 先進行保護才可進行反應，因此無法得到預期的產物；隨後使用氮上具有保護的 urdine 衍伸物，但推論可能保護基無法承受此反應的條件，因此轉而使用 24 進行反應，卻也無法得到預期產物。因此，重新評估起始物的構型，我們推論可能是因為 isopropyl 的保護基，形成了兩個五環，導致構型改變，並且可能會因此與 Cu 螯合，而降低反應活性；隨後，我們嘗試開環，使用 25 進行反應，但實驗結果也無法得到預期產物，因此，我們推論，可能是起始物中含有大量的氧原子，因此改變保護機的來源，使用 26 及 27 作為起始物，但還是無法反應；最後，推論可能是由於 2’-位置上的氧導致反應失敗，因此使用 2’-deoxyuridine 衍伸物 28，卻還是無法得到預期產物。(Scheme 2-6)。. 25.

(35) 2-2. Conclusion 我們成功的利用我們的最佳化條件，可以針對 1,3-DMU 直接的進行 arylation，可以有中等以上的產率。並且我們也可以使用 5-methyl-, 5-fluoro-, 5-chloro-, 5-bromo- 和 5-nitro-1,3-dimethyluracil 取代不同的官能基，以相同條件反應，甚至也可應用在 pyridone 上。並利用動力學同位素效應的實驗，對 1,3-DMU 的反應機構，有細微的觀察。而此一反應，突破了過去的反應條件，以一個簡單的方式及便宜的金屬，不但不需添加螯合基，並且有效率的在短時間內完成反應，而產物也有非常好的位置選擇性。我們相信，此一方式可以應用在合成更廣泛的 uracil 及 4-pyridone 衍生物上。. 26.

(36) Chapter III : References 1. C. Chen, D. Wu, Z. Guo, Q. Xie, G. J. Reinhart, A. Madan, J. Wen, T. Chen, C. Q. Huang, M. Chen, Y. Chen, F. C. Tucci, M. Rowbottom, J. Pontillo, Y.-F. Zhu, W. Wade, J. Saunders, H. Bozigian, R. S. Struthers, J. Med. Chem. 2008, 51, 7478–7485 2. C. F. Regan, Z. Guo, Y. Chen, C. Q. Huang, M. Chen, W. Jiang, J. K. Rueter, T. Coon, C. Chen, J. Saunders, M. S. Brown, S. F. Betz, R. S. Struthers, C. Yang, J. Wen, A. Madan, Y.-F. Zhu, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 4503–4507 3. F. Medda, R. J. M. Russell, M. Higgins, A. R. McCarthy, J. Campbell, A. M. Z. Slawin, D. P. Lane, S. Lain, N. J. Westwood, J. Med. Chem. 2009, 52, 2673– 2682. 4. Fukuda, M.; Nakamura, M.; Takada, T.; Yamana, K. Tetrahedron Lett. 2010, 51, 1732–1735. 5. Jacobsen, M. F.; Ferapontova, E. E.; Gothelf, K. V. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 905–908. 6. 7. 8. 9.. Wanninger-Weiss, C.; Wagenknecht, H.-A. Eur. J. Org. Chem. 2008, 64–71. Ehrenschwender, T.; Wagenknecht, H.-A. Synthesis 2008, 3657–3662. Okamoto, A.; Tainaka, K.; Unzai, T.; Saito, I. Tetrahedron 2007, 63, 3465–3470. Amann, N.; Pandurski, E.; Fiebig, T.; Wagenknecht, H.-A. Chem. Eur. J. 2002, 8, 4877–4883. 10. Capobianco, M. L.; Cazzato, A.; Alesi, S.; Barbarella, G. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 171–177. 11. Rozners, E.; Smicius, R.; Uchiyama, C. Chem. Commun. 2005, 5778–5780. 12. 13. 14. 15. 16.. Greco, N. J.; Tor, Y. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10784–10785. Yamamoto, Y.; Seko, T.; Nemoto, H. J. Org. Chem. 1989, 54, 4734–4736. Pesnot, T.; Wagner, G. K. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2884–2891. Kalachova, L.; Pohl, R.; Hocek, M. Synthesis 2009, 105–112. Cahova, H.; Havran, L.; Brazdilova, P.; Pivonkova, H.; Pohl, R.; Fojta, M.;. Hocek, M. Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 2059–2062. 17. Srivatsan, S. G.; Tor, Y. Chem. Asian J. 2009, 4, 419–427. 18. Srivatsan, S. G.; Tor, Y. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 2044–2053. 19. Haouz, A.; Vanheusden, V.; Munier-Lehmann, H.; Froeyen, M.; Herdewijn, P.; Van Calenbergh, S.; Delarue, M. J. Biol. Chem. 2003, 278, 4963–4971. 20. Gutierrez, A. J.; Terhorst, T. J.; Matteucci, M. D.; Froehler, B. C. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5540–5544. 21. Herdewijn, P.; Kerremans, L.; Wigerinck, P.; Vandendriessche, F.; Van Aerschot, A. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 4397–4400. 27.

(37) 22. Wigerinck, P.; Pannecouque, C.; Snoeck, R.; Claes, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. J. Med. Chem. 1991, 34, 2383–2389. 23. Sadler, J. M.; Ojewoye, O.; Seley-Radtke, K. L. Nucleic Acids Symp. Ser. 2008, 52, 571–572. 24. Western, E. C.; Daft, J. R.; Johnson, E. M., II; Gannett, P. M.; Shaughnessy, K. H. J. Org. Chem. 2003, 68, 6767–6774. 25. Crisp, G. T.; Macolino, V. Synth. Commun. 1990, 20, 413–422. 26. Nencka, R.; Sinnaeve, D.; Karalic, I.; Martins, J. C.; Van Calenbergh, S. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 5234–5246. 27. Hennecke, U.; Kuch, D.; Carell, T. Synthesis 2007, 929–935. 28. Palmisano, G.; Santagostino, M. Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2356–2366. 29. Palmisano, G.; Santagostino, M. Tetrahedron 1993, 49, 2533–2542. 30. Tanaka, H.; Hayakawa, H.; Shibata, S.; Haraguchi, K.; Miyasaka, T. Nucleosides Nucleotides 1992, 11, 319–328. 31. Satoh, K.; Tanaka, H.; Andoh, A.; Miyasaka, T. Nucleosides Nucleotides 1986, 5, 461–469. 32. Shih, Y.-C.; Chien, T.-C., Tetrahedron 2011, 67, 3915–3923. 33. Martin Kogler, Steven De Jonghe, Piet Herdewijn Tetrahedron Lett. 2012, 53 253–255 34. Lee, H. S.; Kim, K. H.; Kim, S. H.; Kim, J. N. Tetrahedron Lett. 2012, 53, 497. 35. Kim, K. H.; Lee, H. S.; Kim, S. H.; Kim, J. N. Tetrahedron Lett. 2012, 53, 1323. 36. Do, H.-Q.; Daugulis, O. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 13577. 37. 38. 39. 40.. Lee, H. S.; Kim, S. H.; Kim, J. N. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, 238. Cernova, M.; Pohl, R.; Hocek, M. Eur. J. Org. Chem. 2009, 3698. Itahara, T. Chem. Lett. 1986, 239. Examples: L.-C. Campeau, D. R. Stuart, J.-P. Leclerc, M. Bertrand-Laperle, E. Villlemure, H.-Y. Sun, S. Lasserre, N. Guimond, M. Lecavallier, K. Fagnou, J.. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 3291–3306. 41. M. P. Huestis, K. Fagnou, Org. Lett. 2009, 11, 1357–1360. 42. S. I. Gorelsky, D. Lapointe, K. Fagnou, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 10848– 10849 43. B. Liegault, D. Lapointe, L. Caron, A. Vlassova, K. Fagnou, J. Org. Chem. 2009, 74, 1826–18341 44. D. Zhao, W. Wang, S. Lian, F. Yang, J. Lan, J. You, Chem. Eur. J. 2009, 15, 1337–1340 45. Examples: F. Bellina, S. Cauteruccio, R. Rossi, J. Org. Chem. 2007, 72, 8543– 85461 46. F. Bellina, S. Cauteruccio, A. Di Fiore, C. Marchetti, R. Rossi, Tetrahedron 2008, 28.

(38) 64, 6060–6072 47. T. E. Storr, A. G. Firth, K. Wilson, K. Darley, C. G. Baumann, I. J. S. Fairlamb, 48. 49. 50. 51.. Tetrahedron 2008, 64, 6125–6137. Cernova, M.; Pohl, R.; Hocek, M. Eur. J. Org. Chem. 2009, 3698–3701 Cernova, M.; Cerna, I.; Pohl, R.; Hocek, M. J. Org. Chem. 2011, 76, 5309–5319. Kim, K. H.; Lee, H. S.; Kim, J. N. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 6228–6233. Elena Sperotto, Gerard P. M. van Klink, Gerard van Koten, Johannes G. de Vries,. Dalton Trans. 2010, 39, 10338–10351. 52. PhD. Derek Van Allen, Methodology and mechanism: reinvestigating the Ullmann reaction, 2004, university of Massachusetts Amherst. 53. Senda, S.; Hirota, K.; Asao, T. J. Org. Chem. 1975, 40, 353. 54. Senda, S.; Hirota, K.; Asao, T. Tetrahedron Lett. 1973, 2647. 55. Do, H.-Q.; Kashif Khan, R. M.; Daugulis, O. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 15185–15192. 56. Amyes, T. L.; Wood, B. M.; Chan, K.; Gerlt, J. A.; Richard, J. P. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 1574. 57. Yeoh, F. Y.; Cuasito, R. R.; Capule, C. C.; Wong, F. M.; Wu, W. Bioorg. Chem. 2007, 35, 338. 58. Wong, F. M.; Capule, C. C.; Wu, W. M. Org. Lett. 2006, 8, 6019. 59. Sievers, A.; Wolfenden, R. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 13986. 60. Su, T.L.; Huang, J.T.; Burchenal, J. H.; Watanabe, K. A.; Fox, J. J. J. Med. Chem. 1986, 29, 709–715. 61. LaFrate, A. L.; Katzenellenbogen, J. A. J. Org. Chem. 2007, 72, 8573–8576. 62. Skulnick, H. I.; Ludens, J. H.; Wendling, M. G.; Glenn, E. M.; Rohloff, N. A.; 63. 64. 65. 66.. Smith, R. J.; Wierenga, W. J. Med. Chem., 1986, 29, 1499–1504. Seki, K. I.; Bando, Y.; Ohkura, K. Chemistry Letters, 1986, 195–196. Ikehira, H.; Matsuura, T.; Saito, I. Tetrahedron Letters, 1985, 26, 1743–1746. Hoberg, H. O.; Benno, W. J. Organometal. Chem. 1983, 252, 359–364. Behrens, G.; Hildenbrand, K.; Dietrich S. F.; Herak, J. N. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2: Physical Organic Chemistry. (1972-1999), 1988, 305– 318. 67. Mir, H. J. Heterocycl. Chem. 1981, 18, 339–342. 68. 69. 70. 71.. Asakura, J. I.; Robins, M. J. J. Org. Chem. 1990, 55, 4928–4933. Giziewicz, J.; Wnuk, S. F.; Robins, M. J. J. Org. Chem. 1999, 64, 2149–2151. Silverman, R. B.; Groziak, M. P. J. Am. Chem. Soc. 1982. 104, 6434–6439 Arias, L.; Guzmán A.; Figueroa, S. J.; Lopez F. J.; Morgans, D. J.; Padilla, F. Medrano, A. P.; Quintero, C.; Romero, M.; Sandoval L. synlett 1997, 11, 1233– 1234. 29.

(39) Topic II. Design and Synthesis of 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uridine Derivatives. 設計及合成 6-(1,2,4-Oxadiazol-3-yl)uridine 衍生物. VII.

(40) Abstrat. The. focus. of. this. topic. is. the. synthesis. of. derivatives. of. 6-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil and uridine as potential inhibitors for orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (ODCase). 6-Cyano-1,3-dimethyluracil as the starting material was added hydroxylamine to give the corresponding oxime. It was subjected to the cyclization reaction with various benzoyl chlorides to give a series of 6-(5-phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracils. Under the same condition, suger-protected 6-cyanouridine was added hydroxylamine to give the corresponding oxime. Then reacted with various benzoyl chlorides to form the 6-(5-phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine derivatives.. VIII.

(41) 摘要. 本部分主要合成 6-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine 及 uracil 的衍生物，期望能作為具有潛力的 orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (ODCase) 的酵素抑制劑。實驗將 6-cyano-1,3-dimethyluracil 作為起始物，與 hydroxylamine 反應形成 oxime ，再與苯環對位上具有不同官能基的 benzyl chloride 進行合環，可合成一系列 6-(5-phenyl-1,2,4-oxadiazol3-yl)uracil。隨後，以相同的反應策略應用在 6-cyanouridine 上，同樣先與 hydroxylamine 反應形成 oxime，以相同條件合成一系列 6-(5-phenyl-1,2,4oxadiazol-3-yl)uridine 的衍生物。. IX.

(42) Chapter I : Introduction 1-1. Orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (ODCase) Orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (ODCase) 扮演一個非常重要的催化角色，催化嘧啶核苷酸 (pyrimidine nucleotides) 在生成的最後關鍵步驟 (de novo pyrimidine nucleotide biosynthesis) ，將受質 orotidine 5’-monophosphate (OMP) 經由 ODCase 的催化而脫去 CO2 形成 uridine 5’-monophosphate (UMP) 的反應 (Scheme 1-1)。1 Scheme 1-1. Catalytic decarboxylation of OMP 1 Carbanoyl phosphate. Pi. O. O. O. H2 O. H. H 2N. Aspartate. O. N H. O. COO. N-carbamoylaspartate. N N H. COO. L-Dihydroorotate. O NAD. NHADH H. PRPP. H. PPi. N. O. N H. COO. Orotate. O. O. HN 2. O. HN N. O3 P O. COO. H. CO2. O HO. 2. O. N. O3P O O. OH. ODCase. Orotidine 5'-monophosphate (OMP). HO. OH. Uridine 5'-monophosphate (UMP). ODCase 催化效率是最好的酵素之一，它存在於大多數的物種裡，包含細菌 (bacteria)、古細菌 (archaea)、寄生蟲 (parasites) 以及高等哺乳類動物裡。一般脫羧基酶需要輔酶 (cofactor)、金屬離子 (metal ion) 或共價的中間體 (covalent-intermediate) 的存在才能進行催化反應，但 ODCase 卻不同於一般脫羧基酵素，不需額外的輔酶或金屬就能進行催化反應。 30.

(43) 在低等生物的體內只能從合成嘧啶核苷酸的途徑來生成 UMP，但相對於高等生物而言，像是哺乳類動物，即可從其他的補救途徑 (salvage pathway) 來生成 UMP。而 UMP 是用來合成其他嘧啶核苷酸的前驅物 (precursor)，例如：uridine 5’-O-triphosphate (UTP)、cytidine 5’-O-triphosphate (CTP) 、 thymidine 5’-O-triphosphate (TMP) 和 2’-deoxy cytidine 5’-tri phosphate (dCTP)，再進而合成 DNA 或 RNA。因此，若是設計 ODCase 的酵素抑制劑，即能阻礙 ODCase 的催化反應，而中斷 UMP 的來源，更進一步的抑制了低等生物在 DNA / RNA 的合成以及複製，使之無法繁殖，而可以應用在抗病毒、抗寄生蟲及癌症的藥物研究上。2 Scheme 1-2. Nucleotide substrates and inhibitors for ODCase 3-12 O. O HN 2. O. HN N. OH. O 3P O. 2. O. N. OH. HO. O. OH. HO. N 2. O. O. OH. HO. O. O. O. COOH. HN N. R. 2. O. H F Cl Br. HO. O OH. R = NHCH 3 R = N(CH 3) 2. 31. N. O3P O. O OH. OH. pyrazofurin 5'-monophosphate. HN. O. R= R= R= R=. O3 P O. HO. HO. HO. O. O R. NH2. N. OH. O. N. 2. NH2. 6-thiocarboxamidouridine 5'-monophosphate. 6-aza-UMP. O3 P O. S. N. O. HN. OH. HN. O3 P O. O. COOH. 2-thio-OMP. HN N. N. O. O 3P O. O. S O3 P O. 5-aza-OMP. HN. 2. COOH 2. O. O. HO. HN. O. BMP. 2. N. O 3P O. O HO. O. HO. OH. R=I R = N3 R = CN R = CH 3 R = NH 2 R = SO 3. R.

(44) 近年來，許多被合成的 ODCase 抑制劑，發現對 West Nile Virus (WNV) 也有很好抑制效果，另外，針對瘧疾. 3. (malaria) 等病毒也有很好. 的抑制能力。4-9 此外有多種藥物在臨床實驗中發現 ODCase 的抑制劑可以抑制癌症的活性，10-12 因此，我們希望經由設計與合成的途徑，合成一系列的 ODCase 的抑制劑 (Scheme 1-2)。 Scheme 1-3. Decarboxylation of 1-methylorotic acid 13 O. NH. NH O. O. CO2. N COO CH 3. heat. O. N CH 3. 1-methyluracil. 1-methylorotic acid. 在 1995 年，13 Wolfenden 在 Science 上發表了一篇對酵素催化能力來做比較的文獻，其中以 ODCase 催化能力最佳，而作者利用不同的溫度 (140 oC – 200 oC)，測試 1-methylorotate 脫去 CO2 的速率，並計算出速率常數 (Scheme 1-3)，再利用阿瑞尼士外推法 (extrapolation of the Arrhenius plot) 可推算出在 25 oC 時的 Knon (nonenzymatic rate constant) 為 2.8 × 10-16 s-1，再由 Kcat / Knon 可得知，pH = 6，25 oC 時，酵素催化的能力增加了約 1017 倍，最後也可推出 ODCase 催化能力 [ (Kcat / Km) / Knon ] 為 2.0 × 1023 M-1 (Table 1-1)。 Table 1-1. Enzyme listed in order of decreasing catalytic proficiency 13. 32.

(45) 1-2. Machanism against ODCase 一般而言，脫羧基反應 (decarboxylation) 最後會在羧基所在的碳上形成負離子 (carbanion)，在生化中的脫羧基反應，則需藉由輔酶幫助，才能利用共軛的 π 軌域來穩定負電荷。然而，至目前為止，尚未發現 ODCase 的活化位置有輔酶的存在，所以合理的假設在 OMP 的 C-6 上形成了碳負離子，若以此假設為前提，隨即提出了利用形成碳烯 (carbene) 或是兩性離子 (zwitterion) 來穩定碳上的負離子的機制。在 1976 年，14-15 Beak 和 Siegel 在. J. Am. Chem. Soc. 中假設. ODCase 反應機制，利用. 1,3-dimethylorotate 作為 OMP 的模型來進行討論，提出先將 OMP 的 O-2 先質子化 (protonation) 再進行脫羧基反應，脫去 CO2 後而形成了兩性離子，再來穩定 C-6 上的負電荷的反應機制 (Scheme 1-4)。 Scheme 1-4. Beak and Siegel support for the ionization mechanism 14-15 Base-Catalyzed O H 3C. O B. N. O. N COOH CH 3. H 3C. N. O. N COO CH 3. CO2. O H 3C. N. O. N CH 3 BH. K O H3 C. CO2. N. HO. N COO CH 3. O H 3C. N. HO. O H 3C. N CH 3. O. N N CH 3. Zwitterionic. 但在 2000 年時，16 Rishavy 和 Cleland 在 Biochemistry 發表了一篇以 N1 置換成. 15. N 進行了同位素動力學的實驗，但實驗結果卻沒有發現. N1 鍵序 (bond order) 的改變，因此推翻了 Beak 和 Siegel 所提出的假設 (Table 1-2)。 33.

(46) Table 1-2. 13C and 15N decarboxylation isotope effect 16. 另一方面，在 1982 年，17 Silverman 和 Groziak 發表在 J. Am. Chem. Soc.中觀察到兩個模型 (model) 的反應結果，可將親核基 (nucleophile) 加成到 uracil 的 C-5 上，而再脫去 CO2 而還原芳香性。以此反應的結論作者推測 ODCase 進行催化反應時，活化位置有親核基在 OMP 的 C-5 進行加成脫去反應，得到 UMP (Scheme 1-5)。 Scheme 1-5. Mechanism proposed by Silverman and Groziak 17 O H3 C. N. O. O. N. Enz Nu. N Rib P. O H 3C. N. O. N COO Rib P. O H 3C. Enz Nu. N. Enz Nu. CO2. O H 3C. CH2 OO. Enz Nu. N. O. Rib P. N Rib P. O Enz Nu. H 3C O. 2. N. O 3P O O. N Rib P. Rib P =. HO. OH. 但在 1990 年，18 Wolfenden 在 Biochemstry 發表了在 5-位做了氘化標定，在同位素動力學的實驗中，發現並無同位素的效應，這說明了在 5位並無鍵序的變化； 1992 年，19 Jones 在 Biochemstry 再度指出，當使用 5-aza-OMP 與 ODCase 催化時，仍然有催化的反應，但此類似物 5位為 N 原子無法進行加成反應，因此證明 Silverman 提出的反應機制不正確，而作者也針對衍生物做抑制活性的測試，從結果得知，酵素的催化能力與立體障礙和電子效應有關 (Table 1-3)。. 34.

(47) Table 1-3. Substrate activity of selected orotidylate analogs 18. 在 1997 年， 20 Lee 和 Houk 發表在 Science 以及在 2001 年， 21 Kollman 發表在 J. Am. Chem. Soc. 中均表示，利用量子力學的計算後，再根據計算的結果預測了反應完會先脫去羧基後，再進而形成穩定的碳烯為中間產物。而在 2000 年，22 Ealick 的團隊研究了酵素 X-ray 的單晶結構而提出假設，在基態 (ground state) 時，活化位置的 aspartate 與羧基的負電荷有靜電斥力，所以導致能量較高而不易穩定，然而當在過渡態時 (transition state) 將負電荷轉移到 C-6 上可以利用 lysine 所提供的質子而穩定，所以 Ealick 認為在催化的途徑中，先質子化 (protonation) 才脫去羧基，最後形成 UMP。綜合以上結果，整理出四個反應機制，分別在 O-2、 O-4 、 C-5 、 C-6 先進行質子化來穩定負電荷，最後在形成 UMP (Scheme1-6)。. 35.

(48) Scheme 1-6. Reaction mechanisms proposed in recent studies 20 O-2 protonation O H O B H. H. N. O. O. N Rib P O. H O. HO. CO2. H. N. N Rib P O. O. H HO. O H. N. H. N Rib P. O. N N Rib P. O-4 protonation O H O. N. H B H. N Rib P O. O. O H O. H. OH CO2. H. N. N Rib P O. O. H O. O H. N. H. N Rib P. O. N N Rib P. C-5 protonation O H. H. N. O. H B. N. O. Rib P O. O. O H HO. CO2. H H. N. N Rib P O. O. H O. O H H. N. H. N. O. Rib P. N N Rib P. C-6 protonation O H O. O H. N N Rib P O. O. O. N N. H H N Lys H H O. Rib P O. O CO 2. H O. N N Rib P. 在 2005 年，23 Kotra 在 J. Am. Chem. Soc.中想要利用 ODCase 與 6-cyanouridine 5’-monophosphate (6-CN-UMP) 形成晶體做 X-ray 單晶的結構分析，但發現 6-CN-UMP 可做為 ODCase 的受質，並經由酵素催化而形成 barbituriate ribonucleotide 5’-monophosphate (BMP) 然後再抑制酵素的活性。而由 X-ray 可知進行催化時，有四個活化位置分別為 Asp 70、 Asp 75、Lys 42 以及 Lys 72，並且與周圍的氧原子形成氫鍵 (hydrogen bond) 的作用力 (Figure 1-1)。. 36.

(49) Figure 1-1 (A) 1.45 Å resolution electron density map of BMP in the active site of ODCase in crystals in contact with solutions of 6-CN-UMP (B) Hydrogen bonding network between the ligand BMP and the active site of ODCase. 23. 而在 2006 年，4 Kotra 在 J. Med. Chem. 又對這個結果深入的探討，合成出一系列 UMP 的衍生物，包含 6-aza UMP、6-cyano UMP、 6-amino UMP，並利用 isothermal titration calorimetry 的實驗結果來測定 enzyme inhibition kinetics 針對 ODCase 抑制活性效果的比較 (Table 1-4)。當這一系列 UMP 的衍生物在不同溫度時，會針對不同的 ODCase 的來源，有不同的 Ki (inhibition constant) 值。 Table 1-4. Inhibition constants for various inhibitor of ODCase 4. 2007 年，5 Kotra 在 J. Med. Chem. 中提到在多個 ODCases 的結構經由 X-ray 證明後，大家所推測反應的機制是利用共價的催化作用進行反應。但卻沒有一個反應機制能夠明確的證明當 ODCase 進行 decarboxylation 37.

(50) 的關鍵步驟中有共價鍵的生成。隨後，作者進而分析了 ODCase 的催化位置，發現兩 aspartate residues (Asp 70 和 Asp 75B) 及 lysine residues (Lys 42 和 Lys 72) 是藉由強而有力的氫鍵網絡 (hydrogen-bonding network) 來進行催化 (Figure 1-2)。同時，作者也分析了多種 ODCase 與不同螯合基共同組成的晶體，也證實作用在活化位置的 residues 它側鏈的移動小於 0.5 Å。因此作者提出的證據不認同活化位置會與催化劑的受質或是抑制劑形成共價鍵。. Figure 1-2. Stereo representation (crossed-eye) of the hydrogen-bonding network in the active site of Mt ODCase. 5. 因此作者對這個結論做出推論：(1) ODCase 在催化的過程中，活化位置中各個胺基酸的 residue 並沒有對受質進行親核加成。(2) ODCase 在催化過程中，並不會與受質形成共價鍵。(3) ODCase 在體的活化位置的架構下，形成了一個緊密的氫鍵網絡 (hydrogen-bond network)。. 38.

(51) Chapter II : Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil and 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine 2-1. Introduction 近幾年，陸續有文獻中合成 6-位上具有不同官能基的 uridine 衍生物，而這一系列化合物具有潛力成為 ODCase 抑制劑或是抗瘧疾和抗癌的活性。而 OMP 與 ODCase 進行催化時，6-位的羧基會以 COO – 的形式存在，並與酵素活化位置的 Lysine 和氮原子以靜電力鍵結。而目前，BMP 為已知的 ODCase 抑制劑，在酵素的催化過程中，6-位的氧原子與酵素活化位置上的 Lysine 形成氫鍵，而 Aspatate 與附近的基團也會以氫鍵的形式存在，因此，我們希望在 uridine 的 6-位上引入不同的官能基，能夠與酵素活化位置上的 Lysine 產生氫鍵，預期能具有 ODCase 抑制劑的潛力。本部分延續林建邦學長尚未完成的工作，主要著重於 6-oxadiazle 衍生物合成及分析。. 39.

(52) 2-2. Results and Discussion 2-2-1. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracils 我們以 uracil 作為反應起始物的模型，確認反應的可行性，因此先由逆合成分析，依文獻方法製備 6-位具有 cyano 結構的 uracul，再計畫具有 6-位 oxime 結構的 uracil，隨後，利用具有不同取官能基的 benzoyl chloride 進行合環反應，最後可以得到一系列 6-oxadiazle 的 uracil 衍生物 (Scheme 2-1)。 Scheme 2-1. Retro-synthesis of 6-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil O. O Br. HN O. N. N H. O. N. CN. O. O. N O. N N. N. OH. O. N. NH2. N N O. R. 首先，我們以 5-bromouracil (1) 作為起始物，先加入 K2CO3 (potassium carbonate) 作為反應中的鹼，加入 CH3I (iodomethane)，並在氮上進行 SN2 反應甲基化而得到 5-bromo-1,3-dimethyluracil (2)；再由 2 與 1.2 當量的 NaCN (sodium cyanide) 進行加成脫去的反應，而得到 6-cyano-1,3-dimethyluracil (3)，而反應結果與 1973 年中，Senda 在文獻中發表的相同；24 再使用 50% 的 hydroxylamine 水溶液在乙醇迴流得到 6位具有 oxime 結構的產物 (4) (Scheme 2-2)。在合成化合物 4 後，我們使用 CH2Cl2 (dichloromethane) 作為溶劑，並以 Et3N (triethylamine) 作為鹼，中和反應後所產生的 HCl，而後分別選用在苯環對位具有推拉電子基的 benzoyl chloride 進行合環反應，並且可得到合環 6-oxazole 的產物 (5a-5b) (Scheme 2-3)。 40.

(53) Scheme 2-2. Synthesis of uracil-6-carboxamidoxime O HN O. O. O Br. a. Br. N. N H. O. b. c. N O. N. O. N. CN. N O. N. N. OH. NH2. 1. 2. 3. 4. Reagents and conditions : (a) (1) K2CO3 (2 eq), DMF, rt, 24 h; (2) CH3I (2.5 eq), DMF, rt, 48 h, 98%; (b) NaCN (1.2 eq), DMF, 0oC, 1.5 h, 93%; (c) 50% hydroxylamine (2 eq), EtOH, reflux, 2 h, 94%. Scheme 2-3. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracils O. O N O. N. N. N. a O. OH. N. N R. N O. NH2 4. R = OCH 3 (5a) R = Cl (5b). Entry 1 2 a. Reagents [eq] 4-anisoyl chloride (1.5) 4-chlorobenzoyl chloride (1.2). Base [1.5 eq]. Temp. [oC]. Time [h]. Yielda. Et3N. reflux. 23. 51. Et3N. reflux. 5. 28. [%]. Yields for the isolated product.. 另外，我們也嘗試由化合物 4 與 acetic anhydride 及 Et3N 作為鹼的條件下，使用溶劑 toluene 進行合環反應，成功地得到 5c (Scheme 2-4)。. 41.

(54) Scheme 2-4. Synthesis of 6-(5-(methyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil O. O N O. N. a N. N. O. OH. N. N. CH3. N O. NH2 4. 5c. Reagents and conditions : (a) acetic anhydride (1.2 eq), Et3N (1.5 eq), toluene, 0 oC then reflux, 22 h, 72%. 同時嘗試藉由化合物 4 與 acetic formic anhydride 及 Et3N 作為鹼的條件下，使用溶劑為 THF 進行合環反應，但卻得到混合物，得到產物 5d 及含有約 10% 的副產物 5c (Scheme 2-5)。 Scheme 2-5. Synthesis of 6-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)uracil O. O N O. N. a N. N. OH. O. O. N N. N. N O. NH 2 4. 5c. CH 3. O. N. N. N O. H. 5d. Reagents and conditions : (a) acetic formic anhydride (1.3 eq), Et3N (1.5 eq), THF, 0 oC then reflux, 24 h, 64%. 42.

(55) 2-2-2. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine 在逆合成分析中預計以化合物 5-bromouridine 作為起始物，並在 uridine 的羥基上進行保護，再利用 NaCN 進行加成脫去反應形成化合物 6-cyanouridine，隨後加入 50% 的 hydroxylamine 水溶液反應，得到在 6位具有 oxime 結構的 uridine 衍生物，再使用不同官能基的 bezoyl chloride 進行合環反應，得到在 6-位具有 oxadiazole 結構的 uridine 的衍生物，最後去保護，得到最終產物。 Scheme 2-6. Retro-synthesis of 6-(1,2,3-oxadiazol-3-yl)uridine O HN O HO. O Br. HN O. N TBSO. O HO. OH. N. CN. O O. O O. O HN O TBSO. HN N. OH. NH2. O O. N. O HO. O. N. N O. O HO. N R. OH. 因此以化合物 6 作為起始物，在溶劑為 DMF 中進行溴化，形成化合物 7，接著將 2’、3’ 端的羥基以 isopropylidene 保護形成化合物 8，並以 TBDMS 將 5’端的羥基保護後形成化合物 9，再利用 NaCN 進行加成脫去反應形成化合物 10，隨後加入 50% 的 hydroxylamine 水溶液，得到具有 oxime 的產物 11 (Scheme 2-7)。. 43.

(56) Scheme 2-7. Synthesis of uridine-6-carboxamidoxime O. O HN. HN O HO. O. N. O. HO. a. OH. HO. b OH. HN. O. O 8. O. O. O. HN. N TBSO. d. O. c. O Br. O. N. O. 7 O. TBSO. O. O. 6. O. HN N. CN. O. O O. 9. Br. HN. N. OH. OH. O Br. TBSO. e. N. O. OH. NH2. O. O. N. O. 10. 11. Reagents and conditions : (a) Br2 (2 eq), DMF, 0 oC to rt; (b) H2SO4, anhydrous acetone, 0 oC, 4 h, 83%; (c) imidazole (2.2 eq), TBDMSCl (1.5 eq), DMAP (0.1 eq), CH 2Cl2, rt, 4 h, 99%; (d) NaCN (1.5 eq), DMF, rt, 45 h, 57%; (e) 50% hydroxylamine (2 eq), EtOH, reflux, 2 h, 96%. Scheme 2-8. Synthesis of 6-(5-Substituted-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridines O. O. HN O TBSO. HN N. OH. NH2. O O. N. O a. TBSO. O. R. N O. O O. N. N. O. R = OCH 3 ( 12pa) R = NO2 (12pb). 11. a. Entry. Reagents [eq]. Additive [0.3 eq]. Base [1.5 eq]. Temp. [oC]. Time [hr]. Yielda. 1. 4-anisoyl chloride (1.5). DMAP. Et3N. reflux. 8. 36. 2. 4-nitrobenzoyl chloride (1.2). DMAP. Et3N. reflux. 19. 82. Yields for the isolated product.. 44. [%].

(57) 因此，合成化合物 11 後，利用不同官能基的 benzoyl chloride 進行反應，而我們分別選用了在苯環對位具有推拉電子基的 benzoyl chloride 進行合環，並且可得到合環的產物 (12pa-12pb) (Scheme 2-8)。得到化合物 12pa 及 12pb 後，利用 TFA 進行去保護，嘗試以 80% 的 TFA 水溶液作為反應試劑的濃度，並可以得到完全去保護的產物。而在純化過程中，我們發現這一系列的化合物，對於甲醇或水的溶解度均不佳，因此純化上不可使用管柱層析法，必須使用再結晶純化，最終得到去保護產物 (12a-12b) (Scheme 2-9)。 Scheme 2-9. Deprotection condition O. O. HN O TBSO. HN N. N. N O. O O. O a. HO. R = OCH 3 (12pa) R = NO2 (12pb). O. N. N. R. N O. O HO. R = OCH3 ( 12a) R = NO 2 (12b). OH. Entry. R. Reagent. Temp.. Time. Yielda. 1. -OCH3. 50% TFA. 0 oC to rt. 5.5 h. 56%. 45 min. 88%. -NO2. 2 a. R. o. 80% TFA. 0 C to rt. Yields from the recrystallation.. Scheme 2-10. 6-(5-(methyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine O. O HN. HN O TBSO. N. NH 2. O O. N. OH. O. a TBSO. 11. N N O. O O. O. N. CH 3. O 12pc. Reagents and conditions : (a) acetic anhydride (1.2 eq), Et3N (1.5 eq), DMAP (0.3 eq), CH2Cl2, 0oC then reflux, 8 h, 16%. 45.

(58) 另外，嘗試由化合物 11 與 acetic anhydride 反應、加入 DMAP 作為催化劑及 Et3N 作為鹼的條件下，使用溶劑為 CH2Cl2 進行合環反應，雖然成功地得到產物 (12pc)，但卻尚有未反應完的起始物，因此產率極低；也可由化合物 11 加入 acetic formic anhydride 作為反應物；DMAP 作為催化劑及 Et3N 作為鹼的條件下，在溶劑為 THF 進行合環反應，成功地得到產物 (12pd) (Scheme 2-10 & Scheme 2-11)。 Scheme 2-11. Synthesis of 6-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)uridine O. O HN. HN O TBSO. N. N. OH. NH 2. O O. O. a TBSO. N. N. N O. O O. O 11. H. O 12pd. Reagents and conditions : (a) acetic formic anhydride (1.3 eq), Et3N (2.9 eq), THF, 0oC then reflux, 8 h, 36%. 最後，再將具有 6-ozadiazole 結構的 uridine 衍生物 (12pc-12pd) 以 80% 的 TFA 水溶液去保護，得到最終的產物 (12c-12d) (Scheme 2-12)。 Scheme 2-12. Deprotection condition O. O HN. HN O TBSO. a. N O. O O. N. N. O. O. a. R. HO. R = CH 3 R=H. ( 12pc ) (12pd). N. N O. O HO. N. OH. R. R = CH3 R =H. Entry. R. Reagent. Temp.. Time. Yielda. 1 2. -CH3 -H. 80% TFA 80% TFA. 0oC to rt 0oC to rt. 2h 45 min. 83% 46%. Yields for the isolated product.. 46. ( 12c) (12d).

(59) 2-3. Conclusion 我們利用 uracil 作為 model 來驗證反應的可行性，隨後應用在 uridine 上合成出一系列的 6-oxadiazole 的衍生物，而我們首先合成羥基具有保護的 6-位 oxime 產物作為起始物後，選用不同官能基的 benzoyl chloride 進行合環反應。而這一系列的 1,2,4-oxadiazole 的產物，希望能透過生物活性的篩選，期望具有抗癌、抗瘧疾的活性，若能與酵素活化中心形成氫鍵，也具有成為 ODCase 抑制劑的潛力。而本部分也是學習核苷化學的第一部分，藉由合成此一系列的化合物來培養對化合物的熟悉度。. 47.

利用一價溴化銅區位選擇活化4-pyridone及uracil衍生物 碳氫鍵進行芳基化反應

利用一價溴化銅區位選擇活化4-pyridone及uracil衍生物碳氫鍵進行芳基化反應