國
立
交
通
大
學
生物科技研究所
碩 士 論 文
登革二型病毒
PL046 感染性質體之建構
Construction of the infectious cDNA clone of dengue virus type 2
PL046 strain
研 究 生：胡旻秀
指導教授：楊昀良 博士
登革二型病毒
PL046 感染性質體之建構
Construction of the infectious cDNA clone of dengue virus type 2
PL046 strain
研 究 生：胡旻秀 Student：Min-Hsiu Hu
指導教授：楊昀良 博士 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang
國 立 交 通 大 學 生物科技研究所
碩 士 論 文
A Thesis
Submitted to Institute of Biological Science and Technology National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master
in
Biological Science and Technology June 2009
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
摘 要
登革病毒為全長 10.7 kb 的正單股形 RNA 病毒，屬黃質病毒科
（Flaviviridae）黃質病毒屬（Genus Flavivirus）。目前登革病毒感染性質體 （infectious cDNA clones or infectious clone）的研究，皆是利用原核生物啟 動子調控病毒基因表現，需再經過體外轉錄（in vitro transcription）及接上 5’端 cap 的加工過程，用加工後的病毒 RNA 轉染至宿主細胞後產生病毒顆 粒。根據同屬的西尼羅病毒（West Nile virus）研究指出，以巨細胞病毒 （cytomegalovirus；CMV）啟動子替代原核生物啟動子後，可以直接由轉 染感染性質體的方式獲得病毒。本研究亦致力以此新穎的模式，建構本土 登革二型病毒PL046 之感染性質體。 先前由實驗室前人賴建斈，將登革二型病毒 PL046 全長基因組建構於 pcDNA3 質體後，成功建構出由巨細胞病毒啟動子所調控之感染性質體 pcDNA3/DV2F。但進一步將其轉染至宿主細胞（BHK-21）後，未能獲得病 毒顆粒。為了找出可能的原因，將病毒基因序列進行全長定序分析，發現 其中產生了數個無義突變（nonsense mutation）與轉譯閱讀框架位移突變 （frame shift mutation）。此外，在建構感染性質體的時候，5’端及 3’端非轉 譯區（3’-untranslated region；3’-UTR）外側所殘留的多餘序列，亦可能影 響病毒複製。因此，本研究嘗試將突變的序列修正，再以聚合酶鏈反應 （polymerase chain reaction；PCR）及核醣酶（ribozyme）等方法，修飾出
完整的病毒基因 5’端與 3’端非轉譯區。期望修正後的感染性質體能產出病
毒顆粒，為本土登革病毒後續研究提供幫助。
結果顯示，修正後的登革二型病毒 PL046 感染性質體轉染至宿主細胞
Abstract
Dengue virus (genus Flavivirus, family Flaviviridae) is a single-stranded and positive-sense RNA virus with a 10.7 kb genome. Generally, most of the dengue virus infectious clones (or infectious cDNA clones) are under the control of prokaryotic promoter. To generate the virus RNA, the process requires in vitro transcription and addition of 5’-cap. According to the study of West Nile virus (Flavivirus), the virus could be recovered from the plasmid DNA-transfected cells directly while prokaryotic promoter was replaced by cytomegalovirus (CMV) promoter. Based on this concept, the objective of the present study was to employ this strategy to construct the DNA-launched dengue virus type 2 PL046 strain (Taiwan local isolated) infectious clones.
Previously, the whole genome of dengue virus type 2 PL046 strain was successfully constructed in pcDNA3 plasmid by laboratory predecessors. This infectious clone was named pcDNA3/DV2F and the viral genome was placed under the control of CMV promoter. However, no virus particles were produced in transfected host cells (BHK-21). After full-length sequencing of the clones, several mutations such as nonsense mutation and frame shift mutation were discovered in this study. In addition, there remained certain superfluous nucleotide at the 5’- and 3’- end of viral genome. These non-viral sequence may affect viral replication. Restriction fragment replacement, polymerase chain reaction (PCR), and introduction of ribozyme were applied to correct the mutation and remove excess sequence from the 5’- and 3’- untranslated region (UTR) of viral genome.
The new infectious clone was transfected into host cells for the production of viruses. However, no virus particle was detected, although viral RNA was detected.
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目錄 中文摘要……….….. i 英文摘要……….…..ii 誌謝……….……..iii 目錄………..iv 表目錄………..vii 圖目錄………...……..viii 附錄目錄……….……...……..xi 縮寫表………..xii 壹、緒論... 1 1.1 登革熱的歷史與現況... 1 1.2 登革病症的臨床病徵... 2 1.3 登革病毒的分子生物學背景... 3 1.4 登革病毒的感染性質體... 3
1.5 DNA-launched infectious molecular clone... 4
1.6 登革病毒的 5’與 3’非轉譯區 ... 5 1.7 核糖酶 ... 5 1.8 材料來源與實驗設計... 6 貮、材料... 8 2.1 菌株 ... 8 2.2 細胞株 ... 8 2.3 病毒 ... 8 2.4 質體 ... 8 2.5 引子 ... 10 2.5.1 DNA定序使用的引子 ... 10 2.5.2 PCR及RT-PCR使用的引子 ... 12 2.5.3 架構CP5’片段使用的引子... 13 2.6 藥品試劑 ... 13
2.7 試劑組 ... 15 2.8 溶劑、緩衝溶液及培養基... 16 2.9 儀器設備 ... 16 參、方法... 18 3.1 細胞繼代培養 ... 18 3.1.1 BHK-21 細胞繼代培養 ... 18 3.1.2 C6/36 細胞繼代培養 ... 18 3.2 登革病毒的增殖 ... 18 3.3 空斑試驗 ... 19 3.4 BHK-21 細胞轉染 ... 19 3.5 細胞RNA的萃取... 19 3.6 DNase I處理... 20 3.7 反轉錄及聚合酶鏈反應... 20 3.7.1 反轉錄 ... 20 3.7.2 聚合酶鏈反應 ... 21 3.8 免疫螢光染色 ... 21 3.9 以聚合酶鏈反應製作CP5’片段... 21 3.10 大腸桿菌勝任細胞的轉形... 22 3.10.1 大腸桿菌勝任細胞的製備 ... 22 3.10.2 勝任細胞的轉形 ... 23 3.11 質體DNA之萃取 ... 23 3.11.1 小量質體萃取 ... 23 3.11.2 大量質體萃取 ... 24 3.12 限制酵素反應 ... 24 3.13 去磷酸反應 ... 25 3.14 萃取洋菜膠內之DNA片段 ... 25 3.15 接合反應 ... 25 3.16 生長曲線試驗 ... 26
肆、結果... 27 4.1 本土登革二型病毒PL046 感染性質體序列分析 ... 27 4.1.1 感染性質體pcDNA3/DV2F-P在NS1 蛋白上的無義突變 ... 27 4.1.2 感染性質體全長定序 ... 27 4.2 感染性質體缺失突變的修正... 28 4.2.1 pcDNA3/DV2F-Q/S2 質體建構... 29 4.2.2 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 質體建構 ... 29 4.3 感染性質體 3’UTR的修飾... 29 4.3.1 pcDNA3/prS2ApaI質體建構... 30 4.3.2 pcDNA3/prS2/3’Rz質體建構... 30 4.3.3 pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz質體建構... 31 4.3.4 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz質體建構... 31 4.4 感染性質體 5’UTR的修飾... 31 4.4.1 pcDNA3/CP5’質體建構 ... 32 4.4.2 pCP質體建構 ... 32 4.4.3 pCPR質體建構... 33 4.5 登革二型病毒PL046 感染性質體之表現 ... 33 4.5.1 以RT-PCR檢測感染性質體的轉錄... 34 4.5.2 以空斑試驗檢測感染性質體的感染力... 34 4.6 感染性質體的生長曲線... 35 伍、討論... 36 5.1 質體建構 ... 36 5.2 登革二型病毒PL046 感染性質體表現 ... 36 5.3 以免疫螢光染色檢測感染性質體的轉譯... 37 5.4 分析無法得到病毒顆粒的可能原因... 37 5.5 感染性質體在SURE 2 strain菌株的生長情形... 40 陸、結論... 41 柒、參考文獻... 42
表目錄 表一、登革病毒感染性質體... 47 表二、感染性質體pcDNA3/DV2F-Q、R、S、T，以引子D2F1873 定序結 果... 48 表三、將「表二」pcDNA3/DV2F-Q、S、T的定序結果轉換成胺基酸序列， 轉換部份包含DNA序列nt2083~nt2559... 50 表四、感染性質體pcDNA3/DV2F-Q、S全長序列與DV2 PL046 strain比對 結果... 51 表五、pcDNA3/DV2F-Q/S2 定序結果... 55 表六、pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 定序結果 ... 56 表七、pcDNA3/prS2/3’Rz定序結果... 58 表八、pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz定序結果... 59 表九、pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz定序結果 ... 60 表十、pcDNA3/CP5’定序結果 ... 62
圖目錄 圖一、登革病毒各基因位置及預測的非轉譯區結構... 64 圖二、推導出之賴建斈建構的感染性質體pcDNA3/DV2F，在 5’UTR上游 及3’UTR下游多餘的序列 ... 65 圖三、定序引子在登革病毒基因之相對位置圖... 66 圖四、以限制酵素反應修正感染性質體pcDNA3/DV2F-Q之缺失突變... 67 圖五、pcDNA3/DV2F-Q/S2 質體建構... 68 圖六、pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 質體建構 ... 69
圖七、登革二型病毒NGC strain與PL046 strain的Apa I限制切位對照... 70
圖八、登革病毒基因3 端序列接合 3’-ribozyme序列示意圖... 71 圖九、以限制酵素反應修正感染性質體pcDNA3/DV2F-Q之缺失突變，同 時引入3’-ribozyme序列... 72 圖十、pcDNA3/prS2ApaI質體建構... 73 圖十一、pcDNA3/prS2/3’Rz質體建構... 74 圖十二、pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz質體建構... 75 圖十三、pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz質體建構 ... 76 圖十四、pcDNA3/CP5’質體建構流程示意圖... 77 圖十五、CP5’片段示意圖... 78 圖十六、以CP5’片段修正感染性質體登革基因 5 端序列示意圖 ... 79 圖十七、pcDNA3/CP5’質體建構 ... 80 圖十八、pCP質體建構... 81 圖十九、pCPR質體建構 ... 82
圖二十、(A)pcDNA3/DV2F經Ava I或Eco RV + Pst I限制酵素作用位置圖(B) 所得電泳分析圖... 83
圖二十一、(A)pcDNA3/DV2F-Q/S2 經Ava I或Kpn I限制酵素作用位置圖(B) 所得電泳分析圖... 84
圖二十二、(A)pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 經Ava I或Kpn I限制酵素作用位置 圖(B)所得電泳分析圖 ... 85
圖二十三、(A)pcDNA3/prS2ApaI經Ava I或Eco RV + Pst I限制酵素作用位
置圖(B)所得電泳分析圖 ... 86
圖二十四、(A)pcDNA3/prS2/3’Rz經Bsp HI或Apa I限制酵素作用位置圖(B) 所得電泳分析圖... 87
圖二十五、(A)pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz經Ava I或Kpn I限制酵素作用位置 圖(B)所得電泳分析圖 ... 88
圖二十六、(A)pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz經Ava I或Kpn I限制酵素作用 位置圖(B)所得電泳分析圖 ... 89
圖二十七、(A)pcDNA3/CP5’經Pst I或Ava I + Cla I限制酵素作用位置圖(B) 所得電泳分析圖... 90
圖二十八、(A)pCP經Ava I或Spe I限制酵素作用位置圖(B)所得電泳分析圖 ... 91
圖二十九、(A)pCPR經Ava I或Spe I限制酵素作用位置圖(B)所得電泳分析 圖... 92
圖三十、(A)pcDNA3 及pGEM-T/DV2-3'Rz經Xba I限制酵素作用位置圖(B) 所得電泳分析圖... 93 圖三十一、以PCR檢測pCP及pCPR的 5 端上游多餘序列... 94 圖三十二、以RT-PCR檢測感染性質體在BHK-21 細胞的RNA表現... 95 圖三十三、對RNA extract進行PCR以觀察是否有殘留的質體... 96 圖三十四、以空斑試驗觀察經轉染48 小時後之空斑數目... 97 圖三十五、以空斑試驗觀察經轉染48 小時後之上清液病毒數目 ... 98 圖三十六、以空斑試驗觀察經轉染72 小時後之空斑數目... 99 圖三十七、以空斑試驗觀察經轉染72 小時後之上清液病毒數目 ... 100 圖三十八、以空斑試驗觀察經轉染96 小時後之空斑數目... 101 圖三十九、以空斑試驗觀察經轉染96 小時後之上清液病毒數目 ... 102 圖四十、(A)感染性質體pCPR與pcDNA3 之生長曲線(B)位於生長曲線相對 時間點之菌落數目... 103 圖四十一、以倒立顯微鏡觀察細菌外觀... 104
圖四十二、以免疫螢光染色檢測感染性質體在BHK-21 細胞之NS1 蛋白表 現... 105 圖四十三、(A)用於HCV的 3’-ribozyme結構，以及參照其結構所設計之登
革病毒3’-ribozyme示意圖(B)由Haseloff和Gerlach所定義的ribozyme
附錄目錄 附錄一、pcDNA3 質體示意圖 ... 107 附錄二、pGEM-T質體示意圖 ... 108 附錄三、pEGFP-N2 質體示意圖... 109 附錄四、pcDNA3/DV2F-Q質體示意圖... 110 附錄五、pcDNA3/DV2F-S質體示意圖... 111 附錄六、(A)用於HCV的 3’-ribozyme結構，與參照其結構所設計之登革二 型病毒PL046 之 3’-ribozyme示意圖(B)pGEM-T/DV2-3’Rz質體示意 圖... 112
附錄七、QIAGEN Plasmid Midi Kit各種緩衝液的成份 ... 113
縮寫(Abbreviation)
BHK-21 Baby hamster kindey cell
BSA Bovine serum albumin
cDNA complenmentary deoxyribonucleotide nucleic acid
CMV cytomegalovirus
DNA Deoxyribonucleic acid
DV Dengue virus
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid
EtBr Ethidium bromide
FBS Fetal bovine serum
LB broth Luria-Bertni broth
MEM Minimun Essential Medium
ORF Open reading frame
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic acid
RT Reverse transcription
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris-acetate-EDTA
Tris Tris(Hydroxymethyl)aminomethane
壹、緒論
登革熱（dengue fever, DF）病症是一種感染登革病毒（dengue virus, DV） 所引起的傳染病，在台灣藉由埃及斑蚊（Aedes aegypti）及白線斑紋（Aedes
albopictus）叮咬宿主的途徑傳播給人，好發於熱帶及亞熱帶地區，是現今
世界由節肢動物感染人類的最重要病毒性疾病(Guha-Sapir and Schimmer, 2005)。世界衛生組織（World Health Organization, WHO）表示，近年來登
革熱已經成為國際重要公共衛生議題之一。全球有五分之二的人口（約 25
億人）受到登革病毒的威脅，登革熱的病徵已遍佈 100 多個國家。每年約
有5 千萬人受到病毒感染，其中約有 20 ~ 50 萬人會出現登革出血熱（dengue
haemorrhagic fever, DHF）的症狀，需要住院治療(Ligon, 2005; Liu et al., 2008)。台灣隸屬亞熱帶國家，氣候溫暖潮濕，非常適合病媒蚊孳生，在 1915、1931、1942 年曾爆發全島性登革熱，到了 1987、2002 年又再度爆發 大規模感染，且自1987 年後，每年都有登革熱的確定病例（行政院衛生署 疾病管制局）。目前尚無有效防治疫情的疫苗和藥物，登革病毒對於國民的 健康仍是威脅，因此，預防與治療的研究工作是當今重要課題。 1.1 登革熱的歷史與現況 近代西元歷史上，登革病毒在1779 至 1780 年就曾爆發於印尼雅加達、 埃及開羅及北美費城(Ligon, 2005)。二次世界大戰期間，軍隊行軍到世界各 地，讓登革病毒在短時間內迅速散播，病例數在短時間遽增，病情也比以 往嚴重，在 1953 年菲律賓的病患出現登革出血熱的病徵(Mairuhu et al., 2004)，到 1970 年有 9 個國家也有此病徵產生，此後更是向外漫延。而病例 數也由年平均908 人（西元 1950s），增加到 50 餘萬人（西元 1990 ~ 1998）
(Ligon, 2005)。病情更嚴重的患者會產生登革休克症候群（dengue shock syndrome, DSS），可能導致病人在 12 ~ 24 小時內死亡。在台灣，日治時期 1915 年（民國 4 年）、1931 年（民國 20 年）、1942 年（民國 31 年）發生過
三次全島性登革熱，其中 1942 年約有六分之五的人口（500 萬人）感染。
播。直到1981 年（民國 70 年）小琉球漁民由菲律賓帶入第二型登革病毒， 造成島上約 80%居民感染，而台灣本島亦於 1987、1988 年（民國 76、77 年）在屏東、高雄一帶爆發第一型登革病毒流行，之後幾乎每年都有本土 登革熱病例出現（行政院衛生署疾病管制局）。戰爭、城市興建、交通運輸 業發達及溫室效應的影響，讓登革熱疫情擴散到熱帶、亞熱帶各個國家， 不僅感染規模擴大、患病人數增加，症狀也變的更加嚴重(Mackenzie et al., 2004)，造成疫區國家經濟損失，國民健康受到威脅，是全球必須積極解決 的人類重大傳染病。 1.2 登革病症的臨床病徵 臨床上，登革病毒依其血清抗原性不同可分為四個血清型（serotype）， 分別是DV1、DV2、DV3及DV4。根據目前的看法，登革病毒會隨著蚊子的 唾液進入人體內，並於血管內皮細胞中短暫增殖後（潛伏期3 ~ 14天，平均 4 ~ 7天(Kao et al., 2005)），再釋放到血流中造成病毒血症（viremia）並破壞 組 織 ， 此 時 病 患 開 始 有 臨 床 症 狀 出 現 。 臨 床 症 狀 可 能 為 無 症 狀 （asymptomatic），或依其嚴重程度可區分為三種：登革熱（dengue fever, DF）、登革出血熱（dengue hemorrhagic fever, DHF）以及登革休克症候群 （dengue shock syndrome, DSS）。
DF一般有發燒、頭痛、眼窩疼痛、肌肉關節痠痛、皮膚紅疹、淋巴結 腫大及白血球減少等病徵(Nimmannitya, 1987)。在臨床實驗室的診斷上，亦 發 現DF 的 病 患 有 嗜 中 性 白 血 球 較 低 （ neutropenia ） 與 血 小 板 較 少 （thrombocytopenia）的現象。DHF的病徵初期與DF相同，但在發燒將要退 時，由於血管內皮細胞受到影響，造成血管通透性（capillary permeability） 增加，因此有血漿滲出（plasma leakage）的現象發生，臨床上會併發水腫、 紅血球濃縮（hemoconcentration）、胸腔液滲出（pleural effusion）及產生腹 水 等 現 象 。 而 當 病 患 血 漿 滲 出 量 過 多 時 ， 進 一 步 呈 現 休 克 現 象 ， 即 DSS(Kalayanarooj et al., 1997)。此時病人皮膚濕冷、四肢冰涼、脈搏壓變窄 （脈搏壓≦20mmHg），若無及時給予適當的輸液治療，死亡率將可達到10 ~
15%(Gubler, 2002)。
1.3 登革病毒的分子生物學背景
登革病毒為正向單股RNA 病毒，分類上是屬黃質病毒科（Flaviviridae）
黃質病毒屬（Flavivirus），常見的同屬病毒有：西尼羅病毒（West Nile virus）、
日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）、黃熱病毒（Yellow fever virus）
等。登革病毒的病毒顆粒直徑約為50 nm，基因體（genome）全長約 10.7 kb，
結構依次為：5’端 cap 結構；5’端非轉譯區（5’ untranslated region, 5’UTR）；
單一的 open reading frame（ORF）；3’端非轉譯區（3’ untranslated region,
3’UTR）。比較特別的是它缺乏3’端 poly A（如圖一所示）。進行轉譯時，只
會合成出一條多肽鏈（polypeptide），再經由病毒本身的蛋白質酵素（viral protease）和宿主細胞內的訊息酵素（signalase）作用，將多肽鏈裂解成獨 立的蛋白，最後產生出三個結構性蛋白（structural protein），來構成病毒的 外在結構，包括：衣殼蛋白（capsid protein, C）、前驅膜蛋白（precursor
membrane protein, prM）及外膜蛋白（envelope protein, E）；和七個非結構性
蛋白（non-structural protein），則是與病毒的 RNA 複製及病毒的蛋白裂解
有關，包括：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 及 NS5 (You et al.,1999)。
1.4 登革病毒的感染性質體
將RNA 病毒基因組，以 cDNA 的方式保存，能有效幫助病毒包裝訊號
搜尋、核苷酸變異影響及疫苗研究等。
感染性質體（infectious cDNA clone; infectious clone），是把病毒全長基
因組以 cDNA 的形式保存於載體中，且其轉錄出的 RNA 可如同病毒 RNA
一般，投入宿主細胞後具有產生感染性病毒顆粒的能力。目前已有許多
Flavivirus 製作感染性質體，如：登革病毒、日本腦炎、Kunjin 病毒、小兒
麻痺病毒（Poliovirus）、西尼羅病毒、黃熱病毒等。
在登革病毒的研究中，Lai等人於1991年率先完成第一個DV4的感染性 質體(Lai et al., 1991)，且能在E. coli內大量複製。然而，由於病毒基因在E.
coli系統的不穩定
，
使後來的建構陸續發生問題。為了解決不穩定的問題， Kapoor等人利用in vitro ligation的方式，將分為二段的序列連結為全長序 列，以其為模板合成出病毒RNA(Kapoor et al., 1995)；Polo等人則利用yeast system複製感染性質體(Polo et al., 1997)。之後在Kinney等人和Gualano等人 的研究中，才成功使用low copy number載體，在E. coli內複製感染性質體 (Kinney et al., 1997; Gualano et al., 1998)。直到2001年，Sriburi 等人將E. coli 以低溫（25℃）、抗生素減半（25μg/ml ampicillin）的方式培養，降低了感 染性質體的不穩定性，是第一個成功利用high copy number載體複製感染性 質體的例子(Sriburi et al., 2001)。但後來的Pierro等人，嘗試以low copy number載體製作Jamaica83 1409 strain的感染性質體時，卻又失敗，考量降 低 病 毒 序 列 對 E. coli 的 影 響 ， 將 序 列 置 換 到 pBAC 載 體 （ single-copy number），才成功獲得感染性質體(Pierro et al., 2006)。各文獻所使用的材料 整理於表一。1.5 DNA-launched infectious molecular clone
至今的登革病毒感染性質體，主要是利用 SP6 或 T7 啟動子，以 in vitro transcription 的方式合成出病毒 RNA，加上 5’端 cap 後，轉染至宿主細胞 （BHK-21）中，觀察是否有空斑（plaque）生成。而此方法的缺點是過程 煩雜，且耗費時間。
在西尼羅病毒的研究中，Yamshchikov 等人亦於 SP6 啟動子下游建構出 含 病 毒 全 長 基 因 序 列 的 感 染 性 質 體 ：pSP6WN/Xba(Yamshchikov et al., 2001.)。之後，Pierson 等人企圖排除 in vitro transcription 及加上 5’端 cap 等
煩雜過程，將pSP6WN/Xba 的 SP6 啟動子更換為真核表現的 CMV 啟動子，
建構出可以直接於哺乳動物細胞表現的感染性質體：pWNII-Not，將其直接 轉 染 至 哺 乳 動 物 細 胞 後 ， 即 可 成 功 產 生 病 毒 顆 粒 ， 並 將 此 方 法 稱 為 “DNA-launched infectious molecular clone＂(Pierson et al., 2005)。同年，猪 生殖與呼吸綜合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）也以相同方法製作出了感染性質體(Lee et al., 2005)。
1.6 登革病毒的 5’與 3’非轉譯區
非轉譯區（untranslated region, UTR），是指在 open reading frame（ORF）
以外的序列，因其位於ORF 的上游與下游，而稱之為 5’非轉譯區（5’UTR）
與 3’非轉譯區（3’UTR）。病毒基因組的 UTR 雖然不會轉譯出蛋白序列，
但其特殊的序列與結構，亦可能在病毒生命週期中扮演著重要的角色，如：
Flaviviridae 家族中的肝炎病毒屬（Hepacivirus）、瘟疫病毒屬（Pestivirus）
及G 型肝炎病毒（hepatitis G viruses, HGV/GBV-C）等，通常於 5’UTR 會
有internal ribosomal entry site（IRES）結構，作為病毒特殊的轉譯方式。而
在同屬病毒間，亦常發現高度保留的序列或結構，如：Flavivirus 的登革病
毒、日本腦炎病毒及黃熱病毒等，其 UTR 皆具有互補序列（cyclization
sequence, CS），而且都有相似的髮夾（loop）結構存在(Thurner et al., 2004)。
在登革病毒的 UTR 研究中，Edgil 等人發現ㄧ個 3’UTR 的點突變，就
足以降低病毒的產量（low-passage）(Edgil et al., 2003)。之後學者也發現， 3’UTR 能有效提升病毒 RNA 轉譯的效率(Holden et al., 2004)，亦是在病毒 複製過程中所必需(Yu et al., 2005)。另一方面，5’UTR 的缺陷也影響著病毒 轉譯效率(Cahour et al., 1995)。不論是 DV1 ~ DV4，當 block 住 5’UTR 裡的 SL（stem-loop）區域時，病毒的複製也隨之受到影響(Kinney et al., 2005)。 進一步的研究更指出，5’UTR 的 SLA（large stem-loop）存在，提升了病毒
性RdRp（viral RNA-dependent RNA polymerase）的合成效率達 10 倍以上，
因此SLA 序列很可能是 RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）重要的辨
識序列(Filomatori et al., 2006)。而 5’UTR 與 3’UTR 存在的互補序列
（cyclization sequence, CS ）， 使 病 毒 序 列 產 生 long-range RNA-RNA
interactions 的現象，亦可能與病毒的複製機制有關(Alvarez et al., 2005)。
1.7 核糖酶
具有催化能力的 RNA，俗稱“核糖酶＂（ribozyme）。是由切赫（Cech TR）
於1981 年最先發現(Cech et al., 1981)，並於 1989 年獲得諾貝爾化學獎。隨
序列改變了，相對也會改變其作用的序列(Zaug et al., 1986)。
自然界的 ribozyme 種類繁多，依其作用方式不同，可將其分為 cleaving ribozymes 和 splicing ribozymes 兩大類(reviewed in Serganov, A. and Patel, DJ., 2007)。在 cleaving ribozymes 中，催化反應作用於自身序列（cis-acting）的， 又可歸類成(1). self-cleaving ribozymes，長度約介於 40 ~ 200 個核苷酸，當
中包括4 個發現於 satellite RNAs 的：hammerhead、hairpin、Varkud satellite
（VS）和 hepatitis delta virus（HDV） ribozymes，此類 ribozymes 主要參與 滾環式複製（rolling-circle replication mechanism）時的 RNA 修飾過程，將 long multimeric RNAs 切割成 short monomers；另外還包括 3 個參與訊息 RNA （mRNAs）調控相關的：co-transcriptional cleavage（CoTC）、cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 3（CPEB3）和 glmS ribozymes，是屬
於較近期所發現的 ribozymes。(2). 目前為止，RNase P 是唯一發現能在自
然界中以 in trans 方式作用的 ribozyme，歸類為 tran-cleaving ribozymes，長
度約介於140 ~ 500 個核苷酸，主要功能是幫助攜帶 RNA（pre-tRNA）的
成熟。相較於cleaving ribozymes，splicing ribozymes 包含了兩個連續的反
應：RNA 的 cleavage 和 ligation，序列長度也相對較長，由數百到數千個核
苷酸所組成，作用是將intron 除去，並且連接兩端的 exon，主要有 group I
introns 和 group II introns 兩類。
質體建構完成後，基因 3’端常伴隨著質體本身的 MCS（multiple cloning sites）和 poly A 訊號等序列，為了修飾出完整的登革二型病毒 PL046 之 3’UTR，實驗室前人杜育穎參照 Heller 等人的研究(Heller et al., 2005)，將原
先使用於C 型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染性質體的 3’-ribozyme，
設計成登革二型病毒PL046 的 3’-ribozyme，架構於 pGEM-T 載體上，請參
照附錄六(杜育穎, 2007, 交大碩士論文)。此一 ribozyme 屬於 self-cleaving
的hammerhead ribozyme，本研究之後亦是利用此 3’-ribozyme 做感染性質體
的登革二型病毒PL046 基因之 3’UTR 修飾。
先前，為了建構本土登革二型病毒 PL046 的感染性質體，實驗室前人 楊明浩嘗試以 RT-PCR 製作出數個 overlapping 的登革病毒基因片段，再以 片段剪接的方式，期望接合出全長的病毒基因片段。不過此方法需耗費大 量時間去建構數個片段的質體，再加上早期資料有限的情況下，經過努力 後仍然無法順利獲得。之後，實驗室前人賴建斈企圖直接由RT-PCR 製作出 全長的登革病毒基因片段，再測試過數種酵素及條件之後，成功利用 Taq
DNA polymerase XL（Protech, Cat. P6a）放大出全長 10.7 kb 的病毒基因片
段。利用預先設計在 primer 上的單一切位，以及參考 Sriburi 等人的方法
(Sriburi et al., 2001)，以低溫（25℃）及抗生素減半（25μg/ml ampicillin） 的條件下選殖 E.coli，成功以 pcDNA3 質體（high copy number plasmid）選
殖出含有登革二型病毒 PL046 全長基因序列之感染性質體。利用 pcDNA3 質體具有CMV 啟動子的特性，直接將此質體轉染至 BHK-21 細胞中作表現 後，卻仍是無法由轉染後之細胞偵測到病毒的產生(賴建斈, 2006, 交大碩士 論文)。 為了明白前人賴建斈所建構的登革二型病毒 PL046 感染性質體為何無 法順利產生病毒，本研究將嘗試對其進行詳細的檢查與可能的修正。首先， 感染性質體的製作過程中可能會產生突變，不正確的序列將會影響病毒正 常表現，因此將以全長基因定序，檢查序列的完整性，並以資料庫的 DV2 PL046 strain（AJ968413, NCBI）之基因序列為標準進行比對。再來，登革 病毒基因的5’UTR 與 3’UTR 證實為病毒複製所必須，考量自然型態的完整 性，計劃移除質體建構時所多出的序列，如：5’UTR 上游多餘的 MCS 序列 和T7 啟動子序列；3’UTR 下游多餘的 MCS 序列和 poly A 訊號（請參照圖 二）。 期望在確認完病毒基因序列的正確性，以及修正完錯誤的地方後，將 此感染性質體轉染至 BHK-21 細胞中，能順利觀察到病毒的產生，獲得正 確的登革二型病毒PL046 之感染性質體。
貮、材料
2.1 菌株
Escherichia coli DH5α（Dr. Yang’s laboratory collection） Escherichia coli SURE 2（Stratagene, Cat. 200152）
2.2 細胞株
BHK-21（幼倉鼠腎臟纖維母細胞，baby hamster kidney cell） C6/36 （白線斑蚊細胞，Aedes albopictus cell）
2.3 病毒
Dengue virus type 2 PL046 strain（Taiwan local strain）
2.4 質體 質體 特性 Reference pcDNA3 篩選標記為Ampicillin，含有 T7 及 CMV 啟動子。請參照附錄一。 Invitrogen pGEM-T 篩選標記為 Ampicillin，含有 T7 及 SP6 啟動子。請參照附錄二。 Promega
pEGFP-N2 含有reporter gene，enhanced green
fluorescent protein gene。請參照附錄三。 BD Biosciences Clontech pcDNA3/DV2F-Q pcDNA3 上帶有 PL046 strain 全長的基因 序列（尚有缺失。ΔT：nt2820，ΔA： nt10449）。請參照附錄四。 Yang’s lab. 賴建斈
pcDNA3/DV2F-S pcDNA3 上帶有 PL046 strain 全長的基因 序列（尚有缺失。ΔG：nt737）。請參照 附錄五。 Yang’s lab. 賴建斈 pGEM-T/DV2- 3’Rz pGEM-T 上帶有 PL046 strain 的 3’端序 列，176 bp，3’UTR 下游有 3’-ribozyme 序列。請參照附錄六。 Yang’s lab. 杜育穎 pcDNA3/CP5’ pcDNA3 上，CMV 啟動子轉錄出的第一 個核苷酸即為 PL046 strain 的第一個核 苷酸，其後包含 PL046 strain 的 5’端序 列，894 bp。 本研究 pcDNA3/DV2F- Q/S2 pcDNA3/DV2F-Q 的ΔA：nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接修正。 本研究 pcDNA3/DV2F- Q/S2/S1 pcDNA3/DV2F-Q 的ΔT：nt2820 和ΔA： nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接 修正。 本研究
pcDNA3/S2 pcDNA3 上帶有 pcDNA3/DV2F-S 的 3’
端序列，1786 bp（約+8762 ~ +10547）。 本研究 pcDNA3/S2/3’Rz pcDNA3 上帶有 pcDNA3/DV2F-S 的 3’ 端 序 列 ，1961 bp ， 3’UTR 下 游 有 3’-ribozyme 序列。 本研究 pcDNA3/DV2F- Q/S2/3’Rz pcDNA3/DV2F-Q 的ΔA：nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接修正，3’UTR 下游有3’-ribozyme 序列。 本研究 pcDNA3/DV2F- Q/S2/S1/3’Rz pcDNA3/DV2F-Q 的ΔT：nt2820 和ΔA： nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接 修正，3’UTR 下游有 3’-ribozyme 序列。 本研究
nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接 修正。且CMV 啟動子轉錄出的第一個核 苷酸即為PL046 strain 的第一個核苷酸。 pcDNA3/CPR pcDNA3/DV2F-Q 的ΔT：nt2820 和ΔA： nt10449，以 pcDNA3/DV2F-S 序列剪接 修正。且CMV 啟動子轉錄出的第一個核 苷酸即為 PL046 strain 的第一個核苷 酸。3’UTR 下游有 3’-ribozyme 序列。 本研究 2.5 引子 2.5.1 DNA 定序使用的引子 引子 序列 5’~ 3’ 位置 D2R550 註 2 CCATGAGGGTACACATG DV2 (NGC；M29095) gene: +550 ~ +534 D2F265 CTAACAATCCCACCAACAGC DV2 (NGC；M29095) gene: +265 ~ +284 D2F796 GCCCAGAGAATTGAAACTTG DV2 (NGC；M29095) gene: +796~ + 815 D2F1431 ACCACAGAGTTCCATCACAG DV2 (NGC；M29095) gene: +1431 ~ +1450 D2F1873 GCAGAAACACAACATGGAAC DV2 (NGC；M29095) gene: +1873 ~ +1892 D2F2401 註 2 TTGGGAGTTATGGTGCAG DV2 (NGC；M29095) gene: +2401 ~ +2418 D2F2901 註 2 TGGAGTATTCACCACCAAT DV2 (NGC；M29095)
gene: +2901 ~ +2919 D2F3411 GTACGGGATGGAAATCAGAC DV2 (NGC；M29095) gene: +3411 ~ +3430 D2F3930 TATCTTGTGCGTCCCAAATG DV2 (NGC；M29095) gene: +3930 ~ +3949 D2F4401 GGAAGAACAAACACTGACC A DV2 (NGC；M29095) gene: +4401 ~ +4420 D2F4911 TTCTCCTGGAACCTCAGGAT DV2 (NGC；M29095) gene: +4911 ~ +4930 D2F5401 ATAGCGGCTAGAGGATACAT DV2 (NGC；M29095) gene: +5401 ~ +5420 D2F5882 CAGCACAAAGAAGAGGGAG DV2 (NGC；M29095) gene: +5882 ~ +5900 D2F6401 AAATGGGTAGGCTTCCAACT DV2 (NGC；M29095) gene: +6401 ~ +6420 D2F6895 GAGAGCAACATCCTGGACAT DV2 (NGC；M29095) gene: +6895 ~ +6914 D2F7401 GGCTTTAACCTTAGCGACC DV2 (NGC；M29095) gene: +7401 ~ +7419 D2F7892 CAGGACATGAAGAACCCAT DV2 (NGC；M29095) gene: +7892 ~ +7910 D2F8331 AGATGTAGACCTCGGAAGCG DV2 (NGC；M29095) gene: +8331 ~ +8350 D2F8841 GGCTGTTGAAGATAGTAGGT DV2 (NGC；M29095) gene: +8841 ~ +8860 D2F9401 CTTTCACCAATATGGAAGCC DV2 (NGC；M29095) gene: +9401 ~ +9420
D2F9920 CATCACATTGGGTTCCAAC DV2 (NGC；M29095) gene: +9920 ~ +9938 D2F10270註 2 CGGGATCC{TAGAAGGCAAA ACTAACATGAAACA} DV2 (NGC；M29095) gene: +10270 ~ +10294 註1：此處之引子序列為參考 DV2 NGC strain (M29095, NCBI)所設計。 註2：D2R550、D2F2401、D2F2901、D2F10270 來源為實驗室賴建斈先生。 ｛｝內的序列為模板所具有的序列；｛｝外的序列為外加的 DNA 序列。 2.5.2 PCR 及 RT-PCR 使用的引子 引子 序列5’~ 3’ 位置
CMVf534 AATGTCGTAACAACTCCGCC pcDNA3 (Invitrogen):
+534 ~ +553
5’Rz-r TGTTCTCCTGTGGTGGTACAC
GTCCCATA
DV2 (PL046) gene: +695 ~ +667
T7_F CACTGCTTACTGGCTTATCGA pcDNA3 (Invitrogen):
+839 ~ +859 CM_F AATAACCAACGGAAAAAGGC DV2 (PL046) gene: +100 ~ +119 CM_R CCTATGCAACGCATTGTCA DV2 (PL046) gene: +950 ~ +932 NS5_F2 CCATATTTGGGGAAAAGAGA AGACCA DV2 (PL046) gene: +10078 ~ +10103 NS5_R2 AGTCCTTCCAGTGAGACTAC AGCTTCATC DV2 (PL046) gene: +10584 ~ +10556
註1：pcDNA3 的序列是參考產品說明書（Invitrogen）。 註2：此處 DV2 序列是參考本研究 pcDNA3/DV2F-Q 和 pcDNA3/DV2F- S 的定序結果。 2.5.3 架構 CP5’片段使用的引子 引子 序列 5’~ 3’ 位置 CP-f1 註 2 CTGGCTAACT{AGTTGTTAGTC TACGTGG} DV2 (PL046) gene: +1 ~ +18 CP-f2 註 2 TTTGAGCTCTCTGGCTAACT{A GTTGTTA} DV2 (PL046) gene: +1 ~ +8 CP-r CGGCTGTCAGTAAGATGAAGA TCA DV2 (PL046) gene: +919 ~ +896 註1：CP5’片段，是指 CMV 啟動子下游即為 DV2 PL046 strain 的 5 端片段， 用以去除CMV 啟動子與登革基因之間的序列（請參照圖二及圖十五）。 註2：此處 DV2 序列是參考本研究 pcDNA3/DV2F-Q 的定序結果。｛｝內的 序列為模板所具有的序列；｛｝外的序列為外加的 DNA 序列；畫單底 線部份為外加的酵素切位。 2.6 藥品試劑 藥品名稱 廠商 目錄編號 應用
1kb DNA ladder SibEnzyme SEM11C001 DNA 電泳
2-propanol Sigma I9516 核酸萃取
Acetic acid Fluka 33209 緩衝液
藥品名稱 廠商 目錄編號 應用
Ampicillin Applichem A0839 細菌培養
Anti-NS1 antibody Abcam DN2 細胞染色
Alexa Fluor® 568 goat
anti-mouse IgG antibody Invitrogen A11031 細胞染色
BSA Sigma A3294 細胞培養
CaCl2 Riedel-de Haën 31307 細菌培養
Chloroform Riedel-de Haën 32211 核酸萃取
Crystal violet Sigma C-3886 Plaque
assay
DNase I Biolab M0303S 核酸萃取
DEPC Sigma D-5758 Inactivation
of RNases
EDTA Amresco 0105 緩衝液
EtBr Sigma E-7637 核酸染色
Fetal Bovine Serum Biological industries 04-001-1A 細胞培養
Formaldehyde Riedel-de Haën 33220 固定細胞
Glycerol Amresco 0854-1L 細菌培養
Isoamyl alcohol MERCK 1.00979.1000 核酸萃取
LB agar Alpha Biosciences L12-111 細菌培養
LB broth Scharlau 02-385 細菌培養 Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 細胞轉染 MEM GIBCO 41500-034 細胞培養 Methylcellulose Sigma M0512 空斑測試 NaCl Amresco 0241 細菌培養 NaHCO3 Sigma S-5761 細胞培養
藥品名稱 廠商 目錄編號 應用
Paraformaldehyde Sigma P-6148 細胞染色
PBS Biological
Industries 11-223-1K 細胞培養
Phenol saturated solution Amresco 0945 核酸萃取
ProTaqTM DNA
polymerase Protech PTM525 PCR
Restriction enzyme Biolab, Fermentas – 質體建構
SDS Riedel-de Haën 62862 質體建構
T4 DNA ligase Fermentas 1812 質體建構
Tris base Amresco 0826 緩衝液
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 細胞染色
TrypLETM Express GIBCO 12605-010 細胞培養
2.7 試劑組
試劑名稱 廠商 目錄編號 應用
Gene-SpinTM Miniprep
Purification Kit Protech MP530XL 質體萃取
PCR Clean-up/Gel Extraction Kit Premier N-DCE050 DNA 純化
pGEM®-T vector system I Promega A3600 質體建構
Phusion High-Fidelity PCR Kit BioLabs F-553S 質體建構
QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN 12123 質體萃取
QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN 12143 質體萃取
RNeasy® Mini Kit QIAGEN 74104 RNA 萃取
2.8 溶劑、緩衝溶液及培養基
● 0.5% Triton X-100/PBS
100μl Triton X-100, 19.9 ml PBS ● 1% crystal violet solution (500ml)
5 g crystal violet, 50 ml 37% formaldehyde, 450 ml H2O, ● 1% BSA/PBS
0.2 g BSA in 20 ml PBS ● 3.7% Formaldehyde
37% Formaldehyde diluted with ddH2O ● 4% Paraformaldehyde
0.8 g Paraformaldehyde powder dissolved in 20 ml PBS ● 10% (v/v) Glycerol
12.6 g glycerol (density = 1.26 g/cc)加水至 100 ml ● 10 × TE buffer
100 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA ● 50 × TAE buffer
48.4 g Tris base, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml, 11.42 ml acetic acid added ddH2O to 200 ml
● Blocking solution (Immunofluorescence Staining) 2 ml FBS, 0.2 g BSA, 18 ml PBS
● LB (Luria-Bertni) broth
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl ● LB (Luria-Bertni)/Ampicillin agar
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar, 50 μg/ml or 25 μg/ml Ampicillin
2.9 儀器設備
乾燥加熱板 DB102 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 加熱攪拌器 S101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 酸鹼值檢測計 Φ360 (BECKMAN) 電子天秤 PB153-S (METTLER TOLEDO) 電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技) 往復式恆溫水槽 B206-T1 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 水平式電泳槽 MJ-105 (MEDCLUB)
電泳影像處理系統 GEL DOC 2000 (BIO-RAD) 恆溫式震盪培養箱 B206 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 低溫培養箱 701 (WISOOM)
核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH ) 電磁式奈米級偵測儀 ND-1000 (博克科技有限公司)
PCR 溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD)
梯度核酸增殖儀 labcycler(SENSOQUEST)
微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.) 微量冷凍高速離心機 centrifuge 5415R (eppendorf)
桌上型低溫高速離心機 centrifuge 5804R (eppendorf)
桌上型高速離心機 5100 (KUBOTA CORPORATION)
落地型高速離心機 Avanti® J-E Centrifuge (BECKMAN)
4℃三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON) -20℃直立冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE) -80℃超低溫冷凍櫃 925/926 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 無菌操作台 VCM-420 (造鑫) 血球計數器 (MARIEMFELD) 倒立相位差螢光顯微鏡 TE2000-U (Nikon) 數位相機 C-5050ZOOM (OLYMPUS) 光子成像系統 G:BOX (SYNGENE)
參、方法
3.1 細胞繼代培養
3.1.1 BHK-21 細胞繼代培養
培養液為含有 5% FBS（Fetal Bovine Serum）的 MEM（Minimun Essential
Medium, Gibco, Cat. 41500-034），培養環境為含有5% CO2的37℃恆溫培養
箱。繼代培養流程如下：吸除培養液，以PBS 沖洗兩次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express（Gibco, Cat. 12605-010），37℃反應 5 分鐘，加入適量的培養液輕沖 底盤使細胞脫落，置於15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（KUBOTA 5100），去除上清液，加入適量培養液混合均勻後，取適量細胞轉移至新的 培養皿，置於培養箱培養。 3.1.2 C6/36 細胞繼代培養 培養液為含有 10% FBS 的 MEM，培養於 28℃恆溫培養箱。繼代培養 流程如下：培養液吸到剩約 1 ml，將細胞以細胞刮勺刮落，加入適量的培 養液輕沖底盤使細胞脫落，置於15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘 （KUBOTA 5100），去除上清液，加入適量培養液混合均勻後，取適量細胞 轉移至新的培養皿，置於培養箱培養。 3.2 登革病毒的增殖 利用白線斑蚊細胞增殖登革病毒 PL046 strain。將 1×107的C6/36 細胞 置入15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘（KUBOTA 5100），去除上 清液，以適量的10% FBS/MEM 培養液混合均勻後（使其與病毒混合後體 積為2 ml），加入 1×106的病毒，即MOI（multiplicity of infection）= 0.1， 置於37℃培養箱 2 小時，每 30 分鐘搖一次，將其移到新的 T75 的培養盤中， 加入9 ml 的 10% FBS/MEM 培養液，培養於 28℃培養箱，於感染經過六天
後，收集病毒上清液，以0.22μm 孔徑的濾膜進行過濾，最後將含有病毒 的過濾液分裝到1.5 ml 的微量離心管中，保存於-80℃。 3.3 空斑試驗 實驗的前一天先在六孔培養盤中放入 3×105 的BHK-21 細胞。隔天，細 胞約八成滿，以未含血清的MEM培養液沖洗兩次。病毒以未含血清的MEM 培養液進行序列稀釋，每一個培養孔加入 400μl序列稀釋的病毒溶液，置 於含有 5% CO2的 37℃培養箱中 1 ~ 2 小時進行感染，每半小時輕晃培養
盤。加入4 ml的 1.1% methyl cellulose medium，置入含有 5% CO2的37℃培
養箱中培養五至七天。取出細胞後，吸除培養液，加入適量2 ml的 3.7%甲
醛固定細胞，置於室溫15 分鐘，吸除甲醛，加入 2 ml的 1%結晶紫溶液，
置於室溫2 小時，以清水沖洗培養盤。置於室溫風乾後，計數空斑數目。
檢驗登革二型病毒感染性質體的部份，是將轉染經過 48、72 及 96 小
時的BHK-21 細胞，直接加入 4 ml 的 1.1% methyl cellulose medium，置入
含有 5% CO2的 37℃培養箱中培養五至七天，以結晶紫染色後，觀察是否
有空斑的生成。
3.4 BHK-21 細胞轉染
轉染前一日先於 3.5 公分培養皿置入約 3×105 的BHK-21 細胞。轉染當
天 ， 取 一 微 量 離 心 管 將 4 μ g 的 質 體 DNA 稀 釋 到 250 μ l 的 Opti-MEM
（Invitrogen, Cat. 31985-062），取另一微量離心管將 10μl的Lipofectamine™
2000（Invitrogen, Cat. 11668-019）加到 240μl的Opti-MEM，室溫靜置 5 分
鐘，將兩種液體輕輕混和均勻，室溫靜置20 分鐘，將液體均勻滴入培養盤，
放回培養箱中培養。
3.5 細胞 RNA 的萃取
利用RNeasy Mini Kit（Qiagen, Cat. 74104）完成。實驗步驟如下：BHK-21
胞刮勺將細胞刮下，再以pipetting 的方式將細胞與 Buffer RLT/β-ME 均質
化，將溶液移至QIAshredder spin column，16100×g 離心 2 分鐘（eppendorf
5415R）；濾出的液體加入350μl 的 70% ethanol，以 pipetting 的方式使其均
質化，將溶液轉置至RNeasy spin column，13400×g 離心 30 秒，加入 700μ
l 的 Buffer RW1，13400×g 離心 30 秒，加入 500μl 的 Buffer RPE，13400×g
離心30 秒，加入 500μl 的 Buffer RPE，13400×g 離心 2 分鐘，將 RNeasy spin
column 移置一乾淨的 2 ml 微量離心管，16100×g 離心 1 分鐘，再將 RNeasy
spin column 移置一乾淨的 1.5 ml 微量離心管，加入 40μl 的 DEPC-H2O 於
濾膜中心，16100×g 離心 2 分鐘。RNA 以分光光度計測量濃度及估計純度，
儲存於-80℃冰箱。
3.6 DNase I 處理
將 20μg 的 RNA 及 4 units 的 DNase I（Biolabs, Cat. M0303S），以
DEPC-H2O 稀釋於 100μl 的 1× DNase I Reaction Buffer，37℃反應 15 分鐘，
加入1μl 的 0.5 M EDTA，75℃反應 10 分鐘去除活性。加入 400μl 的 phenol/
chloroform/ isoamyl alcohol（25: 24: 1），vortex 1 分鐘，16100×g 離心 1 分鐘 （eppendorf 5415R），小心將上清液吸取至一乾淨的 1.5 ml 微量離心管。再 加入400μl 的 chloroform/ isoamyl alcohol（24: 1），vortex 30 秒，16100×g
離心 1 分鐘，小心將上清液吸取至一乾淨的 1.5 ml 微量離心管。加入 325
μl 的 100%酒精，冰上靜置 30 分鐘。在 4℃以 16100×g 離心 15 分鐘，小心
將上清液吸掉，於室溫烘乾10 分鐘。加入 22μl 的 DEPC-H2O。
3.7 反轉錄及聚合酶鏈反應
3.7.1 反轉錄
利用Invitrogen ThermoScript RT-PCR system（Cat. 11146-024）合成出
cDNA。實驗步驟如下：將 4μg 的 RNA 稀釋於 9μl 的 DEPC-H2O，加入 1
冰中；於冰上製備4μl 的 5× cDNA synthesis buffer、1μl 的 0.1 M DTT、1 μl 的 RNase OUT（40 units/μl）、1μl 的 DEPC-H2O、1μl 的 ThermoScriptTM RT（15 units/μl）；於 25℃反應 10 分鐘、55℃反應 50 分鐘、85℃反應 5 分
鐘；加入1μl 的 RNase H（2 units/μl），置於37℃反應 20 分鐘。所得 cDNA
儲存於-20℃。
3.7.2 聚合酶鏈反應
總體積為50μl，內含 2μl 的 cDNA 模板（質體為模板時，放入約 10 ~
20 ng），5μl 的 10 倍酵素緩衝液，各 1μl（10μM）的引子對，4μl（2.5 mM）
的dNTP，2.5 units 聚合酶（Protech, Cat. PTM525）。溫度設定：A. 94℃反
應5 分鐘；B. 94℃反應 30 秒；C. Annealing temperature，反應 1 分鐘；D. 72 ℃反應1 分鐘；E. 72℃反應 10 分鐘。其中，B、C、D 重覆 33 次循環。 3.8 免疫螢光染色 此處實驗條件是進行在 3.5 公分的培養皿。BHK-21 細胞轉染經過 48 小時後，以2 ml PBS 沖洗兩次，加入 2 ml 的 4% paraformaldehyde，室溫靜 置30 分鐘固定細胞，以 2 ml PBS 沖洗兩次，每次 5 分鐘，加入 2 ml 的 0.5% Triton X-100/PBS，室溫靜置 10 分鐘，2 ml PBS 沖洗兩次，每次 5 分鐘， 加入2.5 ml 的 Blocking solution，室溫靜置 1 小時，移除液體，將一級抗體
（anti-NS1 antibody, Abcam, Cat. DN2）以 1：50 的比例稀釋於 1% BSA/PBS
中，每一個培養孔加入500μl 的一級抗體，室溫靜置 1 小時，2 ml PBS 沖
洗三次，每次5 分鐘，將二級抗體（Alexa Fluor® 568 goat anti-mouse IgG
antibody, Invitrogen, Cat. A11031）用 1% BSA/PBS 稀釋成 5μg/ml，每一個
培養孔加入500μl 的二級抗體，室溫避光靜置 1 小時，2 ml PBS 沖洗三次，
每次5 分鐘，以倒立螢光顯微鏡觀察結果。
3.9 以聚合酶鏈反應製作 CP5’片段
與模板間之部分互補及部分延伸序列，延伸出所需的序列片段。CP5’片段
的製作是利用Phusion™ High-Fidelity PCR Kit（BioLabs, Cat. F-553S）所完
成，目的是在片段5’端延伸出 CMV 啟動子的序列，直至 Sac I 切位。每次
PCR 反應約有 18 bp 的互補序列及約 10 bp 的延伸序列，共延長二次。第一
次PCR 反應條件如下：總體積為 50μl，內含 30 ng 的 DNA 模板（pcDNA3-
NCS/DV2F-Q），5μl 的 10× Phusion™ HF buffer，各 1μl（10μM）的引 子對，200μmole 的 dNTP，1 units 的 Phusion™ DNA Polymerase。溫度設 定：A. 98℃反應 30 秒；B. 98℃反應 10 秒；C. Annealing temperature，反應 20 秒；D. 72℃反應 30 秒；E. 72℃反應 5 分鐘。其中，B、C、D 重覆 20 次 循環。第二次 PCR 反應時，取 2μl 前一次 PCR 反應的產物當模板，反應 條件相同。 註：CP5’片段，是指 CMV 啟動子下游即為 DV2 PL046 strain 的 5 端片段， 用以去除CMV 啟動子與登革基因之間的序列（請參照圖二及圖十五）。 3.10 大腸桿菌勝任細胞的轉形 3.10.1 大腸桿菌勝任細胞的製備 挑選大腸桿菌單一菌落培養於5 ml 的 LB 培養液，37℃震盪培養（300 rpm/min）隔夜後，取 2 ml 的菌液轉養至 50 ml 的 LB 培養液，37℃震盪培 養（300 rpm/min），直到OD600nm介於0.4 到 0.6 之間。將培養好的菌液轉移 至 50 ml 離心管，靜置於冰上 20 分鐘。在 4℃以 1620×g 離心 10 分鐘 （eppendorf 5804R），倒掉上清液，加入 25 ml 預冷至 4℃的 0.1 M CaCl2懸 浮菌體，靜置於冰上30 分鐘。在 4℃以 720×g 離心 10 分鐘，倒掉上清液， 加入5 ml 預冷至 4℃的 0.1 M CaCl2重新懸浮菌體，於4℃靜置 18 小時。隔 天，在4℃以 720×g 離心 10 分鐘，倒掉上清液，加入 5 ml 預冷至 4℃的 0.05 M CaCl2（含15% Glycerol）懸浮菌體。以每管 100μl 體積分裝至預冷的微 量離心管，儲存於-80℃冰箱。
3.10.2 勝任細胞的轉形 將儲存於-80℃的勝任細胞取出置於冰上解凍，然後加入約 0.1 ~ 0.2μg 的質體DNA，混合均勻，冰浴 30 分鐘，轉置於 42℃水浴槽進行熱休克（heat shock）反應 45 秒，加入 1 ml 的 LB 培養液，37℃（或 25℃）震盪培養 1 小時（或1.5 小時）。取100μl 的菌液均勻塗佈至含有抗生素（Ampicillin: 50 μg/ml；或 25μg/ml）的 LB 固體培養基上，37℃培養 12 ~ 18 小時（或 25 ℃培養2 ~ 3 天）。 註：含登革熱二型病毒基因序列的質體，菌體培養條件需以抗生素濃度減 半（Ampicillin: 25μg/ml）及 25℃恆溫培養。在所有實驗方法中，均以 加入底線為備註。 3.11 質體 DNA 之萃取 3.11.1 小量質體萃取
小量質體是利用Gene-SpinTM Miniprep Purification Kit（Protech, Cat. MP530XL）萃取。將單一大腸桿菌菌落培養於含抗生素（Ampicillin: 50μ g/ml；或 25μg/ml）之 5 ml 的 LB 培養液，培養於 37℃（或 25℃），12 至 16 小時（或 2 ~ 3 天）。實驗步驟如下：將菌液以轉速 2400 rpm 離心 12 分 鐘（KUBOTA 5100），去除上清液，加入 200μl 的 solution I，混合均勻並
移至微量離心管，加入200μl 的 solution II，緩和的混合均勻，靜置於室溫
5 分鐘，加入 300μl 的 solution III，緩和的混合均勻，16100×g 離心 5 分鐘 （eppendorf 5415R），將上清液轉移至 spin column，16100×g 離心 1 分鐘，
去除濾液，加入700μl 的 washing buffer，16100×g 離心 1 分鐘，去除濾液，
16100×g 離心 3 分鐘，將 spin column 移至新的微量離心管，開蓋放於 60℃
加熱板上5 分鐘，加入 30 ~ 50μl 的二次無菌水於濾膜中心，16100×g 離心
後，儲存於-20℃冰箱。
3.11.2 大量質體萃取
進行細胞轉染時，所使用的質體 DNA 是以 QIAGEN Plasmid Midi Kit （Cat. 12143）萃取，實驗步驟如下：將單一大腸桿菌菌落培養於含抗生素 （Ampicillin: 50μg/ml；或 25μg/ml）之 5 ml 的 LB 培養液，培養於 37℃
（或25℃）8 小時（或 16 ~ 24 小時）後，轉養至 25 ml（或 50 ml）的 LB
培養液，培養於37℃（或 25℃）12 至 16 小時（或 1 ~ 2 天）。將菌液轉移
至 超 高 速 離 心 管 ， 利 用 落 地 型 高 速 離 心 機 （BECKMAN, Avanti® J-E
Centrifuge, 轉子: JA 25.50）以轉速 6000×g 在 4℃離心 15 分鐘，去上清液， 加4 ml（或 8 ml）的 Buffer P1，以震盪器混合均勻，加入 4 ml（或 8 ml） 的Buffer P2，緩和的混合均勻，靜置室溫 5 分鐘；加入 4 ml（或 8 ml）預 冷至4℃的 Buffer P3，緩和的混合均勻，插入冰中靜置 15 分鐘。以轉速 20000 ×g 在 4℃離心 30 分鐘，將上清液轉移至新的超高速離心管，再次以轉速 20000×g 在 4℃離心 15 分鐘，在離心的同時，取 Qiagen-tip 並加入 4 ml 的 Buffer QBT，利用重力使加入的液體自行由底端流出。離心完成時，將上清 液轉移至經過Buffer QBT 作用後的 Qiagen-tip，等溶液完全流出後，以 10 ml 的Buffer QC 清洗 Qiagen-tip 二次，等溶液完全流出後，加入 5 ml 預熱 65 ℃的Buffer QF，收集流出的溶液至一乾淨的超高速離心管，在溶液中加入 3.5 ml 的 2-propanol，混合均勻，以轉速 15000×g 在 4℃離心 30 分鐘，去除 上清液，加入2 ml 室溫的 70%酒精，以轉速 15000×g 在 4℃離心 10 分鐘， 去除上清液，置於室溫風乾5 ~ 10 分鐘，加入 100μl 的二次無菌水，溶出 質體 DNA，以分光光度計測量濃度及純度後，儲存於-20℃冰箱。（緩衝液 配方參照附錄七） 3.12 限制酵素反應 為製備實驗所需之DNA 片段，取適量的 DNA（約 0.5 ~ 5μg）及適量 的限制酵素（1μg 的 DNA 約使用 2 units 的酵素），到適量的反應體積（10
至 50μl），於適當的溫度作用 2 小時至 3 小時。反應完成後，置於適當溫 度加熱以終止反應。反應溫度、終止反應溫度及緩衝液的濃度則依照酵素 內附之說明書使用。利用洋菜膠體電泳分析。
3.13 去磷酸反應
DNA 的去磷酸反應是利用 SAP（Shrimp Alkaline Phosphatase, Promega,
Cat. M8201）進行。實驗步驟依照內附說明書操作，反應為 1μg 的 DNA
是以 1 units 的酵素進行反應，37℃反應 15 分鐘。反應完成後，於 75℃加
熱20 分鐘終止反應，反應完後，置於冰上 2 分鐘。直接進行電泳並萃取洋
菜膠內之DNA。
3.14 萃取洋菜膠內之 DNA 片段
利用Gel Extraction Kit（PREMIER, Cat. N-DCE050），萃取出洋菜膠內
的DNA 片段。實驗過程如下：將切下之洋菜膠（≦350 mg）置於微量離心
管內，加入等量的Binding solution（如：100 mg 的洋菜膠就加入 100μl 的
Binding solution；若膠體濃度超過 2%，Binding solution 則須增加一倍），以
60℃加熱至洋菜膠完全溶解，將溶液轉移至 spin column，16100×g 離心 1
分鐘（eppendorf 5415R），去除濾液；加入700μl 的 Washing solution，16100
×g 離心 1 分鐘，去除濾液，將此步驟重覆一次；16100×g 離心 3 分鐘，將 spin column 移至新的微量離心管，置於 60℃加熱 5 分鐘，加入 30μl 的二 次無菌水，16100×g 離心 1 分鐘，所得到的溶液即含欲萃取之 DNA，以分 光光度計測量濃度及純度後，儲存於-20℃冰箱，或直接進行接合反應。
3.15 接合反應
總體積為10μl，內含 1 倍緩衝液、2.5 units 的接合酶（T4 DNA Ligase,
Fermentas, Cat. EL0014）、50 ng 的 vector 及適量的 insert（vector 與 insert
的分子數比約 1：3），置於 14℃水浴反應 16 小時，65℃去活化 10 分鐘，
3.16 生長曲線試驗 將隔夜培養的pcDNA3 質體菌液及培養兩天的 pCPR 質體菌液，由 LB 培養液稀釋至OD600nm吸光值為0.4（± 0.01）。取400μl 調整好濃度的菌液 至50 ml 的 LB 培養液，置於培養箱培養。在經過 1、2、4、6、8、10、12、 20、22 及 24 小時的時間點，測其 OD600nm吸光值，同時以適當的稀釋倍數， 分別塗盤於含有抗生素的LB 培養盤及不含抗生素的 LB 培養盤，培養後計 算生成之菌落數目。所有培養條件均為 25℃、170 rpm 及 25μg/ml 的
肆、結果 4.1 本土登革二型病毒 PL046 感染性質體序列分析 4.1.1 感染性質體 pcDNA3/DV2F-P 在 NS1 蛋白上的無義突變 根據前人賴建斈的論文描述(賴建斈, 2006, 交大碩士論文)，其將登革 二型病毒PL046 基因全長序列接合到含有 CMV 啟動子之 pcDNA3 質體後， 建構出感染性質體 pcDNA3/DV2F（原命名為 pcDNA3-NCS/DV2F，本文皆 以 pcDNA3/DV2F 表示），共有五株，命名為 pcDNA3/DV2F-P、pcDNA3/ DV2F-Q、pcDNA3/DV2F-R、pcDNA3/DV2F-S、pcDNA3/DV2F-T。進一步 將這五個感染性質體轉染至BHK-21 細胞，並以空斑試驗檢驗其感染性時， 皆無法產生空斑。其中pcDNA3/DV2F-P 的序列經定序後，發現核苷酸序列 第2512（nt2512，第 806 個胺基酸位置，位於 NS1 蛋白）的位置有一個點
突變（point mutation），使原本應為榖胺醯胺（glutamine）的 CAA 變成終
止密碼TAA，造成蛋白質轉譯的停止。 為了解另外四個感染性質體 pcDNA3/DV2F-Q、R、S、T 在 nt2512 的 位置是否也有相同的無義突變，以引子 D2F1873 進行定序，定序結果請參 照表二。結果顯示，pcDNA3/DV2F-Q、R、S、T 在 nt2512 的位置都沒有轉 變為終止密碼，但pcDNA3/DV2F-R 位於 nt2146 和 nt2147 的位置，有兩個 相連的缺失突變（deletion），會造成轉譯時的閱讀框架易位（frame shift mutation）。為確認 pcDNA3/DV2F-Q、S、T 在這部分定序結果中，有沒有 其他的無義突變（nonsense mutation）產生，將定序所得的基因序列轉換成 胺基酸序列（轉換的部份包含DNA 序列 nt2083 ~ nt2559），與資料庫之DV2 PL046 strain（AJ968413, NCBI）胺基酸序列進行比對，請參照表三。結果 顯示，pcDNA3/DV2F-Q、S、T 在此區域沒有終止密碼產生。 4.1.2 感染性質體全長定序 由引子 D2F1873 的定序結果可以發現，pcDNA3/DV2F-P 和 pcDNA3/
DV2F-R 的突變位置是不同，這說明或許可以利用剪接的方式，補齊缺失的 部位，拼湊出完整的登革病毒基因。將至今尚未發現如缺失突變或無義突 變的pcDNA3/DV2F-Q 和 pcDNA3/DV2F-S，先以不同的限制酶再次確認片 段大小都符合預期後，Ava I 作用得到 7.8、3.5、1.9、1.5 及 1.4 kb 之 DNA 片段；EcoR V 及 Pst I 作用得到 5.0、4.2、3.0、2.7、1.0 及 0.2 kb 之 DNA 片段，限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十。接續進行全長基因定 序檢查，定序使用的引子相對位置圖請參照圖三，定序結果請參照表四。 結果顯示，pcDNA3/DV2F-Q 及 pcDNA3/DV2F-S 的全長登革病毒基因序列 與資料庫之DV2 PL046 strain（AJ968413, NCBI）序列進行比對後，兩個質 體與資料庫的核苷酸相似度皆高於 99.7%，胺基酸相似度皆為 99.6%，而 pcDNA3/DV2F-Q 與 pcDNA3/DV2F-S 兩質體間的核苷酸及胺基酸相似度分 別為 99.6%及 99.3%。在所有變異之中，最直接注意到的地方是 pcDNA3/ DV2F-Q 位於 nt2820（ΔT）和 nt10449（ΔA）有缺失突變（deletion）產 生，而 pcDNA3/DV2F-S 位於 nt737（ΔG）也有一缺失突變產生，這種變
異會造成轉譯時的閱讀框架易位（frame shift mutation），進而影響表現。此 外，沒有發現其他的無義突變（nonsense mutation）產生。 4.2 感染性質體缺失突變的修正 由全長的定序結果可以發現，pcDNA3/DV2F-Q 和 pcDNA3/DV2F-S 的 缺失突變位於不同位置，因此，設計利用兩個感染性質體完善的序列部份， 以剪切、接合的方式補齊缺失的序列。實驗設計是以 pcDNA3/DV2F-Q 作 為修改對象，分別將 pcDNA3/DV2F-S 的 3’端序列片段（S2 片段, 含登革 病毒基因序列nt9508 ~ nt10723）和 NS1 附近的序列片段（S1 片段, 含登革 病毒基因序列nt1131 ~ nt7132）切出，置換 pcDNA3/DV2F-Q 的序列片段， 分別修正原先的 nt10449（ΔA）和 nt2820（ΔT），如圖四所示。而鑒於感 染性質體的不穩定性，實驗在置換 S1 片段至 pcDNA3/DV2F-Q 後，將質體
轉殖至 E.coli SURE 2 strain（Stratagene, Cat. 200152），降低可能的序列變化
4.2.1 pcDNA3/DV2F-Q/S2 質體建構
將 pcDNA3/DV2F-S 以限制酶 Nhe I 和 Xma I 處理，切出含登革病毒基
因的3’端序列 nt9508 ~ nt10723（S2）和部份載體序列，與相同限制酶處理 的pcDNA3/DV2F-Q 接合後，可得到修正 nt10449 缺失突變的質體：pcDNA3/ DV2F-Q/S2，請參照圖五。以限制酶 Ava I 作用後，得到 7.8、3.5、1.9、1.5 及1.4 kb 之 DNA 片段；以限制酶 Kpn I 作用後，得到 11、3.9 及 1.0 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十一。 定序結果請參照表五。 4.2.2 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 質體建構
將 pcDNA3/DV2F-S 以限制酶 Hpa I（blunt end）處理，切出登革病毒
基因序列nt1131 ~ nt7132（S1），pcDNA3/DV2F-Q/S2 以相同限制酶處理， 再經過SAP 去磷酸反應，片段接合後，可得到修正 nt2820 缺失突變的質體： pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1，如圖六所示。以限制酶 Ava I 作用後，得到 7.8、 3.5、1.9、1.5 及 1.4 kb 之 DNA 片段；以限制酶 Kpn I 作用後，含 S1 片段 的質體在nt6153 的位置會多一個切位，可與 pcDNA3/DV2F-Q/S2 做區別， 得到11、3.1、1.0 及 0.75 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位 置圖及電泳圖請參照圖二十二。定序結果請參照表六。 4.3 感染性質體 3’UTR 的修飾 於感染性質體 3’UTR 的下游，接合上 3’-ribozyme 序列，讓感染性質體
在細胞內表現出RNA 後，尾端會因為 ribozyme 本身的作用，將原本 3’UTR
後方多餘的序列移除，使3’UTR 的尾端保持完整。
實驗室前人杜育穎參照 Heller 等人的研究(Heller et al., 2005)，設計了
登革病毒的 3’-ribozyme，架構於 pGEM-T 載體上，請參照附錄六(杜育穎,
2007, 交大碩士論文)。原先設計是利用 3’端的單一限制酵素切位：Apa I，
將含有部份3’UTR 且下游帶有 3’-ribozyme 的序列接入感染性質體。不過，
中，含有兩個 Apa I 的切位，請參照圖七。因此，必須先將其接合至更長的
登革病毒3’端序列，使序列上游帶有單一切位：Nhe I，再利用 Nhe I 切位
接合至感染性質體。而原先感染性質體在登革基因序列的下游，有設計一 單一切位 Xba I(賴建斈, 2006, 交大碩士論文)，也因 3’-ribozyme 的序列上帶 有一 Xba I 切位，使 Xba I 切位無法利用。因此，設計將序列移至與感染性
質體相同之質體：pcDNA3，再利用載體上的單一切位：Xma I，進行剪接，
設計流程如圖八所示。之後才能順利將帶有3’-ribozyme 序列的片斷接合至
感染性質體，設計流程如圖九所示。
4.3.1 pcDNA3/prS2ApaI 質體建構
將 pcDNA3/DV2F-S 以限制酶 Eco RV 和 Apa I 處理，切出含登革病毒
基因的3’端序列 nt8762 ~ nt10547（prS2ApaI），與相同限制酶處理的pcDNA3 載體接合後，可得到質體：pcDNA3/prS2ApaI，如圖十所示。以限制酶 Ava I 作用後，得到 5.9 及 1.2 kb 之 DNA 片段；以限制酶 Eco RV + Pst I 作用後， 得到4.6 及 2.5 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及電泳 圖請參照圖二十三。 4.3.2 pcDNA3/prS2/3’Rz 質體建構 將 pGEM-T/DV2-3’Rz 以限制酶 Apa I 處理，切出含登革病毒基因的 3’ 端序列nt10548 ~ nt10723 及 3’-ribozyme 序列（prS2s/3’Rz），與相同限制酶 處理的 pcDNA3/prS2ApaI 載體接合後，可得到質體：pcDNA3/prS2/3’Rz， 如圖十一所示。以限制酶 Bsp HI 作用後，得到 4.4、2.0 及 1.0 kb 之 DNA 片段；以限制酶 Apa I 作用，含 3’-ribozyme 片段的質體在 nt2953 的位置會 多一個切位，可得到 7.2 及 0.23 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素 作用位置圖及電泳圖請參照圖二十四。由於會有正接或反接的可能，於 3’-ribozyme 上的 Xba I 又可能因為結構的影響，使限制酶 Xba I 無法作用，
或作用效果極低（請參照圖三十），因此以定序檢查序列接入的方向是否正
4.3.3 pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz 質體建構
將 pcDNA3/prS2/3’Rz 以限制酶 Nhe I 及 Xma I 處理，切出含登革病毒
基因的 3’端序列 nt 9508 ~ nt 10723、3’-ribozyme 序列及部份載體序列 （S2/3’Rz），與相同限制酶處理的 pcDNA3/DV2F-Q 載體接合後，可得到質 體：pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz，如圖十二所示。以限制酶 Ava I 作用後，得 到7.8、3.5、1.9 及兩個 1.5 kb 之 DNA 片段；以限制酶 Kpn I 作用後，得到 11、3.9 及 1.0 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及電泳 圖請參照圖二十五。定序結果請參照表八。 4.3.4 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz 質體建構 將 pcDNA3/DV2F-S 以限制酶 Hpa I 處理，切出登革病毒基因序列 nt1131 ~ nt7132（S1），與相同限制酶處理的pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz 載體 接合後，可得到質體：pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1/3’Rz，如圖十三所示。以限 制酶 Ava I 作用後，得到 7.8、3.5、1.9 及兩個 1.5 kb 之 DNA 片段；以限制 酶 Kpn I 作用後，含 S1 片段的質體在 nt6153 的位置會多一個切位，可與 pcDNA3/DV2F-Q/S2/3’Rz 做區別，得到 11、3.1、1.0 及 0.75 kb 之 DNA 片 段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十六。定序結 果請參照表九。 4.4 感染性質體 5’UTR 的修飾
以連續兩次的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction；PCR），製作出
CP5’片段後，再以片段兩端的 Sac I 切位將片段剪接至 pcDNA3，建構出 pcDNA3/CP5’質體，示意圖請參照圖十四。第一次 PCR 反應時，模板為 pcDNA3/DV2F-Q，正向引子為 CP-f1，反向引子為 CP-r；第二次 PCR 反應 時，以2μl 的第一次 PCR 反應產物為模板，正向引子為 CP-f2，反向引子 為 CP-r。由於 CP-f1 與 CP-f2 會有部分重疊序列及部分延長序列，使放大 出的登革病毒基因片段5 端延長出 CMV 啟動子序列，直到 CMV 啟動子上
pcDNA3/CP5’，依照 pcDNA3 使用手冊指示，其 CMV 啟動子轉錄起始點將 為登革基因序列的第一個核苷酸（示意圖請參照圖十五）。
之後，再利用 pcDNA3 上之單一切位 Mlu I，及引入片段帶有的單一切 位 Bst EII 處裡後，把帶有部份 CMV 啟動子序列的 CP5’片段接合至相同限 制 酶 處 理 之 感 染 性 質 體 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1 及 pcDNA3/DV2F- Q/S2/S1/3’Rz，建構出登革基因 5 端序列修正之質體 pCP 及 pCPR（修正指 的為除去登革基因上游多餘的MCS 序列和 T7 啟動子序列），示意圖請參照 圖十六。修正後的感染性質體，其CMV 啟動子之轉錄起始點將為登革基因 序列的第一個核苷酸（5’UTR 的第一個核苷酸）。如此，即可在哺乳動物細 胞中表現出5’UTR 完整的登革病毒全長基因。 4.4.1 pcDNA3/CP5’質體建構 以連續兩次聚合酶鏈反應產生的 CP5’片段，利用 Sac I 切位將片段剪接 至 pcDNA3，可得到質體：pcDNA3/CP5’，如圖十七所示。以限制酶 Pst I 作用後，得到4.2、1.8 及 0.2 kb 之 DNA 片段；5’端多餘的序列內，包含著 原先建構感染性質體pcDNA3/DV2F 所引入的 5’端 Cla I 切位，因此在移除
5’端多餘序列後，以限制酶 Ava I + Cla I 作用，預期只會得到 6.1 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十七。定序 結果請參照表十。
4.4.2 pCP 質體建構
將 pcDNA3/CP5’以限制酶 Mlu I 及 Bst EII 處理，將帶有部份 CMV 啟
動子序列的 CP5’片段切出，與相同限制酶處理的 pcDNA3/DV2F-Q/S2/S1
載體接合後，可得到質體：pCP，如圖十八所示。以限制酶 Ava I 作用後，
得到7.7、3.5、1.9、1.5 及 1.4 kb 之 DNA 片段；去除 5’端多餘序列後，在
CMV 啟動子與 5’UTR 之間會新生成一 Spe I 切位，以限制酶 Spe I 作用後，
得到11、1.7、1.2、0.72、0.64 及 0.58 kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制
