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行政院國家科學委員會專題研究計畫執行進度報告
利用蛋白質體來定性高粱胚乳澱粉粒結合性蛋白(1/3)
Char acter ization of sor ghum endosper m star ch gr anule
associated pr oteins using pr oteomics
計畫編號：NSC-
90-2313-B-002-270
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主持人：謝兆樞 執行機構及單位：台灣大學農藝學系
e-mail: [email protected]
一、中文摘要 澱粉是禾穀類種實胚乳最主要的 部分，約佔種實乾重的 65％。而在胚 乳中的粉質澱粉 (amylose) 與臘質澱 粉 (amylopectin) 的比率更是攸關種實 之食味與加工品質的重要因素。在育種 上，這種比率是育種家很注重的性狀； 在食品加工上，它對加工食品品質的影 響，例如釀酒、粉製食品等，是絕對無 法以分別外加另類澱粉﹝或純化的粉 質澱粉﹞來調整其比率所能取代的。無 論是直接供應糧食的生產者或加工業 者，總是殷切期待有特定粉質澱粉與臘 質澱粉比率的品種，因此對育種者而 言，皆亟待能經由探討種實胚乳發育時 澱粉合成途徑及其相關基因的調控，進 而能選育出各種適當粉質澱粉與臘質 澱粉比率的基因型﹝品種﹞，以因應不 同用途的需求。過去五年裡，我們也針 對可溶性澱粉合成 的活性進行探討 並選殖其 cDNA。另外，我們也針對澱 粉顆粒形成時的結合性蛋白進行定性 研究。除了我們先前所著重的 60kD 的 waxy protein（granule bound starch synthase, GBSS）及其錯意突變蛋白分 子之外，我們亦已用 RT-PCR 及 PCR 的技術定出 branching enzyme 與 soluble starch synthase 的 cDNA 序列。在未來的三年內、我們擬以基因體 (genomics) 與蛋白質體 (proteomics) 的方式研究高粱種實的澱粉生合成之 相關機制。在第一年的工作中，我們將 把高粱種實的 debranching enzyme 與 ADPG pyrophosphorylase 的 cDNA 加 以定序。如此、加上我們原來已找到的 基因（包括 granule-bound starch synthase, soluble synthease, branching enzyme），則幾將高粱種子中澱粉生合 成的關鍵酵素全部定序。這些序列資料 將可作為進行蛋白質體分析的基礎。同 時並擬用 mass spectrometry 的方法來 探討 wild type 與我們以 EMS 誘導所得 的 waxy mutant（含有 GBSS 蛋白質但 未具酵素活性）的 GBSS 蛋白是否有轉 譯後修飾 (post-translational
modification)。
Abstr act
The waxy locus of cereals determines
the amylose content in endosperm of developing grain. It encodes the starch granule-bound starch synthase (GBSS), which forms straight chain polymer amylose. The proportion of amylose and amylopectin content in cereal endosperm starch is a major determinant of cooking and industrial
2 be adjusted by adding amylose externally to the original starch. Therefore, the unique line with specific amylose content is
searching for urgently by the plant breeders. In our previous studies we had emphasized on the enzymes which are linked to this traits. We had already sequenced the cDNAs of GBSS, soluble starch synthase (SSS) and branching enzyme of sorghum grains. In this proposed work, we will further sequence the cDNAs of sorghum debranching enzyme and ADPG pyrophosphorylase. And then we will go on the studies on
post-translational modification of these starch proteins. 二、緣由與目的 澱粉是植物能量儲存及代謝的主要形 式，主要是由直鏈的粉質澱粉(amylose)及 具支鏈的臘質澱粉(amylopectin)所組成，粉 質澱粉和臘質澱粉的比例是影響種實食味 與加工品質的重要因素。高粱的種實可用 於主食、飼料、製醋與釀酒，甜高粱可製 作糖漿，有色之小穗可提製染料，用途相 當廣泛。種實內澱粉約佔乾重的 65％，而 粉質澱粉和臘質澱粉的比例更是影響食味 及釀酒品質的重要因素(Hiseh and Pi, 1979)。若能充分瞭解，在種實發育過程 中，有關澱粉生合成途徑及其相關基因的 調控，將有助於育種家選育出特定粉質澱 粉與臘質澱粉比例之品種以提供不同需 求。 本實驗以高粱 I+、I-、Mu 三品系為材 料，利用雙向電泳，接著以 75KD 澱粉分 支 、60KD 臘質蛋白及 22KD 高粱儲存 性蛋白之抗體進行西方墨點法，定出在蛋 白雙向電泳膠片上之位置。並純化出此三 個品系胚乳之澱粉粒，經 thermolysin 處 理，可去除澱粉粒表面之蛋白質，所得之 澱粉粒，經 SDS-PAGE 及雙向電泳分析 後，可得位於澱粉粒中之蛋白，並進一步 加以定序、比對分析。 三、結果與討論 高粱60KD臘質蛋白之免疫墨點轉印分析 I+及EMS-wx兩個品系，能被兔子抗高 粱臘質蛋白之抗血清所辨認，I-則無蛋白被 辨認。推測此一位置之蛋白為臘質蛋白在 雙向電泳之位置。根據前人實驗結果，臘 質蛋白在胚乳中與澱粉粒結合（林， 1991）。經themolysin處理後之澱粉粒，在 電泳膠片上，亦可見臘質蛋白，故可知臘 質蛋白與澱粉粒結合，與前人實驗吻合。 且所偵測之臘質蛋白，出現連續之6個 spots，已證實高粱只有一個臘質蛋白之基 因，故推測此一情形為蛋白經過後轉譯修 飾作用所造成，但須經更進一步之分析， 希望可知為何種作用所造成。 高梁 I+及 I-兩個品系為臘質近同源 系，兩者的差別在於 Wx protein 之有無， 根據此一特性，比較高梁 I+的雙向電泳圖 （Fig.1）與高梁 I-之雙向電泳圖（Fig.2）， 可以確定 Wx protein 之位置。根據前人實 驗結果，Wx protein 在胚乳中與澱粉粒結合 （林，1991）。Themolysin 為一種蛋白質 酵素，在澱粉粒未糊化的狀態下，它只會 分解位於澱粉粒外層之蛋白，因此經 themolysin 處理後之澱粉粒，所萃取出的蛋 白，在 SDS-PAGE 電泳膠片上所見之條帶 表示位於澱粉粒之中的蛋白。在經過 themolysin 處理之高粱 I+品系的澱粉粒，仍 保有 Wx protein 之條帶（Fig.3），故可知 Wx protein 與澱粉粒結合，受到澱粉粒之保 護，在 themolysin 作用下，不會分解，可 證明前人實驗結果。且所偵測到之 Wx protein ，出現連續之 6 個 spots，已證實高 粱只有一個臘質蛋白之基因，故推測此一 情形為蛋白經過修飾作用所造成，但須經 更進一步之分析，希望可知為何種作用所
3 造成。之後，為了了解何種修飾作用造成 連續的 spots，採用 MALDI-TOF 進行分析。 以 Ruby 染色之後，將 gel 至於 UV box 上， 找到 wx protein 用 tip 將其挖下，為確保所 挖的點不受到其他點之污染只挖了中間分 離較開，且量較多之四點，之後進行 trypsin digest，最後送至中研院生化所進行 MALDI-TOF。 高粱胚乳75KD蛋白之免疫墨點轉印分析 在三個品系中，皆能被兔子抗高粱胚 乳75KD的抗血清所辨認，辨認之結果呈現 一連串的spots，但是由於胚乳全蛋白所偵 測之訊號不強，因此需進一步使用澱粉粒 蛋白進行實驗，以得到更詳盡之資料。 高粱醇溶性蛋白Kafir in(22KD)之免疫墨 點分析 此三品系均可被兔子抗高粱22KD Kafirin的抗血清所辨識，由於此一蛋白為 種子儲存性蛋白，含量相當高，且發現其 pI值範圍相當廣。 Themolysin處理之結果 Themolysin處理之澱粉粒，經 SDS-PAGE電泳比較後，發現儲存性蛋白及 一些蛋白被分解，推測這些蛋白應位於澱 粉粒表面。將處理後的澱粉粒進行雙向電 泳，發現所得之蛋白，PI值為5～8之間， 分子量較大，將這些蛋白定序所得之資 料，與資料庫中相近物種之澱粉生合成相 關酵素加以比對，希望可以得知這些蛋白 為何。 四、計畫成果自評 ¨ 我們在此計畫中如期地進入蛋白修飾 機制的探討。預計由 MALDI-TOF 之結 果我們將可以釐清 Wx 蛋白的變化特 性。 ¨ 我們在此計畫中將利用以前所製作的 三個高梁種子蛋白的抗體，即抗 22 kD Kaferin，抗 23 kD Kaferin，與抗 75 kD 澱粉粒蛋白的抗體，加上數年前我們所 製作的抗 Waxy protein 抗體，作為我們 日後研究工作的很好 internal control； 另外兩個則是抗澱粉粒蛋白，在我們以 澱粉為主要研究對象的工作中是很重 要的必備工具。 ¨ 我們在此計畫執行期間找出了純化高 梁種子澱粉粒蛋白的方法、得以順利的 去除貯存蛋白等污染，如此將可順利進 行進一步的蛋白體學之研究。 ¨ 植物的種子與葉片中均可製造澱粉，也 有一些共同的基因表現。例如 soluble starch synthase 在種子與葉片中均有表 現，而 granule-bound starch synthase (Waxy protein)則只在種子而不在葉片 中表現。以 Western blot analysis 的結 果來看，75 kD 澱粉粒蛋白亦只在種子 才會表現，且在 10 DAP – 30 DAP 期間 均可發現。
¨ 我們目前除了有四種高梁種子蛋白的
抗體，亦有數個澱粉合成有關基因的 cDNA clones 、 包 括 granule-bound starch synthase, soluble starch synthase, branching enzyme, debranching enzyme 等。這些工具可以讓我們更快速的進行 榖粒品質分析、改善、育種等工作。 五、參考文獻 林百昌。1999。 高 粱 胚 乳 澱粉分支 的分子定性及胚乳 79KD 蛋白的 表現。台灣大學農藝學研究所 碩 士論文。 林智良。1991。蜀黍胚乳臘質基因表 現的研究：蛋白質與 RNA 層次之 探討。台灣大學農藝學研究所 碩 士論文。 陳妙如。1999。高粱胚乳可溶性澱粉 合 成 cDNA 的分子定性。台灣
4 大學農藝學研究所 碩士論文。 Granier, F. (1988) Extraction of plant
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Hsieh, J.S., and Pi, C. P. (1979) Effect of the waxy gene on grain quality
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