泰葛成分抗細胞增殖活性及葛屬植物成分定量之研究; Studies on Antiproliferative Constituents of Pueraria Mirifica And Quantative Analysis of Radix Puerariae
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(2) 有成分定量時，希望藉由分離所得各種成分去定量泰國、大陸和台灣產葛 根成分，進而瞭解三地所產葛根成分含量有何不同，並且進一步確認是否 除了泰葛以外，大陸產和台灣產葛根不含有葛雌素，為不同產地、不同種 類的葛根藥材，是否可以用於不同病症，奠定研究基礎。另外，針對泰葛 一年生的根、莖和葉進行指標成分定量，便於瞭解泰葛本身生長年數對二 次代謝產物的影響，進而對泰葛的二次代謝產物建立生長曲線初步的概 念。植物組織培養在二次代謝產物上及大量繁殖的應用，逐漸地嶄露頭 角，中藥材以組織培養活性成分，已經有相當的成績了 (19)。從培養泰葛 細胞產生活性成分為目標，為日後研究培養泰葛活性成分為基礎。 此外，大陸近代藥理研究證明，葛根中所含有效成分葛根總黃酮(大 多為異黃酮，這是豆科的特徵)能降低心肌耗氧量，增加冠狀動脈、腦血 管血流量，明顯緩解心絞痛，抗心律失常等(7)(20-21)，被醫藥界專家們認為 具有開發治療心腦血管系統疾病之新藥的良好前景。大陸以使用野葛和粉 葛為多，分析結果表明，除野葛的總黃酮成分明顯高於粉葛外，其水溶性、 醇溶性成分的含量亦明顯高於粉葛(22).本文亦針對總黃酮成分研究，將泰 葛與川葛、臺葛比較，就泰國、四川、臺灣三地進行了七種葛根的總黃酮 含量測定，期望建立一套快速且方便的含量測定方法，以便應用於鑑別製 藥產業上之產品質量優劣。同時為葛根的質量評價提供參考，篩選出品質 佳、有效成分含量高之葛屬品種。 文獻中記載葛根粗抽物有分化凋亡(23-24)及抗癌活性作用(25-26)，內含有 大豆 元 R 及染料木黃酮有細胞致毒及分化作用(7)(27)， 在大陸文獻亦提及 葛根內含抗白血病成分( 28)，因此，本研究以治療急性白血病為研究主題， 用 Human Leukemia promyelocytic cells( HL-60 cells)來做粗抽物及化合物 篩選指標，冀望能夠為開發抗白血病藥做一個初步的活性檢測，提供抗白 血病藥開發的另一個研究方向。.
(3) 第二節 葛根相關研究： 壹、 植物基原考察：(29). 被子植物門(Angiospermae) 雙子葉植物綱(Dicotyledoneae) 離辦花亞綱(Choripetalae) 薔薇目(Rosales) 豆科(Leguminosae) 蝶形花亞科(Papilionoideae) 葛根屬(Pueraria). 貳、 語源: 後述的中國產葛屬植物之各種語源說明如下： (2)(29)(30). 〝Leguminosae 〞 ，乃〝Lrqumen〞莢果之意，指本科植物之果實均為 莢果。屬名〝Pueraria〞乃為紀念瑞士 日內瓦(Geneva)之植物學家 M. N. Puerari 而命名。而種名〝calycina〞 ：calycinus 花萼宿存之意； edulis：食 用，指其塊根供食用； elegans：“優美的”，指其開花美麗； lobata：lobatus 淺裂，指其葉具淺裂； montana：montanus“野生的”； omeiensis：峨 嵋，指其產於四川 峨嵋山； peduncularis：具花梗； phaseoloides：phaseolus 獨木舟，指果實之狀似於獨木舟；thomsonii：Thomas Thomson 氏 ( 1817~1878)英國植物學者，專研究印度植物。.
(4) 參、 葛根之生藥學文獻考察. 豆科(Leguminosae)植物，分布於全世界，尤以熱帶為多。計 690 屬， 約 17600 種 (31)。大陸及台灣共約 160 屬 1300 餘種，其中入藥者計 112 屬， 約 531 種 (31)。Pueraria 屬植物全世界有約 20 種 (32)，主要分布於亞熱帶和 溫帶地區。分布於亞洲熱帶地區約 15 種，而我國所產者計 11 種。 關於葛根之生藥學研究，最早見於日本東京大學藤田直市博士於 1924 年發表於藥學雜誌之生藥解剖圖，是為嚆矢。此植物據其他文獻考 證，均指為 Pueraria hirsuta MATSUMURA。其後稻垣勳、 野 S 武亦曾就上述 Pueraria hirsuta MATSUMURA 繪製略圖於生藥學著作中。日本藥局方指出日 本產葛根為 P. lobata OHWI , 其異名為 P. pseudo –hirsuta TANG et WANG, 而 以中國產葛根為 P. lobata OHWI var chinensis (BENTHAM ) OHWI。近年來大陸 生藥學文獻分別指出 P. lobata (WILLDENOW ) OHWI 及 P. pseudo –hisuta TANG et WANG，據上述日本藥局方考訂，2 種當屬同種。(2). 肆、 葛屬植物之特徵: (2)(32) 藤本或灌木，三出複葉，小葉有時淺裂。花藍紫或紫色，腋生，總狀 花序，苞與小苞均小，心形；花萼鐘形，不等長，上面 2 片或多或少合生； 旗瓣圓形或倒卵形，有耳，基部爪狀；翼瓣長方形，其中間部分常與龍骨 瓣相連；雄蕊上部分離，中部合生，單獨分離者稀；子房幾無柄，胚珠多 數；花柱彎曲，柱頭小。莢果線形，略平。.
(5) 伍、 葛根之本草考察： (33) 葛根為本經 (33)中品，別錄、陶注(34)、新修(35)、拾遺、開寶、藥性論、 日華子、嘉祐、證類(36)(37)、救荒(38)、綱目(5)以及圖考長編 (39)並圖考(40)均 有著錄。本經首論葛根及穀，別錄復論其生根汁、葉、花之藥能，新修增 述其蔓，至開寶另立「葛根」一條件作為今附品，至綱目以葛為總名，分 述葛根、葛穀、葛花、葉、蔓等五種藥用部位之藥能，長編及圖考亦有所 論述。其本草系統如下： 本 經 ( 草部中品、葛根、葛穀 ) 別錄 ( 根、生根汁、葉、花 ). 藥對. 陶 注 ( 根、生根汁、花 ). 新 修 ( 根、穀、汁、蔓 ) 肘後方. 拾遺 專業論. 貞元廣利方 日華子 食療本草. 肘後方. 聖惠方. 梅師方. 外臺祕要. 廣利方. 千金方. 傷寒類要. 湯液本草 潔古珍珠囊 本草衍義補遺 用藥法象 本草發揮. 龐安常傷寒論 聖惠方 梅師方 肘後方 衛生易簡方 千金方. 開 寶 ( 根、粉 ). 嘉佑(根). 證 類 ( 根、粉 ) 衍 義 重 修 政 和 ( 根、粉 ) 救荒本草 綱目 精 要 嶺南雜記 ( 根、穀、花、 南越筆記 葉、蔓 ) 爾雅翼 博物志 圖 考 長 編 吳都賦 國 風. 救荒本草 周. 書. 圖 經. 圖 考. 越絕書 雒南縣志 說文解字注 周 南 南山經 廣 雅.
(6) 陸、 葛根種類： (2). (1)中國產葛屬植物計下列 11 種： P. calycina FRABCHET (黃毛萼葛) P. edulis PAMPANINI (食用葛) P. elegants WANG et TANG (麗花葛) P. lobata ( WILLDENOW ) OHWI (葛) P. Montana ( LOURRIRO) MERRILL (山葛) P. omeiensis ( TANG et WANG) (峨嵋葛) P. peduncularis (GRAHAM) (雲南葛) P. phaseoloides (ROXBURGH ) BENTHAM(三裂葉野葛) P. thomsonii (BENTHAM )(甘葛) P. wallichii DE CANDOLLE (瓦氏葛) P. alopercuroides CRAIB. (密花葛) (2)台灣產葛屬植物目前三種： P. lobata ( WILLDENOW ) OHWI (葛) P. Montana ( LOURRIRO) MERRILL (山葛) P. phaseoloides (ROXBURGH ) BENTHAM(三裂葉野葛).
(7) (3)中國產葛屬植物之檢索. (2). 1.托葉不脫落 2.托葉盾形或箭頭狀 3.托葉箭頭狀。萼齒較萼管長。 4.在最下方之萼齒具 2個小齒，萼與其他各部密被黃色長硬毛…… (1) P. calycina 黃毛萼葛 4.在最下方之萼齒不分開，苞片短於小苞片，頂端無一叢長毛…… (2) P. edulis 食用葛 3.托葉盾形 4.苞片較小苞片短，幾無長硬毛；萼長 7~8mm… (5) P. montana 山葛 4.苞片較小苞片長，頂端有一叢長硬毛，早落 5.長 8~10mm；翼瓣的耳長大於寬 6.頂端小葉菱形………. (4) P. lobata 葛. 6.頂端小葉圓形………. (6) P. omeiensis 峨嵋葛. 5.長 12~15mm；翼瓣耳短，具較耳更呈截形之小翼…… (9) P. thomsonii 甘葛 2.托葉舌狀。萼齒較萼管短；苞片稀長於花蕾。 3.子房具明顯子房柄；旗瓣矩形，無耳，漸狹或近於截形… .. (10) P. wallichii 瓦氏葛 3.子房幾無柄．旗瓣圓形，有明顯的耳。 4.龍骨瓣耳圓形．雄蕊上部部分離…… (7) P. peduncularis 雲南葛 4.龍骨瓣無…… 1. 托葉脫落……. (8) P. phaseoloides 三裂葉野葛 (3) P. elegans 麗花葛.
(8) (4)台灣產四種葛根介紹： 1.野葛 Pueraria lobata ( WILLDENOW )OHWI 產地：新竹楊梅鎮、苗栗縣銅鑼鄉、台中市、南投縣竹山鎮、嘉義縣 及屏東縣栽培。 形態：塊根肥大，重可達 30 公斤。多年生落葉大藤本，莖基部老化時 呈木質狀，全株密被黃褐色粗毛，枝圓柱形，莖蔓長達 10m，常 纏繞於其他植物攀援而上。葉大，互生，三出複葉，基部鈍形或 近圓形；頂端小葉柄較長，葉片菱狀圓形，多呈 3 淺裂，長 6.5~19cm，寬 6.5~18cm，先端急尖，具小托葉 2 枚；側生小葉 1 對，偏橢圓形或偏菱狀橢圓形，具短柄，多呈 2 波淺裂，各具小 托葉 1 枚；葉全緣或波狀緣，表面綠色，具稀疏淡黃褐色短伏毛， 有時脫落或近於無毛，背面帶白色，密生灰白色短伏毛，葉脈兩 面均突起，具稀疏淡黃褐色柔細毛；葉紙質而厚，小托葉線形， 被黃褐色柔短毛，總葉柄具淺縱溝，被淡黃褐色至黃褐色毛葉柄 基部特別膨大，長約 1~ 2cm，有時彎曲，托葉 2 枚，卵形，被 淡黃褐色至黃褐色短葉毛，基部為盾狀。10~11 月開花，總狀花 序，穗狀圓筒形，腋生，每節著生 2~3 朵，具短梗，總花梗被稀 疏黃褐色絨毛，長 21~ 40 cm，總苞片 2 枚，狹披針形，具淡黃 褐色短絨毛，小苞片長橢圓狀披針狀，具淡黃褐色短絨毛，早落 性；花萼基部紫色，先端淡褐綠色，短鐘形，裂片 4 枚，大小不 等長，最下 1 枚最長，卵形，上面 1 枚最大，廣卵形，另 2 枚幾 相等，邊緣及外面均有淡黃褐色短絨毛，內面具稀疏灰白色短絨 毛；花冠紫紅色或紫色，蝶形，長 2~3cm，旗瓣近圓形，長 1.9~2.4cm，寬 2~2.3cm，先端凹形，近基部中央處有淡黃色或黃 色卵形斑紋，基部兩端耳垂狀，微翹；翼瓣狹橢圓形，呈 2 波淺 裂，有明顯之稜狀突起，長 1.5~2.1cm，，寬 0.7~1.1cm，基部爪 狀，僅一邊之基部有耳；龍骨瓣較翼瓣長，長 1.9~2.1cm，寬 1~1.3cm，亦僅一邊之基部有耳，於近耳處呈狀突起；雄蕊 10 枚， 成束，兩體雄蕊(9+1)，不等長，先端彎；子房線形，花柱先端 彎曲，並急細尖，密被毛，柱頭圓形。.
(9) 2.山葛 Pueraria montana ( LOURRIRO )MERRILL 產地：全省平野及至中海拔叢林及森林，並分佈於中國大陸、琉球。 形態：藤本。莖圓形或扁形，橢圓形，全株密被黃褐色粗毛，藤長達 10m 以上。葉互生，三出複葉，全緣或波狀緣，基部鈍形或近圓 形；頂生小葉柄較長，小葉菱狀卵形或卵狀披形，長 10~8cm， 寬 6.2 ~3.4cm，先端漸尖形，全緣，具小托葉 2 枚；線形；兩側 小葉歪斜，偏卵形，具短柄，各具小托葉 1 枚，較中央小葉之小 托葉為大；表面具稀疏淡黃褐色短伏毛，有時脫落或近於無毛， 背面帶白色，密生灰白色短伏毛，葉脈兩面均隆起，具稀疏淡黃 褐色~黃褐色柔細毛；葉紙質，小托葉線狀披針形，被黃褐色柔 短毛，細葉柄具淺縱溝，被淡黃色至黃褐毛，基部膨大，長約 0.5~ 1.5cm，托葉 2 枚，披針形，長約 1cm；被淡黃色至黃色褐 色柔短毛，基部為盾狀。5~11 月開花，總狀花序，腋生，每節 著生 2~3 朵，具短梗，細花梗被稀疏黃褐色絨毛，長 10.5~ 65 cm， 苞片 2 枚，長橢圓形針形，具淡黃褐色短絨毛，小苞片卵形， 具淡黃褐色短絨毛，早落性；苞較小苞為短；花萼短鐘形，裂片 5 枚，大小不等長，最下一裂片最長，長橢圓披針形，上面裂片 最大，廣卵形，另 2 裂片等長，邊緣及外面均有淡黃褐色短絨毛， 內面具稀疏淡黃色短絨毛；蝶形花冠，粉紅色或淡紫色，長 1.3~1.6cm，旗瓣近圓形，長 1.1~1.2cm，寬 1.0~1.2mm，先端凹 形，基部中央具黃色卵形斑，基部兩端耳狀，微翹；翼瓣狹橢圓 形，長約 1. 3cm，寬 2~3.5cm，基部爪狀，上端兩側展開耳形； 翼瓣較龍骨瓣長，龍骨瓣長約 1.2cm，寬 2.5~3.5cm，僅一邊之 基部有耳，於近基部處另有一塊耳垂突起；兩體雄蕊 10 枚(9+1)， 不等長，先端彎；子房線形，花柱先端彎曲，並急細尖，密被毛， 柱頭圓形，7~3 月結果，莢果線狀長橢圓形，扁平，長 1.3~5cm， 外密被褐色剛毛。.
(10) 3.三裂葉野葛 Pueraria phaseoloides ( ROXBURGH ) BENTHAM 產地：台中縣石岡鄉、彰化縣田中、台北、楊梅、南投、雲林、斗六、 高雄、屏東、台東。 形態：小藤本。莖細長，葡蔔地上，長 2~4m，藤長達 10m 以上，全 株密被黃褐色長粗毛。葉互生，三出複葉，基部鈍形或近圓形， 先端短尖形 ；頂生小葉，柄較長，葉片長 6~10cm，寬 4.5~9cm， 菱狀圓形，2 深裂，小托葉 2 枚；側生小葉 1 對，具短柄，斜 廣卵形，2 裂，外側較深，內側較淺，各具小托葉 1 枚；葉片 全緣或波狀緣，上面綠色，具稀疏淡褐色長毛，葉背面灰白色， 密被灰白色長毛，葉脈兩面隆起，均被淡黃褐色毛；表面脈上 毛較稀疏，葉背脈上毛則密生；小托葉線形，被黃褐色柔長毛， 總葉柄密被黃褐粗毛，托葉 2 枚，為長橢圓狀披針形被淡黃褐 色毛，由夏至冬開花，總狀花序，花排列疏鬆，腋生，具分枝， 每節著生 3~5 朵，僅 1~2 朵結果，具短梗，總花梗中部以上有 花，密被淡黃褐色毛，長 5.5~ 15.5 cm，總苞片 2 枚，長橢圓 形狀針形，具淡黃色長絨毛，小苞片為長橢圓狀披針形，具淡 黃褐色短絨毛；花萼極小，鐘形，裂片 4 枚，大小不等長，最 下 1 裂片最長，呈長橢圓形狀披針形，上面裂片最大，呈廣卵 形，紫褐色，餘者 3 裂片為褐綠色，其間 2 裂片近相類等，邊 緣及外面均被淡黃褐色毛；花冠帶紫綠色，蝶形，長 0.8~1.7cm， 旗瓣近圓形，倒心形，長約 1.4cm，寬約 1.3cm，先端凹形，近 基部中央呈紫色，兩旁則為黃緣色，基部小片狀，直立的附屬 體及 2 枚耳垂，微翹；翼瓣狹橢圓形，長約 1.5cm，，寬約 0.5cm， 基部爪狀，但僅一邊之基部具圓而闊的耳，且有一耳狀長爪； 龍骨瓣和翼瓣幾等長，僅一邊基部有耳，有時呈獨木舟狀，基 部截形，有爪，兩體雄蕊 10 枚(9+1)，不等長；子房線形，花 柱先端彎曲，密被毛，柱頭圓形，由秋至冬結果，莢果圓柱狀 線形，獨木舟狀，扁平，長 4.5~8.5cm，寬 0.2~0.4cm，密被黃 褐色伏毛，果瓣薄革質，開裂後扭曲；種子長橢圓形，兩端截 形，長約 4mm，寬及厚均約 2mm，種臍長約 2.5mm.
(11) (4)一般藥用葛根以 P. lobata (WILLDENOW ) OHWI 及 P. thomsonii BENTHAM 為 主： 甘葛 Pueraria thomsonii BENTHAM 產地：我國西南及華南各省；分佈於越南、印度、東部喜馬拉雅山。 形態：大藤本。莖被稀生黃色展開之長硬毛和黃色近於平貼之短柔毛。 小葉 3 枚，3 裂，頂生小葉常卵菱形，先端漸尖形，基部闊楔形 或近於圓形，長 14~21cm，寬 12~18.5cm，兩側 2 個小葉斜闊卵 形，先端漸尖形，基部截形，長 14~21cm，寬 10~16.5cm；葉片 表面綠色，背面蒼白色，兩面均被密而色黃長硬毛；葉苪柄和小 葉柄亦被黃毛；托葉宿存，中部著生，針狀長橢圓形，具毛。9 月開花，總狀花序，腋生，著生十餘朵乃至多數花，長(不含總 花梗)7~32cm，總花梗亦被黃毛，花具短梗，常 3 朵聚生，苞片 早落，小苞片卵形或卵披針形。除偶被短硬毛外，尚有黃色長硬 毛；萼外面被黃色長硬毛，內面被黃色短毛，萼齒矩形，向頂端 漸狹，最下方一個萼齒較萼管稍長或長於萼管近 1 倍；花冠紫藍 色，長約 1.3cm，旗瓣闊卵形，先端 2 裂，基部有 2 耳及胼胝體 2 枚，突起小圓球狀，長(爪除外)約 2cm，寬約 1.5cm，爪長約 5mm，翼瓣一邊有耳，另一邊僅具有之痕跡，龍骨瓣之耳近於截 形。莢果長橢圓形，長達 10~12(13)cm，寬 1cm ( 9~12mm)，扁 平，直，密被黃褐色長硬毛；種子 8~12 枚褐色，腎形或圓形。.
(12) (6) 一般當作食品用葛根：食用葛、三裂葉野葛、峨眉葛 食用葛 Pueraria edulis PAMPANINI 產地：廣西、雲南、四川。 形態：藤本。塊根肥厚，莖被稀少黃色長硬毛。小葉 3 枚，頂端 1 枚小葉卵形，先端短漸尖形，基部闊楔形或圓形，3 裂，長 9 ∼15mm，寬 6∼10mm，兩側 2 枚斜卵形，先端短漸尖形，基 部截形或圓形，2 裂，長 8.5~13mm，寬 5~8.5mm，兩面稀被 黃色長硬毛；小葉柄密被長硬毛；葉柄被很稀少的黃色長硬 毛；托葉箭頭狀，長約 1cm；小托葉披針形。總狀花序腋生， 不分枝，長 6~9cm，(不含總花梗)；在上部的苞片脫落，下部 者不脫落，卵形，無毛；小苞片卵形無毛，有時頂端被稀長 硬毛，長約 4cm；花梗瘦細，無毛。9 月上旬開花，紫色，長 15~17cm；萼鐘狀，外面無毛，裏面被短硬毛，邊緣被緣毛， 萼齒矩形，急尖形，萼齒 5 裂，在最上面一片近於卵形，先 端圓形，下面 3 枚披針形，萼與萼筒等長或稍長；旗瓣近於 圓形，先端亦呈圓形，微缺，基部具兩耳，有爪，長不連爪 約 15mm，寬約 13mm，爪長約 3.5mm，雄蕊一組；子房被短 硬毛，殆無子房柄，基部具腺體。莢果帶形，稀被黃色長硬 毛，有網脈，乾時黑色，長 5.5~6.5mm，寬約 1mm。.
(13) 柒、 葛根化學成分考察： (7) (1)Isoflavones： R3 R2O. O R4 R1. O OR5. Seq. Compound. R1. R2. R3. R4. R5. 1 Puerarin. H. H. glc. H. H. 2 Puerarin-O-xyloside. H. glc-xyl. H. H. H. 3 Puerarin-xyloside. H. H. glc→6xyl. H. H. 4 Puerarin 4′-O-glucoside. H. H. glc. H. glc. 5 3′-hydroxyl-puerarin. H. H. glc. OH. H. 6 3′-methoxy-puerarin. H. H. glc. OMe. H. 7 Daidzin. H. glc. H. H. H. 8 Daidzein. H. H. H. H. H. 9 Daidzein 8-C-apiosyl-（1-6）glucoside. H. H. glc→6api. H. H. 10 Daidzein 4′,7′-diglucoside. H. glc. H. H. glc. 11 Genistin. OH. glc. H. H. H. 12 Genistein. OH. H. H. H. H. 13 Genistein 8-C glucoside. OH. H. glc. H. H. 14 Genistein 8-C-apiosyl（1-6）glucoside OH. H. glc→6api. H. H. 15 Formononetin. H. H. H. H. Me. 16 Formononetin-7-glucoside. H. glc. H. H. H.
(14) (2)Coumestrol: OH. OH. O. O. O. O H3C. O. O. OH. OH H3C. Coumestrol. CH3. Puerarol. (3)Chalcone:. OH. OH OH. O. Isoliquiritigenin. (4)Pterocarpan:. HO. O OH H O O. (+)-Tuberosin.
(15) (5)Triterpenoids: OH OH. OH. HO. HO. Sophoradiol. Cantoniensistriol. OH. HO. OH. HO. CH2 O H. C H2O H Soyasapogenol B. Soyasapogenol A. COOH. CH2O H. OH. OH. OH. OH. HO. HO. CH2O H. CH2O H. Kudzusapogenol B. Kudzsapogenol A. O. OH. O. H. HO CH2O H Kudzusapogenol C. HO OH Kudzusapogenol B methyl ester.
(16) (6)Others: MeO. HO OH OH. HO. O. O. O. Me. O. O. OO. O. OH. OH OH OH. OH. O. O. OH. OH. O. HO O. OH OH. OH. Pueroside A. OH. Pueroside B. COOH OH OH. MeO COOH. OH. O. HO. O. OH. CH2 OH. O. OO. OH CH2OH O OH O. OH O OH. OH. OH. Pueroside C. O. OH. O. Me. Kudzusaponin B 1 OH OH. O. HO. Lupenone. ß- sitosterol. O NH. O. NH. H2 NCONH. N H. Allantoin. O. NH O. 5-methylhydrantoin.
(17) OH HO. H. HO. H. H. OH. H. OH. Me3 N+CH2 CH2OAc Acetylcholine (+). OH. D-mannitol. 捌、 藥理考察： 綜合近代葛根的藥理研究結果，計有下列各種作用(41-43)： （1）解熱作用：葛根之水抽出液對人工發熱家兔有解熱作用。 （2）鎮痙作用：由小白鼠的腸管實驗，葛根成分 daidzein 有類似鎮 痙作用，其效果為 papaverine 之 1/3，但其配醣體 daidzin 則無 此作用。 （3）卵胞荷爾蒙作用：daidzein，genistein 和 formononetin 有卵胞荷 爾蒙作用，但比標準品 diethylstilbesterol 弱。 （4）擴張冠狀動脈作用：葛根所含異黃酮素可擴張冠狀動脈血管， 降低血管血流阻力。 （5）降血壓作用：Puerarin 有非常強的降血壓作用 （6）增加腦血流量作用：在麻醉狗之頸動脈注射葛根黃酮素， 發現有增加腦血流量、減少血管阻力的現象，可應用於改善高 血壓患者之血流量。 （7）其他：動物實驗顯示葛根能使血糖濃度先上升後下降。.
(18) 玖、 葛根指標成分的定量法考察： 年代. 研究者. 1984. Hayakawa 等人 (44). 研究內容 利用 TLC 與 HPLC 方法，定量葛根中的 puerarin，daidzin 和 daidzein 三個成分. 1985. Zhao 等人(44). 以 TLC 方法定量 puerarin 和 daidzein 二成分，並比較不 同產地之含量. 1985 1987. Kinjo 等人 (45). 分離出七個野葛所含的 oleanene-sapogenols 成分. Okamoto 等人 (46) 以 TLC 來定量 puerarin 及 daidzin. 1987. Kinjo 等人 (47). 1988. Ohshima 等人 (48). 分析野葛中十五個成分 以 ODS 管柱分析七個 isoflavones 成分含量（但其解析度 不佳）. 1993. Zhong 等人 (49). 以 HPLC 測量隨著季節不同的 puerarin 含量變化狀況，發 現在八月份有最高的含量，約為十月份的九倍. 1993. Wen 等人 (50)). 利用 HPLC 定量分析葛根和其相關方劑中 puerarin 的含量 離子四級正庚基溴化銨(tetra-n-heptylammonium bromide). 1993. Yasuda 等人 (51). 來配對的離子對層析定量葛根中的 puerarin，daidzin 和 daidzein. 1997. Hirakura 等人 (52) 分離出數個 isoflavones，並以 NMR 確定成分 以毛細管電泳之 CZE 模式，定量葛根中的 puerarin，. 1998. Wang 等人 (53). daidzin，daidzein，genistein 和 biochanin A 等五個成分， 並分析市售商品之含量. 1998. Rong 等人(54). 以 LC-MS 確認葛根中的十五個成分，其 LC 部分用兩個 分析條件 開發 HPLC 及 CE 方法，來定量 puerarin，daidzin，. 2000. 黃明星等人 (55). 6,7-dimethoxycoumarin，daidzein，genistein ，formononetin 和 biochanin A 等七個成分，並完成粉葛及野葛之基原鑑 定.
(19) HPLC 為目前分析方法中最簡單便利且經濟的方法，不但操作簡便、 分離效果佳、再現性良好且定量準確。因此本實驗採用 HPLC 來進行葛 屬植物中成分 miroestrol 、puerarin、daidzin、daidzein、genistin、genistein 之分析。. 第三節 泰葛相關研究： 壹、Pueraria mirifica 基原歷史沿革： 大約在七十年前，泰國北部清邁(Chiengmei)當地盛傳一種著名球根 植物，名字叫 Kwao Keur，別名有 Guao Krua、Kwwao Khaao、Kwao Khua 和 Paukse，可以讓老人重新恢復青春，充滿活力。西元 1960 年，著名文 獻 Nature 內有一段描述這神奇植物 (10)，民間傳說有一個人長期服用此植 物，活到 280 歲。在當地，謠傳有一老婦人服此藥後，原本停經的情況消 失，月經又再產生；一性無能老人，竟然也老來得子。消息散播開來後， 此種植物變成當地炙手可熱的天然產品，後來，一個未經證實的消息，敘 述它會致命，導致它又迅速地沒落了。 (9) 至 1932 年，Dr. Kerr 認為 Pueraria mirifica 是 Butea superba (56)，1933 年 Wint 以相同題材再度提出相同觀點，這篇論文引起了全世界的熱烈迴 響 (57)。事實上，早期 Kwao 這個名字在泰國北部是指 Tong Kwao ( Butea frondosa)及 Kwao Keur ( Keur 指 climber，Butea superba)。Dr. Kerr 因為看 到 Kwao Keur 的塊根及葉片像 Butea superba，所以，一直認為是同一種 植物。 後來，許多天然物學家提出疑問，在其他國家並沒有發現 Butea superba 的塊根。因此，開始著手進行調查，發現在泰國其他地方的 Butea superba 也沒有塊根。接著，更大規模的調查開始進行，經過研究所有叫 做或用於醫藥的 Kwao 有關植物，排除了 Butea superba 的可能，也導致 許多錯誤別名的產生。這種現象也許就可以解釋以前死亡案例的產生。.
(20) 直到 1946 年，泰國葛被確認，發現葉片的確很像 Butea superba，但 是又沒有發現花。因此，只有把根及塊莖送去曼谷做實驗研究，研究結果 顯示內含物質與 1939 年 Mr. Vanijvatana 在 Thai. Science Bulletin 發表論文 所提內容相符(58)，相同情況也在 1941 年 Dr. Ketsusinh 及 Dr. Sukhavachana 在 Journal of the Medical Association(10)所發表的論文相呼應。由此可見， 的確在以前是 Butea superba 的名字冠在泰葛上，而以前就已經以泰國葛 在做研究了。 終於，1947 年二月採集到了泰國葛的花，在 Royal Botanic of Kew 的 鑑定下，確定為葛根屬新種。從此，拋棄了 Butea superba 的包袱，擁有 〝Pueraria mirifica〞的學名(9)。. 貳、泰葛植物基原及混用植物(Butea superba)辨別 (1)植物基原: (28). 被子植物門(Angiospermae) 雙子葉植物綱(Dicotyledoneae) 離辦花亞綱(Choripetalae) 薔薇目(Rosales) 豆科(Leguminosae) 蝶形花亞科(Papilionoideae) 葛根屬(Pueraria) 泰葛(Pueraria mirifica).
(21) (2)Pueraria mirifica 與 Butea superba 之比較：. (59). ＃Pueraria mirifica:木本藤蔓植物，根的上頭為塊根 1. 別名：Guao Krua、Kwwao Khaao、Kwao Khua、Paukse、白高戈 2. 葉子 :呈羽毛狀並有三片複葉，有托葉，端葉為長菱形、兩片側葉為楠 圓形，葉端尖、膜狀組織及軟毛平覆於葉面。 3. 花 :很小，長約為 0.8 公分、寬約為 O.2 公分，花色為紫藍色，呈長形 綿密的花球狀，苞片及吹苞型小、易脫落，花尊為鐘形狀，並有不平 均的裂片。. 4. 塊根 :近似圓形或楠圓形，生長成一個或是連續三至四個(呈念珠狀)， 大小不同，從很小的到直徑約 20 公分的都有，果肉呈白色，含有澱粉 質，同時其內腔含有白色汁液、微凹形。. ＃Butea superba:木本攀緣植物，根的上頭為塊莖。. 1. 別名：Guao Daeng、紅高戈 2. 葉子 :呈羽毛狀並有三片複葉，質地大而厚，擁有軟硬實的中脈，葉端 常為微凹形的，端葉較兩月側葉大。. 3. 根 :呈尖細管狀，表層皮間有黏稠的血紅色物質，內層纖維質部分為淺 黃色，含有纖維質、澱粉質，若將其切開，則切面會立刻變成棕色。.
(22) 參、泰葛藥理藥效活性 Organ Extract Route Leaf. Dose. Effect. Ref.. Mouse(Infant) Female Human adult Female. Estrogenic effect(weak). 15. Mammary gland expansion. 59 15. 95% EtOH Hot H2 O. S. C.. -. Oral. -. Stem 95% EtOH. S. C.. -. Mouse(Infant) Female. Estrogenic effect(weak). Root Plant Tuber Plant. Oral Oral. -. Male Man Female. Aphrodisiac effect 60 1.Rejuvator 10 2.not be taken by young people 3.Folklore claim that a man using this plant lived to 280 years of age.. Hot H2 O. Oral. -. Human adult Female. Mammary gland expansion. Root ext.. Gastric 50mg/Ratl Intubation QD. Root ext.. 59 61. Gastric 50mg/Rat Intubation QD. Rat(Mid-pregna Abortifiacient effect(Active) ncy,Day12-18) No effect on le ngth of gestation and duration of fetal explusion Rat(Late Abortifiacient effect(Inactive) pregnancy). Root ext.. Gastric 50mg/Rat Intubation QD. Rat(Late pregnancy). 62. Hot H2 O. Gastric 100mg/g Intubation. Rat Male. Root ext.. In Ration 5-7% of diet. Root ext.. Gastric Intubation. Abortifiacient effect(Inactive). Antiferlity effect(Active) Only male rats- high dose of ext. Female rats after mating: ↓number,size of implantations ↑gestation length ↓duration of fetal explusion Quail(Japanese) Antiferlity effect(Active) Male ↓weight of testis ↓size of seminiferous tubules, immature sertoli cells,leydig cells. 63. Rat(pregnant) Antiimplantation effect(Active) Dosing on days 1-10. 62. 64.
(23) Root ext.. Gastric Intubation. Rat(pregnant) Antiimplantation effect(Active) Dosing during zygote transport period. Root ext.. Gastric Intubation. Root ext.. In rotation 5-7% of diet. Rat(pregnant) Antiimplantation effect(Inactive) dosing during implantation period Quail(Japanese) Anspermatogenic effect(Active) Male Effect was observed at 30th day. Root ext.. In rotation 5.10% of diet Quail(Japanese) Cholesterol inhibition(Active) Male,Female Later stage,greater effect in Female. 65. Root ext.. Gastric 1.0 mg Intubation. 95% EtOH. S.C.. -. 95% EtOH. S.C.. 95% EtOH 95% EtOH.. 64. Rat(immature ovariectomizedr at) Female Dog Female. Esgtrogenic effect(Inactive) Potency was about 0.52~0.75μg ethinylestradial. 62. Estrogenic effect(Active). 60. -. Rat(Castrate) Female. Estrogenic effect(Active). S.C.. -. Estrogenic effect(Active). 15. S.C.. -. Mouse(Infant) Female Mouse(Infant) Female. Estrogenic effect(Active). 14. 95% EtOH. S.C.. -. Dog Female. Estrogenic effect(Active). 60. Root ext. Root ext.. In rotation 5.10% of diet Quail(Japanese) Male,Female In rotation 5.10% of diet Quail(Japanese) Male,Female. Hypercalcemic effect(Active) Later stage,greater effect in Female ↓Plasma protein conc. (Active) Later stage,greater effect in Female. 65. Root ext.. Gastric 100mg/g Intubation TID,14 days. Rat Male. Spermicidal effect(Active) ↓number,motility of sperm. 63. 95% EtOH. S.C.. Rat(Gonadecto mized,Gonadoparathyroidecto mized) Female,Male. Calcinogenic effect(Active) 60 ↑Calcium conc. of serum ↓width of epiphyseal cartilage of the proximals end of the tibia. 11.32mg/Rat QD 22~37 days old –51~56 days old.
(24) 肆、泰葛化學成分考察： 1.Oxygen heterocycles Compound. Structure H OH H CH 3 12 H 18 OH 21CH3 11 19 13 17 H H H 1 14 10 9 H 15 16 H 8 OH O 20. (+)-Miroestrol C20 H22O6 Mw = 358 Yield = 2×10-3 %. Effect. 2 3. OH. 5. (+)-Deoxymiroestrol. H. CH3 21CH3 11 H H 1 10. 2. 9. 12. OH H 18 H. Potent Estrogenic effect. 67. 17. H. 14. H 8. OH. 13. 19. 15. 16. H. H. O. 3 5. OH. (+)-Isomiroestrol. 7. O. 4. －. 20. C20 H22O6 Mw = 358. Yield = 1.9×10-3 %. 10~17 66 67. 6. 20. C20 H22O5 Mw = 358. Yield = 2×10-3 %. Potent Estrogenic effect. 7. O. 4. Ref.. H OH H 18 CH3 12 H OH 21CH3 11 19 13 17 H H 1 H 14 10 H 15 9 16 H 8 OH O. 2 3. 5. OH. O. 4. 7. H. 6. 2. Isoflavones Daidzein C15 H10O4 Mw = 254.242 Yield = 4.616×10-2 %. RO. 8 7. O1. 6 5. Daidzin C20 H21O9 Mw = 416 Yield = 1.259×10-3 %. 4 O. 2. 3. 1'. 2' 3'. 6' 5'. R. Daizein. Daidzin. H. Glu. 4'. OH. Antiinflammatory Antileukemic Estrogenic Lipase-Inhibitor Antiosteoporotic Antioxidant Antidipsomanic Antioxidant Antispasmodic Cancer-Preventive Estrogenic. 61 62 65.
(25) Genistein. Antioxidant. C15 H10O5 Mw = 270.241 Yield= 6×10-5 %. Antiaggregant Antiinflammatory Antileukemic. 61 62 .. Anticancer 8. RO. O1. 7. Cytotoxic 2. Lipase-Inhibitor 2'. 6 4 OH. 1'. 3. O. 3'. 6'. Uterotrophic. 4' OH. 5'. Genistein Genistin R. Genistin. Glu. H. C21 H20O10 Mw = 432. Kwakhurin. 5''. 4''. Antioxidant Estrogenic Fungicide. 62 66. －. 65 67. －. 67.. Estrogenic. 61 62 67 68 69. 3''. C21 H20O6 Mw = 368.385 2.3×10-3 % Yield = 7.6×10-4 %. OH. O. 2'' 1'' OCH 3. O OH. OH. Kwakhurin hydrate C21 H22O7 Mw = 386.401. OH. OH. O. 2'' 1'' OCH3. O OH. Mirificin C26 H28O13 Mw= 548.99 Yield = 1.61×10-3 % 6×10-3 % 2.96×10-3 %. OH. Glu-6"-Api OH. 8. 7. 1 O. 2 3. 6. 1'. 4. 5 O. 2' 3' 4'. 6'. OH.
(26) Puerarin C21 H20O9 Mw = 416 Yield = 2×10-2 % 6.41×10-3 %. Antiadrenergic. Glu 1 O. 8. OH 7. Antiischemic. 2. Antimyocarditis. 2'. 3. 6. 1'. 3'. 4. 5. 4'. O. 6'. OH. 5'. Puerarin-6”-monoa cetate. Glu-6"-OAc OH. C21 H20O9 Mw = 458.384. 1 O. 8. 7. －. 67.. Antistaphylococcic Antitubercular Fungicide Pesticide. 63. Estrogenic (MCF-7 cell line). 61. 2 3. 6. 2'. 1'. 3'. 4. 5. Hypoglycemic Antihypertensive. 61 62 67 68 69. 4'. O. 6'. OH. 5'. (3)Petrocarpan (+)-Tuberosin. OH. O. C20 H18O5 Mw= 338.359 Yield = 1.58×10-3 %. Puemiricarpane (new) C21 H20O5 Mw = 352.1231 Yield = 1.79×10-3 %. OH H O O. OH. 3. 4. 5 O. 6 7. 2. 8. OCH3. 1 O 11. 9 10. OH.
(27) (4)Coumestan. Coumestrol. OH. C15 H8 O5 Mw = 268.21 Yield = 6.8×10-5 %. 4 3. O. 6. O 7. 2. 8. 1 O 10. Mirificoumestan C21 H18O6 Mw = 366.370. 9. 5'. Antilipedemic Uterotrophic Antiosteoporotic;. 62 66. －. 66.. －. 66.. －. 66.. OH. 4' 3'. OH. O. O. 2' 1' OCH3. O OH. Mirificoumestan hydrate. OH 3' OH. O. O. 2' 1'. C21 H20O7 Mw= 384.385. OCH3 O OH. Mirificoumestan glycerol. OH 3' OH. O. O 1'. C21 H20O8 Mw = 400.384. 2'. OH OCH3. O OH.
(28) (4)Phytosterol. β-sitosterol. 20. 22. C29 H50O Mw = 414. 1 2. OH. 19 11 9. 24. 3. 27. 16 15. 14. 7. 5 4. 25. 17 13. 8. 10. 26. 23. 18 12. 6. Stigmasterol 20. 22. 23. 18 12 1 2. OH. 3. 19 11 9 10. 26 24. 25. 17 13. 8. －. 29. 28 21. C29 H48O Mw=412. －. 29. 28 21. 14. 16. 27. 15. 7. 5 6. Sucrose. 3%. 52. 特有成分 Miroestrol: 1. 強效的雌性激素作用: (15-19) 1-1 促進子官生長的效價 ＊Miroestrol (i.p.) = miroestrol (s.c.) = stilboestrol (i.p.)= osetradiol-17ß (i.p.) ＊stilboestrol (s.c.) = osetradiol-17ß (s.c.) > oestriol (i.p.) = oestriol (s.c.) 1-2 促進子官內膜產生液體的效價 ＊Miroestrol (i.p.) = miroestrol (s.c.) = stilboestrol (i.p.) = stilboestrol (s.c.) > osetradiol-17ß (i.p.) = osetradiol-17ß (s.c.) > oestriol (i.p.) = oestriol (s.c.). 1-3 促進陰道增生的效價 ＊Stilboestrol (i.p.) > miroestrol (i.p.) = miroestrol (s.c.) >stilboestrol (s.c.) = osetradiol-17ß (i.p.) = osetradiol-17ß (s.c.) = oestriol (i.p.) > oestriol (s.c.).
(29) 2.作用與用途:(16-19) 1. 雌激素作用：具有很強的雌激素作用。小鼠試驗其活性為 17β-雌二 醇的 1.3 倍。小鼠皮下注射，強度與 17β-雌二醇相等，為雌性酮的 2.2 倍。大鼠皮下注射，導管試驗活性為 17β-雌二醇的 70%，陰道角化活 性為 25%。小鼠口服，子官生長活性為己烯雌酚的三倍。大鼠口服陰 道角化活性強度為己烯雌酚的三分之二。 2. 臨床觀察：10 例閉經如人工絕經婦女每天給藥 5mg 和 1mg，均產生 明顯的雌激素作用，撤藥後很少產生出血現象，毒副作用較小。. 第四節 白血病及藥理活性試驗簡介 Leukemia（白血病，又稱作血癌） ，是一種常見的血液癌病變，一 般臨床上常見白血病的特徵為血球形成過程中一種或多種未成熟血球細 胞無法正常分化並持續增生這些不正常的血球細胞，導致造血組織異常增 生，浸潤身體各大組織，造成各器官功能失調，由於成熟白血球劇減而易 受感染，並且產生發燒、畏寒及其他類似流行性感冒的症狀；紅血球減少 而容易出現貧血，臉色蒼白、覺得疲倦、虛弱、沒有食慾而體重減輕；血 小板量不足而容易造成出血、瘀青、牙齦腫脹等現象，除此之外，尚有脾 臟腫大、骨頭或關節疼痛、個體活動力降低等病症出現。 而白血病屬於血液癌症的的一種，癌細胞的形成，主要是外來致癌性 因子刺激或內生性的基因突變，使生物體內細胞的生長、分化、增殖，自 然凋亡的生命週期調控出現不平衡，導致細胞不正常的增生與細胞分化能 力降低或喪失，進而細胞恣意成長且四處轉移，形成癌細胞。而其中細胞 不正常增生的原因，可能與細胞週期運行異常及細胞凋亡途徑發生改變有 關。.
(30) 細胞週期（Cell cycle）， 其所指細胞從上一次細胞分裂結束開始到 下一次細胞分裂為止的過程。而此過程由 G1、S、G2、M 四個時期所構 成，各時期各司其職。細胞的增殖作用主要受到細胞週期的調控，然而， 細胞在通過 M 期後，一部份進入細胞週期繼續增殖，另一部份成為 G0 細胞，而 G0 通過程序性和非程序性途徑，最後死亡。也有部分細胞經分 化，發展成更具完整性、功能性的細胞。. 人體內的正常細胞多半停留在 G0-G1 期(G0-G1arrest)進一步成熟分 化，而癌細胞不同於正常細胞之處就是因為細胞週期的失控而導致細胞不 斷的增殖與複製不成熟的幼稚細胞，如此惡性循環變造成癌症一發不可收 拾，所以若能以藥物將不正常之增殖給停止，當然也促成了分化成熟的進 行。. 白血病臨床的化療藥物包括烷化基、抗代謝藥物，抗生素及激素等， 這些藥物副作用較強，且對於重要防禦作用的淋巴細胞、骨髓造血細胞的 破壞較大，使機體對癌細胞、感染失去抵抗力，臨床上白血病患者死於肺 炎、敗血症、尿毒症等化療副作用的病例並不少見。大陸以中藥提取研製 了較多的抗白血病製劑，並對中藥及天然藥物的抗白血病作用進行了實驗 研究。(23)(24)發現中藥及天然藥物不但副作用小，還具有著重整體、攻擊 兼施的優點，這是一些化療藥物所不能比擬的，以中藥及天然藥物中提取 有效製劑，已經成功為抗白血病的重要途徑。.
(31) 壹、一般抗白血病藥物的作用可分三大類：. 1.細胞毒型藥物: 1. 1 損傷 DNA，抑制 DNA、RNA、蛋白質合成。(大豆皂 K) 1. 2 抑制白血病細胞分裂增殖 1. 3 干擾白血病細胞的能量代謝 1. 4 改變癌細胞環核 酸 A 含量 1. 5 干擾膜信息傳遞 1. 6 影響膜內外電荷. 2.提高機體免疫力的免疫型藥物： 不是表現在直接細胞毒作用，而是通過提高機體免疫力而達到殺死腫 瘤細胞的作用。(靈芝多醣、香茹多醣、蟲草多醣通過促進機體免疫 功能而實現的。大豆皂 K可增加機體細胞免疫功能。). 3.誘導分化類藥物：. ※本研究基於開發 1,3 類型藥物，進行對泰葛粗抽物及分離化合物的活性 測試，以期望能開發抗白血病症用藥。.
(32) 貳、藥理檢測方法：. (1)抗增殖活性測定：(MTT assay). 本研究藥理實驗模式利用 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-diphenyl) -tetrazolium bromide (MTT)活性測試來檢測粗抽物及化合物測知不同濃度 對 HL-60 cell line 增殖的影響。MTT 染劑可穿透活細胞的細胞膜經由粒線 體上酵素的還原而成藍紫色反應，在利用 DMSO 將細胞膜溶解後釋出藍 色染料於 570 nM 下測量吸光值得多寡，於是便可以得到粗抽物及化合物 對細胞增殖比例的百分比 (7~10)。. (2)細胞分化活性測定：. 本研究藥理實驗模式利用硝基藍四氮. J(nitroblue tetrazolium:. NBT)溶液來做分化活性測定，主要原理是利用白血病細胞分化成熟時， 可恢復吞噬微生物或異物的功能，此時，細胞內酵素活性會增加許多，並 且會釋放出超氧化物，像是 superoxide，去抵禦外來物質的侵犯，也由於 它的還原性，將 NBT 還原成藍黑色的 formazan 化合物沈積在細胞內。測 量誘導分化的能力，則用顯微鏡檢測 200 左右的細胞計算藍黑色細胞所佔 比例，即為誘導分化的比例的百分比，也就是誘導分化能力。.
(33) 第二章 泰葛之萃取分離與純化 ＊兩次的泰葛成分萃取分離共獲得四個化合物。 第一節 第一次抽取與分離純化(尋找葛雌素來做定量) 泰國北部取得泰葛(Pueraria mirifica)的根，陰乾後為 3.3Kg.。泰國方 面鑑定基原為豆科植物(Leguminosae)，葛根屬(Puraria)植物泰國葛根 (Pueraria mirifica).將陰乾後的根部切碎後，甲醇浸泡,甲醇粗抽出物 (MeOH extracts)457 g，乾重為 390g，抽出率為 13.8%。 甲醇抽出物(MeOH extracts)457g，依 Scheme 1.的方法，依序純化分 離而得兩個化合物：Miroestrol 及 Puerarin。. Pueraria Mirifica. Airy Shaw & Suvatabandhu dried roots 3.3 kg extracted with M eOH 30L ×8(45-55℃) & concentrated. MeOH Extracts (PMM ) 457 g dissolve with MeOH(1L) wash with MeOH(0.5L×4). Filtrate 3L. Precipitate (PMMP ) 144 g. H 2O (5L )/ EtOAc (1.1L×11). H2 O Layer (PMMW ) 250 g. EtOAc Layer (PMME ) 24.3931 g 5%MeOH(8L)/ CHCl3(0.55L×40). 550 mL×1-20. CHCl 3 Layer (PMMEC-1 ) 7.3087 g. 550mL×21-40. CHCl 3 Layer H 2O Layer (PMMEC-2 ) (PMMEW ) 8L 2.6957 g (+)-Miroestrol(Ⅰ ) 4mg. Puerarin(Ⅱ ) 23mg Scheme 1. The first time extraction and partition of dried roots of Pueraria Mirifica Airy Shaw & Suvatabandhu.
(34) 第二節 第二次抽取與分離純化 利用分離得葛雌素，再次分離純品及利用 HL-60 細胞測測粗篩物的 活性藥理。利用 Scheme 2.的方法，在 PMEEE (75%EtOH layer)分離而得 三個化合物：Miroestrol(Ⅰ)、Daidzein (Ⅲ)及 Genistein (Ⅳ)。(Scheme 2.). Pueraria Mirifica Airy Shaw & Suvatabandhu dried roots 14.1 kg extracted with MeOH 30L ×8(45-55℃). EtOH ext.( PME) 4.168g kg H2O (6L )/ EtOAc (0.4L×11). EtOAc layer PMEE 167.525 g. H2O layer PMEW 167.525 g. 75%EtOH(3.25L )/ n-Hexane(1.5L×3). n-Hexane layer PMEEN 67.526 g. Emulsion PMEEE1 6.995 g. 75%EtOH layer PMEEE 71.054 g Miroestrol(Ⅰ ) 21mg Daidzein(Ⅲ ) 64mg Genistein(Ⅳ ) 10mg. Scheme 2. The second time extraction and partition of dried roots of Pueraria MirificaAiry Shaw & Suvatabandhu.
(35) 第三章 結構解析. ◎ Compound(Ⅰ) (Miroestrol)結構解析: (1)物理性質和初鑑定： 1.結晶：無色稜狀結晶（甲醇再結晶或氯仿－甲醇中再結晶）。 2.熔點：270-273℃(文獻為 268~270℃)(10-11) 3. TLC 片經 CHCl3：MeOH = 10：1 溶媒展開後，Rf =0.3；經 Ethyl acetate： cyclohexane：EtOH = 45：45：10 溶媒展開後，Rf = 0.37。噴 10%H2SO4 呈褐色點；I2 薰呈淡褐色反應。 (2)EI-MS(Chart 1.)：分子的離子峰應該為 m/z 358[M]+，分子量可能為 358，根據文獻(59)，葛雌素(Miroestrol)的分子量為 358，故猜測可能為 此化合物葛雌素。基峰分子離子峰為 m/z 55 (3)IR 光譜(Chart 1.)：KBr 打片，3480cm-1 及 3403cm-1 處有羥基(-OH)的 特性吸收；在 2963 cm-1 處有不飽和氫(=C-H)的伸縮振動特性的吸收； 1713cm-1 處有-C=O 的特性吸收；1659cm-1 有 OCH=C 的吸收，1659cm-1 及 1504cm-1 為芳香環(aromatic ring)的特性吸收，在 1281 cm-1 處有 -C-O-C-的特性吸收. (4)UV 光譜(Chart 2.)：甲醇溶解，吸收光譜在 218nm 有最大吸收波長， 在 255nm 有一肩部的矮峰，285nm 有一峰，文獻記述 Miroestrol 之 UV 的最大吸收波長為 217nm，285nm 為第二高的吸收峰，255nm 亦有吸 收的矮峰，推測有可能是葛雌素(Miroestrol)。 (10-11).
(36) (5) 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, DEPT, COSY and HMBC spectral data: (參照所附光譜資料)(Chart. 3~9) 由δ 6.99ppm (H-1)和δ 6.50ppm (H-2)、δ 6.50ppm (H-1)和δ 6.30ppm (H-2)有相同的偶合常數，並經 COSY 證明後，可知相互有偶合，加上 DEPT 顯示為 CH。δ 2,74ppm (H-12)和δ 2.43ppm (H-13)、δ 2.74ppm (H-12)和δ 1.99ppm (H-19)、δ 2.89ppm (H-12)和δ 2.57ppm (H-19)有相同的偶合常數， 加上 COSY 及 Dept 的證明，可知δ 2,74ppm (H-12)和δ 2.43ppm (H-13)為 CH，δ 1.99ppm (H-19)而為-CH2。其餘像是δ 6.29ppm (H-7)、δ 3.31ppm (H-9)、δ 3.69ppm (H-18)、δ 0.56ppm (H-20) δ 1,23ppm (H-21)，這些皆為 單一峰，表示並無鄰近的 H 可偶合，經由與 COSY 的圖譜比對，確定並 無任何偶合情況，與 Miroestrol 的結構相符合。特殊的 ddd 峰出現在δ 1,23ppm，應該是和 H-12 及兩個 H-19 偶合的緣故，COSY 圖譜也印正了 此點。另外，HMBC 顯示，偶合位置也是以 3J 最明顯。對過了所有圖譜， 其訊號符合(+)- Miroestrol 的訊號，起光譜資料，茲整理如 Table 1.而 1. H-NMR, 13C-NMR 的資料與文獻(67)比對(Table 2.)，亦相當符合。.
(37) 20. H. H3 C 21H3C 11 H H 1 10. 2. 9. 12 19. OH H 18 H 14. H 8. 5. O. 4. 17. H 15. OH. 16. H. O. 3. HO. OH. 13. 7. 6. (+)-Miroestrol. Table 1 . 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, DEPT, COSY and HMBC spectral data of (+)-Miroestrol Position. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11. (+)-Miroestrol(CD3 OD) 1. H (HMQC). 13. C. DEPT. COSY. NOESY. HMBC C-3(3 J ), C-5(3 J ),C-9(3 J ). 6.99(d,8.46). 131.2. CH. H-2. H-2. 6.50(dd,8.46.2.56,). 112.0. CH. H-1,H-4. H-1. C-4(3 J ),C-10(3 J ),C-3(2 J ) ,C-5(4 J ). －. 158.0. C. －. －. －. 6.30(d,2.56). 103.6. CH. H-2. －. C-2(3 J ),C-10(3 J ),C-3(2 J ) ,C-5(2 J ). －. 153.7. C. －. －. －. －. －. －. －. －. －. 6.29(s). 139.7. CH. －. －. C-5(3 J ), C-14(3 J ),C-8(2 J ). －. 116.3. C. －. －. －. 3.31(s). 40.7. CH. －. －. －. 113.5. C. －. －. －. －. 37.9. C. －. －. －. 12. 2.74(ddd,9.6,5.56,2). 45.5. CH. －. C-14(3 J ), C-13(2 J ). 13 14 15. 2.43(d,5.56). 51.0. CH. H-12,H-18. －. C-15(3 J),C-12(2 J), C-14(2 J). －. 79.7. C. －. －. －. －. 210.7. C. －. －. －. 55.2. CH2. H-19,H-16. H-16. －. 78.0. C. －. －. －. 3.69(s). 79.3. CH. H-8,H-13. －. C-14(3 J), C-12(3 J),C-17(2 J). 40.7. CH2. 16. H-13. 2.57(dd,18.5,1.4). H-19. C-14(3 J),C-18(3 J) ,C-15(2 J),C-17(2 J). 2.89(d,18.5). 17 18 19 20 21. 1.88(dd,14,9.6). C-11(3 J),C-14(3 J),C-18(3J). H-19,H-12. 1.99(br. t,12.4). H-19 H-16. C-17(2 J) ,C-12(2 J). 0.56(s). 22.5. CH3. H-21. －. C-12(3 J),C-9(3 J),C-11(2 J),C-19(2 J). 1.23(s). 32.4. CH3. H-20. －. C-12(3 J),C-9(3 J),C-11(2 J) ,C-19(2 J ). δ in ppm, J in Hz. s: singlet, d: doublet,dd: double doublet ddd: double double doublet br. t.: broad triplet.
(38) Table2. Spectrum data of Compound (Ⅰ) and (+)-Miroestrol(67) Compound（Ⅰ） 1. 13. 文獻之(+)-Miroestrol 1. 13. Position 1. H 6.99. C 131.2. H 6.99. C 131.2. 2. 6.50 －. 112.0. 6.50. 112.0. 158.0 103.6. － 6.30. 158.3 103.3. 153.7 －. －. 153.8. 139.7. － 6.29. － 139.7. 3 4. 6.30. 5. －. 6 7. － 6.29. 8. －. 116.3. －. 116.5. 9 10. 3.31 －. 40.7 113.5. 3.31 －. 40.8 113.5. 11. －. 37.9. －. 38.0. 12 13. 2.74 2.43. 45.5 51.0. 2.74 2.43. 45.6 51.2. 14. －. 79.7. －. 79.7. 15. 210.7. 78.0. － 2.58 2.90 －. 210.5. 17. － 2.57 2.89 －. 18. 3.69. 79.3. 3.69. 79.3. 16. 19 20 21. 1.88 1.99 0.56 1.23. 55.2. 40.7 22.5 32.4. 1.88 1.99 0.56 1.23. 55.3 78.0. 40.7 22.5 32.5.
(39) Compound（Ⅱ） 結構解析 (1) 物理性質和初鑑定： 1. 結晶：無色針晶(甲醇再結晶)。 2. 熔點：187-190℃ 3. TLC 片經溶媒 CHCl3：MeOH：H2O = 20：10：1 溶媒展開後展開後， Rf = 0.3。噴 10%H2SO4 呈淡黃色點，初步可推定本化合物為異黃酮類 化合物。 (2)EI-MS(Chart 10.)：分子的離子峰應該為 m/z 416[M]+，分子量可能為 416，基峰分子離子峰為 m/z 16[M-400]+ (3)IR 光譜(Chart 11.)：KBr 打片，3457 cm-1 處有羥基(-OH)的特性吸收； 1709cm-1 處有-C=O 的特性吸收；1600~1450 cm-1 有芳香環(aromatic ring) 的特性吸收，在 1255 cm-1 處有-C-O-C-的特性吸收 (4)UV 光譜(Chart 12.)：λmax (MeOH)在 249nm 及 301(sh)有兩個吸收峰， 因為位於異黃酮類之 Band I 300~340nm 及 Band II 245~270nm 之吸收 範圍內(76-79)，故可以推測為異黃酮類化合物。 加入 Shift Reagents 後 UV 光譜變化的情形： (Table 3.) 1.以甲醇配置的標準液：Band II 為 260nm，Band I 為 302nm 2.加入氫氧化鈉(NaOH)： → Band II 向紅位移 14nm，此化合物可能 A 環上有羥基化(-OH) → Band I 向紅位移 31nm，此化合物可能 B 環上有 4′-羥基化(4′-OH) 3.加入三氯化鋁(AlCl3): d、4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)、3-羥基(-OH)－4-酮基(C=O)或鄰二酚羥 基等結構系統均可和三氯化鋁(AlCl3 ) 形成螯合，而形成共軛系統延 長，導致吸收帶向紅位移。 →加入三氯化鋁後，此化合物 Band I 及 Band II 並沒有改變，表示 A 環 上無鄰二酚羥基或骨架含有 4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)結構。.
(40) 3.加入三氯化鋁(AlCl3) /鹽酸(HCl)： →Band I 及 Band II 亦沒有改變，表示結構上並無相鄰的羥基(-OH) d、綜合 1、2 和 3，可推測此化合物結構尚無 4-酮基(-C=O)－5-羥基 (-OH)、3-羥基(-OH)－4-酮基(C=O)或鄰二酚羥基。 4.加入醋酸鈉(NaOAc)： d、醋酸鈉(NaOAc)的鹼性較弱，故只能把黃酮母核上酸性較強的羥基 (-OH)解離，常用來判斷 7 位之羥基(-OH)。 →加入醋酸鈉(NaOAc)後，Band II 向紅位移 10nm，表示第七位上有羥基 (-OH) 5.加入醋酸鈉(NaOAc)/硼酸(H3BO3)： →Band I 及 Band II 無明顯改變，表示在 A 環及 B 環結構上無鄰二酚羥 基(-OH) e、根據以上 UV 圖譜資料，推測此化合物為 7 及 4′為上有羥基(-OH)的 異黃酮類化合物. Table 3. Change of UV absorption of Puerain by adding various shift reagents Shift reagent. MeOH. +NaOH. +AlCl3. 301 249. 332 263. 301 250. +AlCl3 /HCl NaOAc NaOAc/H3 BO3. Band(nm). I II. 301 249. 301 259. 301 250.
(41) (5)1H-NMR、13C-NMR、HMQC、DEPT、COSY 光譜解析： (參照 Table 4.)(Chart 10-17) 由 1H-NMR 光譜資料得知，芳香族質子區域發現δ 7.36ppm (2H,d,J=8.5) 和δ 6.84ppm (2H,d, J=8.5)呈現相互偶合而且呈現鄰位偶合關係，積分比 為 2：2；δ6.95ppm (1H,d,J=8.9)、δ 8.04ppm (1H,d, ,J=8.9)有質子吸收訊 號偶合關係，積分比為 1:1；而上述此些推測亦與 COSY 及 DEPT 的光譜 相符合。在一般黃酮類的 A 環上的氫通常較 B 環上的氫位於較高磁場，δ 7.36ppm (2H,d, J=8.5)和δ 6.84ppm (2H,d, J=8.5)同一位置也許各有兩個 氫，是在 B 環上的四個氫，因為有 4′位羥基(-OH)的取代，因此造成兩組 四個氫雙雙偶，H；可知異黃酮類化合物可推測其在 7 位及 4′位有羥基 (-OH)。但在 3-4ppm 處有 br. peak 產生為接糖基的特徵，而且在 DEPT 有-CH2 group 應該為葡萄糖的六號 C。在對照 C 譜，在 60-80ppm 左右有 六個 C 推測應該為六碳糖的葡萄糖，因為 COSY 看出 H-5 及 H-6 有偶合， 應該為在第八位接上葡萄糖，結構應該為 Puerarin。.
(42) (6)EI-MS 的分子離子峰 m/z 416[M]+符合 7,4′-dihydroxyisoflavone 的分子 量，分子離子的碎片離子 m/z 416、 m/z267 和以碳接糖基的異黃酮 質譜斷裂方式相同. (Scheme 3) OH OH 2" 1" OH. O 8. 7. 5". +. •. OH. + M －18 • m/z. 398. OH. 1 O. -H2O. 2 3. 6. -H2O. 2'. 1'. 3'. 4. 5. -H2O + M －54 • m/z. 362. 4'. O. + M －36 • m/z. 380. 6'. OH. 5'. Puerarin + M • m/z. 416 OH. + CH2 OH. 8. 7. O. 2 3. + M －149. 5' m/z. 254. OH. OH. 5'. +. 3'. 6'. 3' 4'. 2'. 4'. O. 6'. 1'. 4. 2'. 1'. 4 O. O. 7. 5. 3 5. •. 6. 2. 6. +. 8. M －149 • m/z. 267 Retro-Diels Alder. +. + CH2 OH. •. O. CH. C. OH. C. + O. A1. +. B1. m/z. 118. m/z. 149. Scheme 3.The mass spectrum of fragmentation patterns of Puerain.
(43) (7)綜合以上推測，對照 DEPT、COSY、HMQC 和 HMBC，發現皆符合 以上所述資料，再和文獻 (74)比對後，光譜資料無誤，確定此化合物應該 為 Puerarin。 OH OH 1" OH. 5" O. 8. 7. OH. 2" OH. 1 O. 2 3. 6. 1'. 2' 3'. 4. 5 O. Puerarin. 4' 6' 5'. OH. Table 4. 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC ,DEPT, ,COSY and HMBC spectral data of Puerarin. Puerarin(DMSO-d6) Position. 1. H (HMQC). 13. C. DEPT. COSY. 2. 8.16(s). 152.8. CH. －. 3. －. 123.9. C. －. 4. －. 176.6. C. －. 5. 8.04(d, 8.9). 126.5. CH. H-6. 6. 6.95(d, 8.9). 114.6. CH. H-5. 7. －. 162.9. C. 8. －. 111.5. C. －. 9. －. 157.0. C. －. 10. －. 116.9. C. －. 1′. －. 122.6. C. 2′. 7.36(d, 8.5). 129.7. CH. H-3′. 3′. 6.84(d, 8.5). 114.6. CH. H-2′. 4′. －. 156.4. C. －. 5′. 6.84(d, 8.5). 114.6. CH. H-6′. 6′. 7.36(d, 8.5). 129.7. CH. H-5′. 1″. 5.09(d, 9.9). 74.0. －. H-2″. 2″. 4.11(br. s). 71.4. －. H-1″,H-3″. 3″. 3.52~3.56(br. m). 78. 4. －. H-1″. 4″. 3.52~3.56(br. m). 70.0. －. －. 5″. 3.52~3.56(br. m). 81.1. －. －. 6″. 3.78(dd),3.9(dd). 61.1. CH2. H-5″. δ in ppm, J in Hz. br. m: broad multiple, s: singlet, d: doublet, dd: double doublet.
(44) Compound（Ⅲ）結構解析 : (1)物理性質和初鑑定： 1. 結晶：無色針晶(氯仿-甲醇再結晶)。 2. 熔點：330-333℃ 3. TLC 片經溶媒展開後為 CHCl3：MeOH=7：3，Rf =0.55。噴 10%H2SO4 呈淡黃色點；對 FeCl3 呈墨綠色陽性反應，推測含有 Phenol結構；Mg-HCl 呈黃色反應；對 Na2CO3 呈黃色陽性，故初步可推定本化合物為異黃酮 類化合物。 (76,77) (2)EI-MS(Chart 18.)：分子的離子峰應該為 m/z 254[M]+，分子量可能為 254，基峰分子離子峰為 m/z 137[M-117]+ (3)IR 光譜(Chart 19.)：KBr 打片，3250 cm-1 處有羥基(-OH)的特性吸收； 在 2933 cm-1 處有不飽和氫(=C-H)的伸縮振動特性的吸收； 1657cm-1 處 有-C=O 的特性吸收；1621，1600~1450 cm-1 有芳香環(aromatic ring)的 特性吸收，在 1262 cm-1 處有-C-O-C-的特性吸收 (4)UV 光譜(Chart 20.)：λmax (MeOH)在 260nm 及 302(sh)有兩個吸收峰， 因為位於異黃酮類之 Band I 300~340nm 及 Band II 245~270nm之吸收範 圍內(76-79)，故可以推測為異黃酮類化合物。 加入 Shift Reagents 後 UV 光譜變化的情形： (Table 5.) 1.以甲醇配置的標準液：Band II 為 260nm，Band I 為 302nm 2.加入氫氧化鈉(NaOH)： → Band II 向紅位移 10nm，此化合物可能 A 環上有羥基化(-OH) → Band I 向紅位移 28nm，此化合物可能 B 環上有 4′-羥基化(4′-OH).
(45) 3.加入三氯化鋁(AlCl3): d、4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)、3-羥基(-OH)－4-酮基(C=O)或鄰二酚羥 基等結構系統均可和三氯化鋁(AlCl3 ) 形成螯合，而形成共軛系統延 長，導致吸收帶向紅位移。 →加入三氯化鋁後，此化合物 Band I 及 Band II 並沒有改變，表示 A 環 上無鄰二酚羥基或骨架含有 4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)結構。 4.加入三氯化鋁(AlCl3) /鹽酸(HCl)： →Band I 及 Band II 亦沒有改變，表示結構上並無相鄰的羥基(-OH) d、綜合 1、2 和 3，可推測此化合物結構尚無 4-酮基(-C=O)－5-羥基 (-OH)、3-羥基(-OH)－4-酮基(C=O)或鄰二酚羥基。 5.加入醋酸鈉(NaOAc)： d、醋酸鈉(NaOAc)的鹼性較弱，故只能把黃酮母核上酸性較強的羥基 (-OH)解離，常用來判斷 7 位之羥基(-OH)。 →加入醋酸鈉(NaOAc)後，Band II 向紅位移 7nm，表示第七位上有羥基 (-OH) 6.加入醋酸鈉(NaOAc)/硼酸(H3BO3)： →Band I 及 Band II 無明顯改變，表示在 A 環及 B 環結構上無鄰二酚羥 基(-OH) e、根據以上 UV 圖譜資料，推測此化合物為 7 及 4′為上有羥基(-OH)的 異黃酮類化合物. Table 5. Change of UV absorption of Daidzein by adding various shift reagents Shift reagent. MeOH. +NaOH. +AlCl3. 301 248. 329 258. 301 249. +AlCl3 /HCl NaOAc NaOAc/H3 BO3. Band(nm). I II. 301 250. 301 258. 301 249.
(46) (5)1H-NMR、13C-NMR、HMQC、DEPT、COSY 光譜解析： (參照 Table 6.) (Chart 18-25) 由 1H-NMR 光譜資料得知，芳香族質子區域發現δ 7.36ppm(2H,d, J=8.2)和δ 6.79ppm(2H,d, J=8.2)呈現相互偶合而且呈現鄰位偶合關係，積 分比為 2：2；δ 6.85ppm (1H, d, J=2.2)、δ 6.92ppm (1H, dd, J=8.7,2.2)和δ 7.94ppm(1H,d,J=8.7)呈現 ABX 型質子吸收訊號偶合關係，而上述此些推 測亦與 COSY 及 DEPT 的光譜相符合。在一般黃酮類的 A 環上的氫通常 較 B 環上的氫位於較高磁場，δ 7.36ppm(2H,d)和δ 6.79ppm(2H,d)同一位置 也許各有兩個氫，是在 B 環上的四個氫，因為有 4′位羥基(-OH)的取代， 因此造成兩組四個氫雙雙偶，H；δ 6.85ppm (1H,dd)δ 6.92ppm (1H,d)和δ 7.94ppm(1H,d)為 A 環上的氫。加上 UV 的資料佐證，可知異黃酮類化合 物可推測其在 7 位及 4′位有羥基(-OH)。A 環的 H-8、H-6 和 H-5 而言， H-5 因為 C-4 的上酮基的去遮蔽效應，以及 H-6 的鄰偶，會出現一個約二 重峰約在δ 8ppm，所以，δ 7.94ppm(1H,d,J=)為 H-5 的訊號；H-6 因為 H-8 的 間 偶 及 H-5 的 鄰 偶 ， 出 現 一 個 四 重 峰 ( 或 二 重 峰 ) ， 因 此 ， δ 6.92ppm(1H,dd,J=)是 H-6 的訊號；H-8 因為 H-6 的訊號，出現二重峰，δ 6.85ppm(1H, d,J=)為 H-8 的訊號。B 環上位置氫的確定而言，H-3′及 H-5′ 因為取代基的遮蔽效應，及Ｃ環對 H′-2 及 H-6′的去遮蔽效應，可知較低 磁場的 H-3′及 H-5 是δ 6.79ppm(2H,d,J=)的訊號， H′-2 及 H-6′則是在 7.36ppm(2H,d,J=)。異黃酮的 H-2，因為附著氧原子上的碳原子上，一般 為單一峰且比一般芳香環出現在較低磁場，在 DMSO-d6 溶劑明顯可到δ 8.2~8.7ppm(78) ， 故 可 確 定 H-2 是 δ 8.26ppm(1H,s) 的 訊 號 。 應 該 為 7,4′-dihydroxyisoflavone。.
(47) (6)EI-MS 的分子離子峰 m/z 254[M]+符合 7,4′-dihydroxyisoflavone 的分子 量，分子離子的碎片離子 m/z 254、 m/z253、 m/z 226、 m/z137 、m/z136、 118、 m/z 108 和異黃酮質譜斷裂方式相同. (Scheme 4.). +. +. •. OH. O. OH. •. O. － CO － H. + M-28. O OH. m/z. 226. M. +. + M-1 m/z. 253. OH m/z. 254 Retro-Diels Alder. Pathway Ⅰ with H-transfer. +. OH. OH. O. +. •. O. •. CH C + A1+H. m/z. 137. + OH. C. OH. C O + A1. m/z. 136. B1. + m/z. 118. － CO. A1-CO m/z. 108. Scheme 4.The mass spectrum of fragmentation patterns of Daidzein.
(48) (7)綜合以上推測，對照 DEPT、COSY、HMQC 和 HMBC，發現皆符合 以上所述資料，再和文獻(17)(75-76)比對後，光譜資料無誤，確定此化合物 應該為 Daidzein。. OH. 7. 8. O. 9. 2 C. A 6. 4. 10. 5. 3. 2'. 1'. 3' B. O. 6'. 4'. OH. Table 6. 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC ,DEPT, ,COSY and HMBC spectral data of Daidzein. Daidzein (DMSO-d6) Position. 1. 2. 8.26(s). 3. H (HMQC). 13. C. DEPT. COSY. 153.0. CH. －. －. 123.7. C. －. 4. －. 174.9. C. －. 5. 7.94(d, 8.7). 127.5. CH. H-6. 6. 6.92(dd,8.7,2.2). 115.4. CH. H-5 H-8. 7. －. 162.9. C. 8. 6.85(d,8.7). 102.3. CH. H-6. 9. －. 157.58. C. －. 10. －. 116.8. C. －. 1′. －. 122.8. C. 2′. 7.36(d,8.2). 130.3. CH. H-3′. 3′. 6.79(,8.2). 115.2. CH. H-2′. 4′. －. 157.7. C. －. 5′. 6.79(d,8.2). 115.2. CH. H-6′. 6′. 7.36(d,8.2). 130.3. CH. H-5′. 7-OH. －. －. －. －. 4′-OH. －. －. －. －. δ in ppm, J in Hz. s: singlet, d: doublet, dd: double doublet.
(49) Compound (Ⅳ ) 結構解析: (1)結晶：無色針晶(氯仿-甲醇再結晶)，淡黃色粉末。 1.熔點：295-300℃ 2.物理性質和初鑑定： 3. TLC 片經溶媒展開後為 CHCl3：MeOH=5：1，Rf =0.45。噴 10%H2SO4 呈淡黃色點；對 FeCl3 呈墨綠色陽性反應，推測含有 Phenol結構；Mg-HCl 呈黃色反應；對 Na2CO3 呈黃色陽性，故初步可推定本化合物為異黃酮 類化合物。 (76,77) (2)EI-MS(Chart 26.)：分子的離子峰應該為 m/z 270[M]+，分子量可能為 270，基峰分子離子峰為 m/z153[M-117]+ (3)IR 光譜(Chart 27.)： KBr 打片，在 3459 cm-1 處有-OH 的特性吸收；在 2934 cm-1 處有=C-H 特性的吸收；在 1632cm-1 處有-C=O 的特性吸收； 在 1252 cm-1 處有-C-O-C-的特性吸收 (4)UV 光譜(Chart 28.)：λmax(MeOH)在 260nm 及 333(sh)有兩個吸收峰， 因為位於異黃酮類之 Band I 300~340nm 及 Band II 245~270nm之吸收範 圍內(76-79)，故可以推測為異黃酮類化合物。. 加入 Shift Reagents 後 UV 光譜變化的情形：(Table 7.) 1.以甲醇配置的標準液：Band II 為 260nm，Band I 為 333nm 2.加入氫氧化鈉(NaOH): → Band II 向紅位移 12nm，表示此化合物可能 A 環上有羥基化(-OH) 3.加入三氯化鋁(AlCl3): d、4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)、3-羥基(-OH)－4-酮基(C=O)或鄰二酚羥 基等結構系統均可和三氯化鋁(AlCl3 ) 形成螯合，而形成共軛系統延 長，導致吸收帶向紅位移。 →加入三氯化鋁後，此化合物在 Band II 向紅位移 12nm，表示 A 環上有 鄰二酚羥基或骨架含 4-酮基(-C=O)－5-羥基(-OH)結構。.
(50) 4.加入三氯化鋁(AlCl3) /鹽酸(HCl)： →Band I 及 Band II 亦沒有改變，表示結構上並無相鄰的羥基(-OH) d、綜合 1、2 和 3，可推測此化合物結構可能有 4-酮基(-C=O)－5-羥基 (-OH)。 5.加入醋酸鈉(NaOAc)： d、醋酸鈉(NaOAc)的鹼性較弱，故只能把黃酮母核上酸性較強的羥基 (-OH)解離，常用來判斷 7 位之羥基(-OH)。 →加入醋酸鈉(NaOAc)後，Band II 向紅位移 9nm，表示第七位上有羥基 (-OH) 6.加入醋酸鈉(NaOAc)/硼酸(H3BO3)： →Band I 及 Band II 無明顯改變，表示在 A 環及 B 環結構上無鄰二酚羥 基(-OH) e、根據以上 UV 圖譜資料，推測此化合物為 7 及 4′為上有羥基(-OH)的 異黃酮類化合物. Table 7. Change of UV absorption of Genistein by adding various shift reagents MeOH. +NaOH. +AlCl3. I. 330. 330. 368. 371. 331. 331. II. 261. 273. 273. 273. 270. 271. Shift eagent. +AlCl3 /HCl NaOAc NaOAc/H3 BO3. Band(nm).
(51) (5)1H-NMR、13C-NMR、HMQC、DEPT、COSY 光譜解析： (參照 Table 8.)(Chart. 26-33) 由 1H-NMR 光譜資料得知，芳香族質子區域發現δ 7.36ppm (2H,d,J=8.6)和δ 6.80ppm(2H,d,J=8.6)呈現相互偶合而且呈現鄰位偶合關 係，積分比為 2：2；δ 6.37ppm(1H, d,J=2.2)、δ 6.21ppm(1H,d,J=2.2)呈現 間位質子吸收訊號偶合關係，而上述此些推測亦與 COSY 及 DEPT 的光 譜相符合。在一般黃酮類的 A 環上的氫通常較 B 環上的氫位於較高磁場， δ 7.35ppm(2H,d,J=8.6)和δ 6.80ppm(2H,d,J=8.6)同一位置也許各有兩個 氫，是在 B 環上的四個氫，因為有 4′位羥基(-OH)的取代，因此造成兩組 四個氫雙雙偶合， A 環上的氫因為有供電子 OH 基的緣故，所以位於較 高的磁場。所以，δ 6.21ppm(1H,d)可能是 H-6 的訊號，因為兩邊有 OH 基， 所以位於高磁場。δ 6.37ppm(1H, d,)則為 H-8 的訊號。而δ 8.30ppm 則是標 準的 H-2 訊號。δ 12.94ppm 應該是 5′-OH，故可確定 H-2 是δ 8.26ppm(1H,s) 的訊號。綜合上述資料，應該為 5,7,4′-dihydroxyisoflavone。.
(52) (6)EI-MS 的分子的離子峰 m/z 270[M]，亦符合 5,7,4′- dihydroxyisoflavone 的分子量，分子離子的碎片離子 m/z 270、 m/z153 和異黃酮的質譜斷裂 方式相同(Scheme 5.). +. +. •. OH. O. OH. •. O. － CO － H. OH + M-28. OH m/z. 242. M. + M-1. O +. m/z. 269. OH m/z. 270 Retro-Diels Alder. Pathway Ⅰ with H-transfer. +. OH. OH. O. •. CH. + C. C. OH. C OH. OH + A1+H m/z. 153. +. •. O. O OH + A1. m/z. 152. B1. +. m/z. 118. － CO. A1-CO. m/z. 124. Scheme 5.The mass spectrum of fragmentation patterns of Genistein.
(53) (7) 綜合以上推測，對照 DEPT、COSY、HMQC 和 HMBC，發現皆符合 以上所述資料，再和文獻 (79)比對後，光譜資料無誤，確定此化合物應該 為 Genistein。. OH. 7. 8 9 A. O C. 6. 10. 5. 4. 2 3. 1'. 2' 3' B. OH. O. 6' 5'. 4'. OH. Table 8. 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC ,DEPT, ,COSY and HMBC spectral data of Genistein. Genistein(DMSO-d6) Position. 1. H (HMQC). 13. C. DEPT. COSY. 2. 8.30(s). 154.2. CH. －. 3. －. 122.5. C. －. 4. －. 180.4. C. －. 5. －. 164.5. C. －. 6. 6.21(d,2.2). 99.2. CH. H-6－H-8. 7. －. 162.9. C. －. 8. 6.37(d,2.2). 93.9. CH. H-8－H-6. 9. －. 157.6. C. －. 10. －. 104.7. C. －. 1′. －. 121.4. C. －. 2′. 7.36(d,8.6). 130.4. CH. H-2′－H-3′. 3′. 6.80(d,8.6). 115.3. CH. H-3′－H-2′. 4′. －. 157.2. C. －. 5′. 6.80(d,8.6). 115.3. CH. H-5′－H-6′. 6′. 7.36(d),8.6. 130.4. CH. H-6′－H-5′. 5-OH. 12.94(s). －. －. －. 7-OH. －. －. －. －. 4′-OH. －. －. －. －. δ in ppm, J in Hz. s: singlet, d: doublet.
(54) 第四章 藥理試驗與活性探討 本實驗經由 MTT 染色的結果，測定粗萃物及分離之化合物對 HL-60 細胞株的抗增殖活性，來做為分離活性成分之主要指標。並且經由 NBT 染色的方法來做第二指標，尋找有分化能力的粗萃物及化合物。 由於一般豆科植物含異黃酮居多，同樣地，葛根屬植物含量也是非常 高。再者，本實驗以分離葛雌素為最主要目標，而且，一般對細胞株的研 究，以 aglycone 的型態居多。所以，以第二次分離葛雌素及黃酮類居多 的乙酸乙酯粗抽物為最初藥理篩選的起點，將 PMEE (IC50=39µg/ml)分成 PMEEE、PMEEE1 和 PMEEN，以 PMEEE 為有效之分層 (IC50=27.1µg/ml) ，其活性測試結果如下表(Table 9.)。 Table 9. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated withPMEE, PMEEN, PMEEE1 and PMEEE for 96 hrs Conc.. MTT assays（%）. NBT assays（%）. Control. 0. 100.0±1.1. 1.3 ± 0.3. PMEE. 10 25 40. 89.1 ± 3.3** 79.6 ± 0.8*** 44.3 ± 4.4***. 1.5 ± 0.5 2.5 ± 0.0* 7.3 ± 1.4***. PMEEN. 5 10 25. IC50 = 39（μg/ml） 96.5 ± 7.3 117.7±0.9*** 結晶. PMEEE1. 2.5 5 10. 97.1 ± 5.9* 95.4 ± 2.4 結晶. 3.4 ± 0.5** 5.7 ± 1.6** ————. PMEEE. 10 25 50. 85.0 ± 5.7** 45.0 ± 6.7*** 13.5 ± 0.5***. 4.8 ± 0.3*** 10.6±0.5*** Death. 1.5 ± 0.6* 1.7 ± 1.0 ————. IC50 = 27.1（μg/ml） HL-60 cells（2×104 /ml）were treated with PMEE ,PMEEN, PMEEE1 and PMEEE for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
(55) 經由第一次測試得知，PMEEE 為有效之分層，故配合分離，將其通 過矽膠管柱層析，再次分為六個收集層， 結果證明在第一層(PMEEE-1) 及第二層(PMEEE-2)有強烈的抗增殖活性產生，第三收集層則為葛雌素所 在處，活性並沒有前兩者強。故先從前兩層開始分離，第三層繼續分離葛 雌素標準品，活性測試結果如下：(Table 10) Table 10. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-(1~6) for 96 hrs Conc.. MTT assays（%） NBT assays（%）. Control. 0. 100.0±1.1. PMEEE-1. 15 20 25. 83.1 ± 2.8*** 58.4 ± 3.8*** 15.3 ± 2.3*** IC50 = 19.5（μg/ml）. PMEEE-2. 5 10 25. 93.9 ± 4.7* 79.9 ± 1.1*** 11.0 ± 0.7***. 1.3 ± 0.3 5.9 ± 0.5*** 6.9 ± 1.8** 5.3 ± 0.6*** 1.9 ± 0.4* 2.3 ± 0.3* 25.2±0.5***. IC50 = 16.1（μg/ml） PMEEE-3. PMEEE-4. PMEEE-5. PMEEE-6. 5 10 25 5 10 25. 101.3±3.0 93.2 ± 0.7*** 50.1 ± 2.8*** 73.9 ± 1.7*** 67.6 ± 6.8*** 62.9 ± 1.7***. 2.1 ± 0.6** 3.8 ± 1.5** 8.6 ± 0.5*** 1.5 ± 0.5 1.1 ± 0.5 1.9 ± 0.4*. 5 10 25. 108.5±8.5 100.6±0.9 93.8 ± 5.1. 0.9 ± 0.5 1.8 ± 0.6 4.4 ± 1.6. 25 121.7±6.7** 4.5 ± 1.2* 50 79.6 ± 9.8* 8.3 ± 1.4** 結晶 ———— 100 HL-60 cells（2×104 /ml）were treated with PMEEE 1~6 for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001； compared with control.
(56) 將 PMEEE-1 的分層再經矽膠管柱層析，分為四個收集層， PMEEE-1-1、PMEEE-1-3 及 PMEEE-1-4 為有效分層，PMEEE-1-(1~4)的 活性測試結果如下表：(Table)，但由於量少其中化合物較複雜及 PMEEE-2 的作用較強，故本研究先將其針對 PMEEE-1-(1~4)的繼續活性分離訂於未 來的目標，先致力於分離 PMEEE-2 的化合物。 Table 11. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-1-(1~4) for 96 hrs Conc（μg/ml） Control PMEEE-1-1. 0 5 10 25. PMEEE-1-2. 2.5 5 8 5 10 25. PMEEE-1-3. MTT assays（%） NBT assays（%） 100.0±1.1 72.9 ± 3.8*** 70.5 ± 1.3*** 44.3 ± 2.0*** IC50＝21.7（μg/ml） 82.4 ± 2.9*** 75.5 ± 4.3*** 72.8 ± 1.4*** 89.7 ± 6.3* 70.9 ± 8.0** 16.9 ± 2.0***. 4.5 ± 0.5 4.5 ± 0.4 6.2 ± 0.3** 10.8±1.0*** 5.4 ± 0.4* 7.0 ± 0.3** 10.5±1.6** 3.8 ± 0.8 6.0 ± 0.5* 9.5 ± 1.7**. IC50＝15.9（μg/ml） PMEEE-1-4. 5 10 25. 119.4±0.7*** 111.7±2.4** 58.5 ± 5.9***. 5.3 ± 0.3* 6.6 ± 0.7* 10.0±0.4***. IC50＝28.1（μg/ml） HL-60 cells（2×104 /ml）were treated with PMEEE-1-(1~4）for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control..
(57) PMEEE-2 通過矽膠管柱層析，分為四個分層 PMEEE-2-(1~4)，得知 PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 有較強的抗增殖活性。故依循此指標，繼續向 下分層，PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 分別依照分離的方法，進行純化的步 驟，以求細分至可獲得純化合物。PMEEE-3 在葛雌素分離過程則有沈澱 產生，通過 LH-20 管柱層析後，分離出化合物為 PMEEE-3flaf，經光譜鑑 定為 Daidzein，有不錯的抗增殖活性及些可能有許分化活性。 Table 12. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-(1~4), PMEEE-3flaf for 96 hrs Conc.（μg/ml） Control. 0. PMEEE-2-1. 5 10 25. PMEEE-2-2. 5 10 25. PMEEE-2-3. 10 25 50 10 25 50 10 25 40. PMEEE-2-4. PMEEE-3flaf. MTT assays（%） NBT assays（%） 100.0±1.1 97.4 ± 5.4 63.5 ± 7.6*** 5.7 ± 1.5*** IC50 ＝14.6（μg/ml） 99.2 ± 4.7 87.9 ± 6.4* 9.1 ± 4.2*** IC50 ＝16.6（μg/ml） 100.5±1.0 95.6 ± 3.9 81.2 ± 0.3*** 104.8±4.5 97.6 ± 1.9* 94.0 ± 7.6 70.9 ± 1.4*** 41.7 ± 4.0*** 24.8 ± 1.3***. 1.3 ± 0.3 3.4 ± 0.8 3.6 ± 1.3 Death 2.1 ± 0.8 1.9 ±0.2 12.7±6.4 4.2 ± 1.6 5.1 ± 1.7 15.1±1.3 2.7 ± 1.6 4.6 ± 0.8 6.2 ± 1.3 9.9 ± 1.6*** 13.7±2.2*** 23.9±2.9***. IC50＝22.3（μg/ml） HL-60 cells（2×104 /ml）were treated with PMEEE-2-(1~4),PMEEE3flaf for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control..
(58) PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 的分離層如下表 (Table.13.)， PMEEE-2-1-1、PMEEE-2-1-2、PMEEE-2-2-E 及 PMEEE-2-2-fh 都有不錯 的活性，其中 PMEEE-2-1-2 及 PMEEE-2-1-3 有很強的抗增殖活性，經由 TLC 再次比對成分，可考慮合併，故合併後再次用管柱分離收集。而在 PMEEE-2-2-E 中經過再次純化後，得到 Daidzein 及光譜確定結構的 Genitein。 Table 13. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-(1~4), PMEEE-2-2-E, PMEEE-2-2fh for 96 hrs Conc. (μg/ml） Control. 0. PMEEE-2-1-1. 2.5 5 10 2.5 5 10. PMEEE-2-1-2. MTT assays（%） NBT assays（%） 100.0±1.1. 3.8 ± 0.7. 94.1 ± 1.5*** 77.8 ± 5.2*** 54.3 ± 4.9*** 84.9 ± 3.7*** 49.1 ± 9.8*** 19.1 ± 4.1***. 4.0 ± 1.1 6.1 ± 0.7** 8.7 ± 0.9** 6.0 ± 0.5* 13.8±2.6** Death. IC50 ＝5（μg/ml） PMEEE-2-1-3. 2.5 5 10. PMEEE-2-1-4. 2.5 5 10 5 10 25. PMEEE-2-2-E. 45.8 ± 5.2*** 43.5 ± 0.6*** 17.8 ± 4.3***. 11.6±1.6** 15.4±3.5** Death. IC50＝2.5（μg/ml） 121.4±7.5** 3.3 ± 0.6 120.5±7.8** 4.7 ± 0.8 85.2 ±3.1*** 7.7 ± 1.8* 83.1 ± 2.8*** 6.5 ± 1.5** 58.4 ± 3.8*** 9.9 ± 1.4*** 13.6 ± 3.1*** Death IC50 ＝13.8（μg/ml）. PMEEE-2-2-fh. 5 10 25. 101.1±5.9 88.4 ± 3.2** 44.1 ± 3.1***. 3.7 ± 0.3*** 6.5 ± 1.3** 11.2±1.8***. IC50 ＝23.0（μg/ml） 4. HL-60 cells（2×10 /ml）were treated with PMEEE-2-1-(1~4) and PMEEE-2-2-E(fh) for 96 hrs.Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control..
(59) PMEEE-2-1-2 及 PMEEE-2-2-3 通過管柱層析後，分為五個部分。前 四個部分的皆在 IC50＝20（μg/ml），具有相當的研究價值，但是，很遺 憾的是，本研究後續目前仍在進行中，目前無較多資料。另一部份，在分 離葛雌素的過程中，亦把第二次分離而得的葛雌素前一段分離層，測得其 抗增殖活性亦有不錯的效果。 Table 14. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-1-2,3-(1~5), PreMi for 96 hrs Conc（μg/ml） Control PMEEE-2-1-2.3-1. 0 2.5 5 10. PMEEE-2-1-2.3-2. 2.5 5 10. PMEEE-2-1-2.3-3. 2.5 5 10. PMEEE-2-1-2.3-4. 2.5 5 10. MTT assays（%） NBT assays（%） 100.0±1.1 113.2±3.0*** 103.3±2.5* 97.7 ± 4.6 IC50＝16.6（μg/ml） 89.5 ± 7.6* 62.7 ± 3.1*** 21.6 ± 3.3*** IC50＝6.7（μg/ml） 83.1 ± 5.4** 41.4 ± 6.4*** 22.8 ± 2.4*** IC50＝5（μg/ml） 185.5±6.2 108.1±1.4 42.0 ± 2.9***. 3.8 ± 1.3 1.6 ± 0.6** 2.5 ± 0.5*** 4.0 ± 1.3** 4.0 ± 1.2** 8.0 ± 1.4*** 21.0±1.3*** 13.0±1.2*** 21.8±2.4***. Death 4.4 ± 1.4 6.6 ± 0.2* 8.4 ± 1.2***. IC50＝9.2（μg/ml） PMEEE-2-1-2.2-5. PreMi. 2.5 5 10 5 10 25. 182.5±3.6 167.1±5.1 161.6±0.5 173.1 ± 1.2 126.9 ± 6.1 52.9 ± 2.5*** IC50＝26.0（μg/ml）. 6.0 ± 0.3* 6.6 ± 0.2* 6.9 ± 0.8* 4.2 ± 1.3 8.2 ± 0.3** 16.8±1.7***. HL-60 cells（2×104 /ml）were treated with PMEEE-2-1-2,3-(1-5) ,PreMifor 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. * p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control..
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